研究方法学 枯草芽孢杆菌 生物膜作为小分子生物膜抑制剂表征的模型

摘要

本研究介绍了可重复方法的开发，用于研究生物膜抑制剂及其对生物膜的影响 枯草芽孢杆菌 多细胞生物性

摘要

本研究评估了多种方法，用于分析小分子生物膜抑制剂（如D-氨基酸）对生物膜形成及其抗逆性的影响 枯草芽孢杆菌 生物膜。首先，介绍选择针对生物膜特异性靶点的小分子抑制剂的方法，以区分这些小分子抑制剂对浮游生长的影响与其对生物膜形成的影响。接着，我们关注接种条件如何影响多细胞、漂浮性聚集体的敏感性 B. subtilis 培养物对小分子抑制剂的反应差异。结果表明，诸如D-氨基酸等抑制剂在不同研究中报道的效果差异，主要是由于预培养条件不一致所致。此外，本文介绍了一种近期开发的实验方案，用于评估小分子处理对生物膜抵抗抗菌物质能力的贡献。最后，提供了扫描电子显微镜（SEM）技术，用于分析细胞及其周围胞外基质的三维空间排列情况 枯草芽孢杆菌 生物膜。扫描电镜有助于深入了解三维生物膜结构及其基质纹理。结合本文所述方法，可极大促进在有或无生物膜抑制剂条件下生物膜发育的研究，并有助于阐明这些抑制剂的作用机制。

引言

多细胞细菌群落在自然环境和人为环境中均发挥着重要作用，可能有益，也可能极具危害性。这些多细胞菌落被称为生物膜，其中单个细胞被包裹在自身产生的胞外聚合物基质（EPS）中。EPS 能使细胞牢固地附着于其定植的表面，起到抵御机械和化学作用力的屏障作用，并促进相邻细胞之间的紧密接触，从而有利于细胞间通讯¹。生物膜可被视为一种具有分化的群落，其中细胞通过高度调控且协调有序的过程，来协调群落内部乃至不同物种之间的活动^2-5。从浮游、自由生活的生长模式转变为生物膜状态的过程通常与发育过程相关。一个典型的例子是革兰氏阳性土壤细菌 Bacillus subtilis，因此其非驯化菌株被广泛用作研究生物膜形成发育阶段的可靠模式生物。在这种细菌中，可运动的细胞会自组织形成显著的多细胞结构，以执行特定功能⁴。其中一类细胞为基质生成细胞，可分泌胞外多糖⁶、淀粉样蛋白 TasA^7,8 以及表面疏水性蛋白 BslA^9,10；这些成分均参与 EPS 基质的组装^11-13。

鉴于生物膜在自然环境和人为环境中广泛存在，且可能造成致命性损害，因此迫切需要寻找防止其形成的方法。小分子抑制剂有助于发现参与生物膜形成的新的调控通路、酶和结构蛋白，从而促进对多细胞群体组装这一复杂过程的理解。由于B. subtilis是研究生物膜形成的经典模式生物^14,15，可用于评估各种生物膜抑制剂的作用效果。本研究聚焦于四种基本方法，这些方法对于评价生物膜对小分子抑制剂的响应至关重要。首先，为了确保这些抑制剂的作用靶点具有生物膜特异性，必须将抑制剂对浮游生长的影响与对生物膜形成的影响区分开来。大多数抗菌剂主要靶向细胞的浮游生长阶段，而能够靶向生物膜生活方式的分子则较为罕见。此外，那些不影响浮游生长的分子通常不具有毒性，因而可降低有利于抗生素耐药突变体产生的选择压力¹⁶。例如，当使用D-氨基酸或某些其他干扰细胞壁的分子处理生物膜时，生物膜结构会被破坏或解体，但这些抑制剂对浮游生长的影响较轻微^12,17。相反，许多抗生素会显著抑制浮游生长，但对生物膜形成几乎没有或完全没有影响¹⁷。

其次，建立一个稳定且可重复的实验体系来研究小分子的作用至关重要。我们观察到，小分子抑制剂的活性浓度范围对预培养条件以及用于研究这些小分子抑制剂作用的实验设置较为敏感。已有多种报道，特别是针对B. subtilis的研究，揭示了D-氨基酸抑制菌膜（即漂浮的细菌生物被膜）形成时其有效浓度范围存在差异^12,17-19。本文结果表明，以下因素可解释活性浓度范围的差异：预培养条件（对数生长期^12,17与后期稳定期²⁰）、预培养所用培养基（富集型、非定义型培养基[如LB培养基]与定义型培养基[如谷氨酸钠-甘油培养基，MSgg]）、接种比例，尤其是接种前是否去除预培养培养基。静态菌膜生长温度对本研究中代表性D-氨基酸小分子抑制剂D-亮氨酸的活性范围影响相对较小。

最后，当生物膜经过特定的生物膜抑制剂处理后，需要采用可靠且信息丰富的手段来表征这些抑制剂对生物膜适应性的影响。本文详细描述了两种可独立评估小分子抑制剂作用的方法：（1）评估抑制剂对生物膜菌落内单个细胞及其对抗抗菌剂能力的影响。与游离生长的细菌相比，生物膜中的细胞通常对抗生素具有更强的耐受性^21-23。尽管这一现象由多种因素共同导致，但胞外多糖（EPS）限制抗生素渗透的能力常被视为一个合理的解释²⁴。该方法用于评估已形成的生物膜细胞在接触抗菌物质后的存活情况。（2）评估抑制剂对生物膜菌落结构从宏观到微观尺度的影响。生物膜菌落的特征在于其三维结构以及胞外多糖（EPS）的存在。通过扫描电子显微镜，可从较大尺度（mm）到较小尺度（µm）观察细胞形态、生物膜菌落结构以及EPS的结构特征和丰度变化。

方案

1. 评估小分子抑制剂对浮膜和生物膜菌落形成的影响

1. 制备不含氯化钙和六水合三氯化铁的2倍浓度定义型生物膜诱导MSgg培养基²⁵。过滤除菌后，加入氯化钙。该培养基可直接使用，或避光保存于4 °C备用。
2. 在实验当天配制1倍浓度的MSgg稀释液。
   1. 将2倍浓度MSgg培养基用无菌蒸馏水（用于菌膜）或无菌3%热（80 °C）琼脂（用于生物膜）稀释至1倍浓度，并加入六水合三氯化铁，使其终浓度为50 μM（用于菌膜）或250 µM（用于生物膜）。加入所需浓度的抗生素或小分子抑制剂，充分混匀。例如，为在30 ml培养体系中获得终浓度为0.5 mM的D-亮氨酸以形成菌膜或生物膜，需加入196.6 µl浓度为76.3 mM（10 mg/ml）的D-亮氨酸储备液。
      注：1倍浓度MSgg培养基的最终成分配比见表1。与原始配方²⁵相比，该培养基中苏氨酸浓度为50 µg/ml，且在固体MSgg培养基上培养生物膜菌落时，铁离子浓度提高至原来的2.5倍，以优化菌落的皱褶形态。
3. 琼脂凝固后，在生物安全柜中将固体MSgg平板干燥30–45分钟，随后进行接种。
4. 为筛选干扰菌膜形成机制的特异性抑制剂（图1），需首先排除所用浓度对浮游生长和静置生长产生影响。
   1. 通过测定液体培养物在600 nm处的光密度随时间的变化，绘制简单的生长曲线，以确定浮游生长情况（即液体培养中光密度随时间的增加），每小时测量一次，直至进入稳定生长期。
   2. 为确认所测得的培养物浊度反映的是活菌数量，需在不同时间点取振荡培养物样本，测定浮游生长阶段的菌落形成单位（CFU）数量。
   3. 为评估小分子抑制剂对静置菌膜生长的影响，将接种条件与1.7–1.9节所述相同的24孔细胞培养板在23 °C下孵育3天后，收集细胞并测定CFU。此对照实验应使用缺乏编码胞外基质组分操纵子的菌膜缺陷型菌株（i.e., B. subtilis ΔepsH, ΔtasA）。
      注：该菌株可在静置条件下生长，但与能形成菌膜的野生型菌株不同，其无法上浮至液-气界面——该界面因氧气含量较高而更利于生长²⁶。因此，这种胞外基质和菌膜缺陷型菌株是评估静置条件下生长情况的推荐参照菌株。
      注：以下所述非经典D-氨基酸D-亮氨酸的具体实例中，已排除其在干扰菌膜形成浓度下对浮游生长和静置生长的影响^12,17。测定浮游生长和静置生长的方法已有详细描述¹⁷。

图1. 用于确定稳健实验体系以评估生物膜形成特异性抑制作用的概念性概述。 筛选小分子抑制剂的选择标准，即能够特异性干扰生物膜形成，而对浮游生长无显著影响。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 划线分离 B. subtilis 来自 -80 °C 保存的菌种（10 mL LB 培养物）⁹ 以无菌枪头或接种棒将细胞涂布于含1.5%琼脂的LB平板，进行单菌落分离（细胞浓度为每毫升含20%甘油冷冻保存的菌液）。
6. 30 °C过夜培养。
7. 关键步骤： 为通过非经典D-氨基酸（如D-亮氨酸）实现稳定的菌膜抑制，从LB-1.5%琼脂平板上挑取单菌落，接种于3 ml LB液体培养基中，在37 °C摇床（摇速200 rpm）中振荡培养4小时。接种前，将1.5 ml该预培养液在6,000 × g离心4分钟，小心弃去上清液，将菌体沉淀重悬于1.5 ml生物膜诱导型MSgg培养基中。剩余培养物可丢弃。
   重要提示：为确保系统的稳定性，需在600 nm处测定光密度（OD₆₀₀) 洗涤后起始培养物的光密度值（OD）应在 0.6 至 1.0 之间
8. 在启动培养物生长期间，准备一个12孔细胞培养多孔板，每孔含有3 ml MSgg培养基，不含或含有一系列浓度的小分子抑制剂例如0.3、0.5、1 mM D-亮氨酸¹⁷）。为排除边缘效应，应将不同浓度的位置分布在多孔板的不同区域。或者，使用含有1.5 ml MSgg培养基的24孔细胞培养多孔板。
9. 将3 µl洗涤后的起始培养物（1:1,000稀释）接种至12孔细胞培养多孔板的各孔中。
   注意：较低的稀释比例， 即，1:500 的比例可以使用，这会缩短菌膜的形成时间。
10. 在23 °C下静置培养菌膜三天。在此期间不要移动菌膜，以免影响菌膜最终的表面形态。
11. 使用双目镜并保持光照均匀的条件下拍摄图像。或者，使用高分辨率相机拍摄薄层样品。为避免因光照角度不一致和阴影造成的伪影，应将相机固定在三脚架上，从正上方进行拍摄，并在两侧以45°角使用柔和且大面积的光源。
    注意：一种研究的替代方法 B. subtilis 多细胞性的检测方法是在固体生物膜诱导型MSgg培养基上进行的生物膜菌落实验。与浮膜形成类似，该实验可用于研究生物膜在时空上的动态过程。在确定小分子抑制剂的有效作用范围后，可进一步研究其对生物膜菌落形成的影响。
12. 为培养生物膜菌落，使用模板在干燥的MSgg 1.5%琼脂平板上对称点样1.5 µl未洗涤的预培养液（步骤1.7），每个直径为8.5 cm的培养皿点4滴。点样后静置，待液滴完全吸附至平板表面后再移动。
    注意：该模板有助于在细胞生长区域内实现生物膜菌落的均匀分布。制备模板时，按实际尺寸绘制出整个生长区域，将其划分为相等的扇形区域，并标记中心点。对于直径为8.5 cm的圆形培养皿，此方法对应14 cm²的面积² 到一个生物膜菌落。
13. 在30 °C下孵育平板三天。在此期间，生物膜菌落将发育并形成三维的皱褶结构。
14. 按照步骤1.11进行拍照。

2. 乙醇抗性检测

1. 按照步骤 1.1-1.7 和 1.12-1.14 所述方法培养生物膜。
2. 在 30 °C 下培养 68 小时后，借助剃刀刀片和模板将生物膜菌落切成两个相等的部分。

图 2. 评估生物膜菌落细胞对灭菌剂抗性的实验设计示例。 （A）用于在培养皿上均匀分布生物膜菌落并进行切割的模板。（B）在30 °C下于固体、成分明确的生物膜诱导MSgg培养基上培养68小时的未经处理的野生型生物膜的俯视图。放大图显示了如何将一个生物膜菌落切成两个相等的半片。（C）将两个相等的生物膜半片分别用PBS（对照）或灭菌剂进行相同处理，并按所述方法进行后续操作。比例尺：1 cm。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 用小刮勺小心地将生物膜菌落的每一半从琼脂平板上取下，并转移至含有500 µl磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 ml微量离心管中。如有必要，将平板上残留的细胞刮下，并一同转移至微量离心管中。
   注意：生物膜菌落的后半部分处理方式不同，具体取决于其作为对照组还是用于测试对灭菌剂的抗性。
4. 对照组按照步骤2.3，将生物膜菌落的另一半置于500 µl PBS中孵育。为评估对灭菌剂的抗性，将生物膜菌落的另一半转移至500 µl 50%（v/v）乙醇中。
   注意：可使用次氯酸钠等替代性消毒剂。对于所用的每种消毒剂，均需通过预实验确定其有效浓度及孵育时间。
5. 将生物膜菌落于室温下在实验台放置孵育10分钟。
6. 将生物膜菌落以18,000 x g离心5分钟，并 仔细地 用移液器吸除上清液。加入 300 µl PBS。
7. 使用超声波破碎仪的微探头对细胞进行温和超声处理（振幅10%，脉冲5秒）。
   注意：超声能量必须足以分散生物膜聚集体，但过强的超声可能导致细胞裂解。使用光学显微镜预先确认所用超声能量不会引起细胞裂解，且所有聚集体均已完全分散。
8. 加入700 µl PBS至终体积1 ml。进行系列稀释（至10⁻¹）^-7在PBS中稀释，并用无菌玻璃珠将100 µl的3个稀释度分别涂布于LB-1.5%琼脂平板上。
   注意：最佳接种稀释度应在预实验中确定，因为这取决于目标生物膜菌落中的细胞数量以及细胞对灭菌剂处理的存活率。
9. 将平板在30 °C下孵育过夜，计数菌落形成单位（CFU）并确定CFU/ml。根据每个半生物膜菌落的最终CFU/ml，计算存活率百分比。
   注意：若按照所述方法进行操作与分析，对照组生物膜菌落的两半之间，以及未处理与乙醇处理的未处理生物膜菌落两半之间的活细胞计数差异应低于10%，分别验证菌落的对称性或抗性。 alternatively，结果也可用总CFU表示。对照组和未处理生物膜菌落的细胞计数应保持在同一数量级。相比之下，经小分子处理的生物膜菌落中乙醇处理半边的细胞计数预期至少下降两个数量级，方可认为其对灭菌剂的敏感性增加。

3. 扫描电子显微镜用生物膜菌落样品制备

1. 按照步骤 1.1–1.7 和 1.12–1.14 所述方法培养生物膜菌落。
2. 在 100 mM 二甲胂酸钠、5 mM 氯化钙缓冲液（pH 7.3）中配制新鲜的 2%（v/v）戊二醛和 3%（v/v）多聚甲醛固定液。每 8.5 cm 直径的培养皿准备 5 ml 固定液。
   注意：戊二醛和多聚甲醛具有危害性。应在通风橱内佩戴安全防护设备操作。废弃溶液及受污染材料应作为危险废物处理。
3. 小心地将固定液加入生物膜菌落中，避免直接滴加在生物膜表面。
   注意：由于生物膜菌落具有疏水性，菌落会缓慢从琼脂表面脱离并开始漂浮。
4. 用 Parafilm 封口膜小心密封培养皿。室温下置于旋转摇床上固定 2 小时，随后转移至 4 °C 过夜。
5. 次日，使用连接真空泵的巴斯德玻璃吸管小心吸除液体。
6. 小心加入 10 ml 100 mM 二甲胂酸钠、5 mM 氯化钙缓冲液洗涤生物膜，孵育 5 分钟。用巴斯德玻璃吸管从培养皿角落轻轻吸除液体，避免损伤生物膜，再通过轻柔吹打加入新鲜洗涤液。重复此步骤一次。
7. 对生物膜菌落进行脱水处理，按以下步骤依次进行：ddH₂O 中 2 次，每次 5 分钟；30% 乙醇中 2 次，每次 20 分钟；50% 乙醇中 2 次，每次 20 分钟；70% 乙醇中 2 次，每次 20 分钟；96% 乙醇中 2 次，每次 20 分钟；100% 乙醇中 2 次，每次 30 分钟。
   1. 每 8.5 cm 直径的培养皿在每一步骤中加入 15 ml 液体，并在每次孵育后小心移除液体。
8. 采用以下两种方法之一对乙醇中的样品进行干燥。
   1. 乙醇中空气干燥法：
      1. 将一张直径为 9 cm 的纤维素滤纸剪成四等份。将其中一份短暂浸入 100% 乙醇中，然后小心地将一个漂浮的生物膜菌落转移至该滤纸上。将湿润的滤纸放入内衬滤纸的培养皿中，盖上皿盖，在通风橱中静置过夜使生物膜菌落自然干燥。
   2. 使用二氧化碳（CO₂）作为过渡流体进行临界点干燥（CP 干燥）：
      1. 将临界点干燥仪的样品室填充 75% 体积的 100% 乙醇。将样品转移至样品架中，每个样品置于独立腔室。如有需要，可用剪刀将生物膜剪成更小的片段。所有操作过程中保持样品始终浸没于乙醇中。随后将样品架放入样品室并紧密关闭。
      2. 将样品室冷却至 7 °C 并启动搅拌。将液态 CO₂ 完全充满样品室。在 7 分钟的孵育时间内，使乙醇与 CO₂ 充分混合。随后排出 25% 的混合液。
         注意：切勿将样品室排空至样品液面以下。
      3. 重复步骤 3.8.2.2 四次。
      4. 仅以 5 分钟孵育时间重复步骤 3.8.2.2 五次。最终应实现乙醇被 CO₂ 完全置换。
      5. 在最后一次置换时，仅排出 5% 的腔室内容物。关闭搅拌和冷却系统，开始加热样品室至 42 °C。当温度达到 31.1 °C、压力达到 73.9 bar 时，液态 CO₂ 达到临界点，此时气相密度与溶剂液相密度相同²⁷。温度升至 42 °C 后，继续孵育 10 分钟。此时样品室内的 CO₂ 处于超临界气态。
         注意：需持续监测样品室压力。在 42 °C 时，压力不得超过 120 bar。
      6. 在持续加热的同时缓慢释放气体。此过程可使样品保持在 CO₂ 气相中，避免因液体表面张力导致样品形貌变形。通过微调控制流量计的计量阀，将流量设定为 5 L/hr。待样品室内压力完全释放后，打开样品室，小心地从样品架上取出样品。
9. 在电子显微镜样品台表面贴上导电碳胶带。使用镊子小心地将生物膜菌落转移至样品台上。使用碳胶带在每个菌落与样品台之间建立细小的连接桥，这对于在电子束照射下消除电荷积累至关重要。此阶段需格外小心处理生物膜菌落，因其极为脆弱。将样品置于干燥器中至少保存 24 小时，或直至进行观察。
10. 在使用扫描电子显微镜观察当天，将生物膜菌落在金-钯溅射仪中以 60° 角度溅射镀膜 2 分钟。重复此步骤两次，每次之间将样品旋转 120°。最后，从正上方对样品进行一次 3 分钟的溅射镀膜。所形成的 20 nm 厚金-钯薄膜可提高样品导电性，并增强扫描电镜成像时的对比度。
11. 将样品保存在干燥器中，以防止样品重新吸水²⁸，直至进行扫描电子显微镜成像^29,30。

结果

浮膜实验是研究高度调控且动态过程的一种方法 B. subtilis 多细胞性。此外，利用单个细胞培养多孔板，可在一次实验中通过表膜检测法测试多种预培养条件或小分子浓度。然而 B. subtilis 成膜形成对预培养条件敏感（例如，前培养基的培养基类型及其生长阶段）、接种比例以及前培养基的去除。因此，我们首先筛选了一种能够重现D-亮氨酸抑制菌膜形成的实验条件。我们的结果表明，当细胞在未定义的丰富LB培养基中于37 °C振荡培养4小时至对数中期生长阶段（单菌落接种于3 ml LB培养基），随后离心并重悬于定义明确的MSgg培养基中，再以1:1,000的比例接种时，可实现可重复的D-亮氨酸对菌膜形成的抑制图3A）。当细胞在MSgg培养基中生长至对数中期时（将单菌落接种于1 ml LB培养基中培养2小时，按1:100比例重新稀释至3 ml MSgg培养基中，于37 °C、200 rpm振荡培养5小时），去除预培养培养基对D-亮氨酸活性无显著影响。而当细胞生长至稳定期（将单菌落接种于1 ml LB培养基中培养2小时，按1:100比例重新稀释至3 ml MSgg...

讨论

Bacillus subtilis 在液体（菌膜）和固体培养基（菌落）中均能形成坚固且高度有序的生物膜。因此，它是用于表征特定生物膜抑制剂作用机制的理想模式生物。在固体培养基上，细胞会形成具有明显特征的多细胞结构，例如从中心向边缘辐射的皱褶，而这些特征在菌膜中并不明显。因此，菌膜和菌落是研究 B. subtilis 多细胞性的互补体系。

本研究的目标是建立一种用于抑制生物膜（菌膜和菌落）的 B. subtilis 模型系统。为确保生物膜干扰实验的可重复性，多个步骤至关重要。首要的关键步骤是确认所观察到的对生物膜形成的抑制效应并非源于测试化合物对浮游生活方式细菌的普遍毒性。可通过比较特定浓度的小分子抑制剂对生物膜形成的相对抑制作用与其对浮游生长的影响来评估这一点。若该分子对生物膜发育的抑制作用显著强于对浮游生长的作用，则有助于识别出特异性参与生物膜发育的靶向机制。此外，本研究所述内容表明，前培养条件对菌膜的形成及其对小分子的敏感性具有重要影响。在表征小分子作用之前，应首先确立可重复且稳定的实验条件（例如，菌膜生长...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB培养基，Lennox	Difco	240230
细菌琼脂	Difco	214010
磷酸二氢钾	Sigma，136.09 g/mol	P0662-500G
磷酸氢二钾	Fisher Scientific，174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-吗啉代)丙磺酸	Fisher Scientific，209.27 g/mol	BP308-500
六水合氯化镁	Merck，203.30 g/mol	1.05833.0250
无水氯化钙	J.T. Baker，110.98 g/mol	1311-01
四水合氯化锰(II)	Sigma，197.91 g/mol	31422-250G-R
六水合氯化铁(III)	Sigma，270.30 g/mol	F2877-500G
无水氯化锌	Acros Organics，136.29 g/mol	424592500
盐酸硫胺	Sigma，337.27 g/mol	T1270-100G
L-色氨酸	Fisher Scientific，204.1 g/mol	BP395-100
L-苯丙氨酸	Sigma，165.19 g/mol	P5482-100G
L-苏氨酸	Sigma，119.12 g/mol	T8625-100G
无水甘油	Bio-Lab Itd	712022300
L-谷氨酸单钠盐水合物	Sigma，169.11 g/mol	G1626-1KG
D-亮氨酸	Sigma，169.11 g/mol	855448-10G
无水乙醇	Gadot	830000054
剃须刀片	Eddison	NA
圆形纤维素滤纸	Whatman，90 mm	1001-090
戊二醛	EMS (Electron Microscopy Science)，水中25%	16220
多聚甲醛	EMS，水中16%	15710
二甲胂酸钠	Merck，214.05 g/mol	8.2067
二水合氯化钙	Merck，147.02 g/mol	1172113
铝制样品台（带槽头）	EMS	75230
碳导电胶带	EMS	77825-12
37 °C 摇床	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
离心机	Eppendorf 台式离心机 5424	NA
数字超声波破碎仪，型号 250，配双阶梯微探头	Branson	NA
30 °C 培养箱	Binder	NA
23 °C 培养箱	Binder	NA
过滤系统，500 ml，聚苯乙烯材质	Cornig Incorporated	NA
旋转摇床 - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 溅射镀膜仪	Edwards	NA
CPD 030 临界点干燥仪	BAL-TEC	NA
环境扫描电子显微镜	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA