利用连续熏蒸培养法测定土壤中的活性有机碳

摘要

不稳定的有机碳（LOC）和潜在碳周转速率是反映土壤养分循环过程变化的敏感指标。本文详细介绍了一种基于对土壤进行系列熏蒸-培养循环，并利用培养期间积累的CO₂来估算这些参数的方法。

摘要

管理措施和环境变化可改变土壤养分和碳循环过程。土壤活性有机碳作为一种易于分解的碳库，对干扰高度敏感，同时也是土壤微生物的主要底物，对养分循环具有基础性作用。由于这些特性，活性有机碳（LOC）已被确定为土壤健康的指示参数。量化LOC的周转速率也有助于理解土壤养分循环过程的变化。目前已开发出一种连续熏蒸培养法，用于估算土壤LOC及其潜在碳周转速率。该方法需要对土壤样品进行多次熏蒸处理，并在10天的培养期内，测定一系列熏蒸-培养周期中释放的CO₂-C。然后通过负指数模型，从累积的CO₂量外推得出活性有机碳含量及潜在碳周转速率。本文详细描述了该方法的操作步骤。

引言

由于活性有机碳（LOC）在碳（C）和养分循环中的关键作用及其对土壤变化的敏感性，测定土壤LOC是评估土壤有机质质量的重要指标。森林和农业生态系统在很大程度上依赖于土壤有机质中养分的矿化作用作为养分来源。管理措施可改变土壤有机碳的储量及其周转速率，从而影响养分供应¹。土壤有机碳主要由两种组分构成：一种是难降解碳，其周转速率长达数千年；另一种是活性有机碳（LOC），其周转速率从数周至数年不等^2,3,4。土壤活性碳包括易于分解的底物，如微生物生物量碳、植物根际分泌物中的低分子量化合物（氨基酸、简单碳水化合物）以及植物残体分解产生的副产物和淋溶物^1,4,5。由于土壤活性碳易于分解，因此对扰动或改变土壤的管理措施和自然现象高度敏感⁶。土壤活性碳是土壤微生物分解有机质过程中的主要能量来源⁷。因此，与稳定的土壤有机碳形态相比，LOC对养分循环的影响更为显著⁸。此外，在LOC引发的激发效应促进下，土壤微生物还主导了难降解土壤有机质分解过程中大部分的异养呼吸作用^9,10,11。这种呼吸作用在全球碳循环中具有重要作用，因为土壤有机碳储量约为大气碳储量的两倍¹¹。

由于土壤活性有机碳（LOC）在陆地生态系统中的重要性，已发展出多种方法用于估算土壤LOC。这些方法可大致分为三类：物理法、化学法和生物化学法。密度梯度分离法属于物理方法，通过该方法可将土壤有机碳分离为重质或轻质组分，或分离为粗颗粒有机碳和细颗粒有机碳^12,13,14,15。分离方法操作相对简便，但结果往往不够一致，因为这些组分受土壤类型、矿物组成、植物残体的大小与密度以及土壤团聚体稳定性的变化影响较大^13,15。此外，分离方法仅能提供关于LOC的定量信息¹⁵。

目前有多种化学方法可用于轻组有机碳（LOC）的测定。通过水相提取有机碳的方法操作相对简便，且这些方法通常能提供易于重复的结果。然而，这些提取方法并未涵盖微生物可利用底物的全部范围¹⁵。已有多种用于土壤有机碳化学分级的氧化方法被开发出来。氧化法的优点在于能够表征活性有机碳的数量和质量，尽管某些方法需要使用危险化学品，且不同方法在结果重复性方面存在差异¹⁵。酸水解提取法是另一种可用于测定LOC数量和质量的化学分级方法，但该方法的结果难以用于解释其生物学特性^13,15。

已开发出用于解释土壤活性有机碳（LOC）的生化方法。活性有机碳可通过微生物在呼吸测定中释放的CO₂进行测定。这些测定可提供真实可矿化有机物的估算值，但在测定过程中通常仅有最易分解的化合物被矿化¹⁵。通过熏蒸-培养法¹⁶和熏蒸-提取法¹⁷测定的土壤微生物生物量碳已被用于推断LOC。然而，这些方法提供的是微生物生物量中的碳含量，而非LOC本身。这两种熏蒸方法均需从熏蒸土壤的测定值中减去未熏蒸土壤的对应值，以确定微生物生物量碳；但有研究指出，不进行此项减法所获得的数值，除微生物生物量外，还可反映碳的活性有机组分¹⁸。

用于测定易降解有机碳（LOC）的顺序熏蒸-培养（SFI）方法¹³是一种生化方法，源自用于测定土壤微生物生物量碳的熏蒸-培养方法¹⁶。相较于其他估算LOC的方法，SFI方法具有一些优势。该方法的概念基础在于，LOC是可被微生物降解并调控微生物生长的碳，并且在物理上可接触、化学上可被土壤微生物降解。在田间条件下，微生物生长通常受到碳有效性、养分有效性、可利用孔隙空间和/或捕食作用的限制。这些因素在熏蒸后几乎被完全消除，从而为微生物生长创造了无障碍条件。该方法的培养期间不移除任何养分。经过多次熏蒸和培养循环后，微生物生长逐渐受限于碳的数量和质量（活性）¹³。在培养循环过程中累积释放的CO₂可通过简单的负指数模型外推计算LOC^11,13,19。潜在的碳周转速率也可由该指数模型的斜率推导得出，因此SFI方法相较于大多数其他LOC测定方法，具有同时估算LOC浓度及其潜在周转速率的优势¹¹。对于其他方法，只有使用¹⁴C等示踪剂才能确定LOC的潜在周转速率¹³。因此，SFI方法是一种相对简单且经济的技术，可用于同时测定LOC含量及其潜在周转速率。

方案

1. 采集土壤以获取能代表实验区域及实验单元内条件的样品²⁰

1. 识别样地属性的任何差异，例如坡度和土壤属性（包括质地、容重、pH、有机层深度和/或养分浓度）。识别样方内植被类型的差异。利用已知或已发表的样地属性变异系数估算值，估计达到预设相对误差所需的样本数量。
2. 根据样地和实验单元条件，使用土钻或其他采样设备按特定模式采集土壤样本。
   1. 对于均质条件，在每个实验单元内采用随机采样模式。
      1. 将采样点分配在实验单元内的完全随机位置，或呈之字形排列。
      2. 在每个随机点或之字形排列的点位采集土壤样本。使用土钻或其他采样设备挖掘土壤样本前，先将矿质土壤表面的有机物质刷开。
         注：SFI 方法的建立基于 Oa 层及更深层的土壤发生层¹³。若需使用 SFI 方法检测 Oa 层以上的发生层，尚需进一步测试验证。
      3. 将同一实验单元内采集的所有样本合并至一个容器中，并在容器内对各单个样本进行物理混合，为每个实验单元制备一个混合样本。
   2. 对于更为常见的异质性条件，在每个实验单元内采用系统采样模式。
      1. 沿每个实验单元中心的样线采集土壤样本，使样线内各采样点之间的距离小于表征实验单元内变异所需的间距。
      2. 在每个实验单元内沿多条样线采集土壤样本，对于相对较大的实验单元或具有多个变异来源的实验单元，样线应形成网格状分布。
      3. 将每条样线上采集的所有样本合并至一个容器中，并在容器内对各单个样本进行物理混合，为每条样线制备一个混合样本。

2. 准备SFI测定用土壤

1. 在野外采集样品后，立即将样品放入装有冰袋的冷藏箱中。
2. 到达样品储存设施后，将样品置于4 °C冰箱中，直至进行样品制备和SFI实验操作。
3. 将土壤样品通过6.4 mm × 6.4 mm孔径的筛网过筛。每次处理完一个样品后，用水清洗筛网，以防止样品间交叉污染。
4. 对每个样品称取三个100 g的子样品，分别放入250 ml烧杯中。用Parafilm封口膜覆盖每个烧杯，并在25 °C室温下静置10天。

3. 取样品用于烘干重量测定

1. 在土壤样品预培养10天结束后，移除每个样品上的封口膜。
2. 记录铝制称量舟的重量。从所有样品中各取1 g土壤，置于称量舟中。
3. 记录湿土壤与称量舟的总重量。
4. 将装有土壤的称量舟放入105 °C的烘箱中。待样品达到恒重（通常需48小时）后，记录称量舟与土壤的重量。
5. 从湿土壤和干土壤与称量舟的总重量中减去称量舟的重量，得到湿土壤和干土壤的重量。通过将干土壤重量除以湿土壤重量，计算干重与湿重土壤的比值。

4. 熏蒸土壤样品

1. 在至少两个（根据样品数量可能需要更多）10.5 L 的玻璃真空干燥器底部放置湿润的纸巾，干燥器内需配有瓷板。
2. 对所有样品，将 30 g 土壤分别称量至三个独立的玻璃小瓶中。使用足够大以容纳 40 g 土壤且口径足够窄可放入 40 mm 开口的玻璃小瓶，前提是采用第 5 节所述的培养容器设计。
3. 若使用标签纸标识每个 30 g 土壤亚样品，请使用铅笔书写，因为熏蒸会降解墨水。
4. 将每份土壤样品的三个 30 g 亚样品中的两个放入真空干燥器中进行熏蒸，另一个亚样品放入不进行熏蒸的真空干燥器中。
5. 在 100 ml 烧杯中加入一层沸石，其量足以覆盖烧杯底部。
6. 向装有沸石层的 100 ml 烧杯中倒入 50 ml 无乙醇氯仿（CHCl₃）。将装有沸石和 CHCl₃ 的 100 ml 烧杯置于装有 30 g 土壤亚样品的干燥器中央。此步骤应在通风橱中进行。
7. 在通风橱中，使用真空泵使 CHCl₃ 沸腾，以对每份土壤样品的两组亚样品进行熏蒸。
   1. 通过真空管路将真空泵连接至真空干燥器。启动真空泵，观察 CHCl₃ 开始沸腾。
   2. 让 CHCl₃ 沸腾 30 秒，然后断开干燥器上的真空管路，使空气重新进入干燥器。此步骤有助于 CHCl₃ 气体进入土壤样品中。重复该过程两次。
   3. 进行第四次也是最后一次沸腾，使 CHCl₃ 沸腾 2 分钟。
   4. 在真空仍运行的情况下，关闭真空干燥器的密封盖，以维持干燥器内的真空状态。关闭真空泵，并将真空管路从干燥器上断开。
8. 通过盖上盖子并密封真空塞，将未熏蒸样品所在的干燥器密封。将干燥器（包括熏蒸和未熏蒸的）置于黑暗环境（如柜子内）中 24 小时。切勿对装有未熏蒸样品的干燥器重复 4.7 小节中的真空操作。

5. 组装土壤样品培养容器

1. 将一根15 cm长的玻璃棒穿过中心钻有孔的10号橡胶塞。玻璃棒的直径应足以紧密地插入孔中。
2. 用与熏蒸和未熏蒸子样品编号相对应的标识，标记0.5 L半透明广口聚丙烯瓶。

6. 在通风橱下从干燥器中抽除氯仿

1. 打开真空干燥器的塞子，使空气流入干燥器内。取下干燥器的盖子，将样品和湿毛巾从干燥器中取出。
2. 使用真空泵从土壤样品中抽除 CHCl₃ 气体。
   1. 将盖子盖上干燥器。用真空管将干燥器连接至真空泵。
   2. 启动真空泵，运行五分钟。随后将真空管从干燥器上断开，使空气流入干燥器内。
   3. 重复步骤 6.3.2 四次。

7. 将每个土壤子样品转移至培养容器中（图1），进行为期10天的培养

1. 用移液器将 1 ml 去离子水加入孵育容器中。使用橡皮筋将一个空玻璃小瓶连接到从 10 号塞子伸出的玻璃棒上，玻璃小瓶的开口端应朝向塞子的底部。玻璃小瓶的尺寸应足以容纳最多 40 ml 液体。
2. 将含有 30 g 土壤子样品的瓶子放入孵育容器中。
3. 从原始土壤样品中取 1 g 未熏蒸土壤，分别加入其对应的各份子样品（熏蒸和未熏蒸）中作为接种物。
4. 用移液器将 1 ml 2 M NaOH 加入连接在塞子/玻璃棒上的玻璃小瓶中。将塞子/玻璃棒压入孵育容器顶部，并用 Parafilm 密封孵育容器的开口。
5. 制备一个不含土壤的孵育容器。共组装三至五个无土壤的孵育容器。
   注意：用于滴定无土壤容器样品的酸量对于确定孵育期间 CO₂ 矿化量至关重要，该步骤将在下文第 9.3 小节中描述。因此，设置多个无土壤容器是为了防止因某个无土壤容器样品处理或滴定错误，导致所有样品的 CO₂ 矿化计算出现偏差。来自无土壤容器样品滴定所用的酸量数值应相近；若某个无土壤容器样品的酸量数值显著不同，可能是样品处理或滴定操作有误所致。
   1. 按照第 5 节的步骤组装孵育容器。
   2. 按照 7.1 和 7.4 的步骤操作。
6. 将所有孵育容器置于 25 °C 的避光储存区域。所有孵育容器在该区域中放置 10 天。

8. 对每个子样品进行滴定，以量化培养期间微生物呼吸作用产生的 CO₂

1. 从孵育容器中取出装有 2 M NaOH 的玻璃小瓶。
2. 用移液器将 2 ml 的 1 M BaCl₂ 加入装有 2 M NaOH 的玻璃小瓶中。
3. 用移液器或滴管向装有 BaCl₂ 和 NaOH 混合液的玻璃小瓶中加入一滴酚酞（C₂₀H₁₄O₄）。将磁力搅拌子放入玻璃小瓶中，并将小瓶置于搅拌器上。
4. 开启搅拌器，用滴定管缓慢加入 0.1 N HCl，直至玻璃小瓶中混合液的红色变为无色。
5. 记录使玻璃小瓶中混合液变色所需的 HCl 体积。

9. 根据首次熏蒸-培养周期期间收集的数据确定微生物生物量碳 C^16,21,22

1. 通过将每个子样品的湿润重量乘以第3.8步中获得的干重与湿重之比，确定各子样品中土壤的干重。
2. 测定用于滴定无土壤培养容器的 HCl 平均用量。
3. 计算 CO₂ 在10天孵育期间使用以下公式计算矿化程度：
   
   其中 CO₂ = CO₂ 在10天培养期间发生矿化
   NS = 用于滴定无土壤培养容器中样品的酸
   S = 用于滴定孵育容器中含土壤样品的酸
   M = HCl 的摩尔浓度
   E = 6，当量重量
   W = 培养容器中土壤的干重
4. 使用以下公式计算微生物生物量碳：
   
   其中，BioC = 微生物生物量碳
   F = CO₂ 经熏蒸土壤子样品中矿化
   NF = CO₂ 未熏蒸土壤子样品中矿化
   K = 微生物生物量碳矿化为CO₂的比例₂
   1. 通过直接测量确定 K 的值 ¹⁴土壤的初步测试或已发表数值中的碳矿化作用²²该检测中，K 值通常采用 0.45²³.
5. 通过重复第4至8步七次，对在首次熏蒸-培养循环中经过熏蒸处理的土壤子样品进行连续的熏蒸与培养循环。

10. 通过八次熏蒸和培养碳循环过程中矿化的 CO₂ 测定活性碳和潜在碳周转速率

1. 使用以下公式计算每次熏蒸后向样品中添加的土壤接种物的校正因子：
   
   其中 IC = 接种物的校正因子
   C' = 非熏蒸亚样品在首次10天培养期间释放的 CO₂ 量
   r = 第一次熏蒸培养周期中接种土壤与熏蒸土壤的质量比
   C_t = 培养周期（1, 2 … 8），当 t = 1 时，C_t-1 = 0
2. 使用以下公式估算每个培养周期中每个亚样品释放的 CO₂ 量：
   
   其中 Ct = 培养期间释放的 CO₂ 量
   NS = 无土培养容器中样品滴定所用酸量
   S = 含土培养容器中样品滴定所用酸量
   IC = 接种物的校正因子（由步骤 10.1 确定）
   E = 6，当量重量
   W = 培养容器中土壤的干重
3. 通过非线性回归推导易降解有机碳。
   1. 建立一个电子表格，其中包含每个样品的标识符、培养周期编号（1, 2 … 8）以及培养期间释放的 CO₂ 量（由步骤 10.2 推导得出）。
   2. 使用具备非线性回归功能的软件，将以下模型拟合至数据集：
      
      其中 Csum = 八个培养周期中释放的 CO₂ 总量
      LOC = 土壤易降解有机碳
      k = 潜在周转时间
      t = 培养周期（1, 2 … 8）
4. 将步骤 10.3.2 中得出的潜在周转时间转换为天数：由于培养周期为 10 天，需将 k 的倒数乘以 10。

结果

SFI 方法已如本文所述，被用于在美国东南部开展的一系列实验中^24,25,26,27。这些实验共同涵盖了多种植被类型，包括火炬松（Pinus taeda L.）、柳枝稷（Panicum virgatum L.）、美洲黑杨（Populus deltoides Bartram ex Marsh.）和大豆（Glycine max L. Merr.）。在所有研究中，该方法均能灵敏地检测出施肥处理和耕作方式在活性有机碳（LOC）和/或潜在碳周转速率上的差异。本系列研究中报告的 LOC 及潜在周转速率范围存在重叠（图 2）。这些研究中 LOC 范围的差异突显了 SFI 方法在检测活性碳及潜在碳周转差异方面的灵敏性。在所有植被类型中，火炬松与柳枝稷间作系统表现出最大的 LOC 范围；该植被类型的研究涵盖了相对于其他植被类型更为广泛的立地条件。研究样地在土壤类型以及火炬松上层林分年龄（从幼龄到轮伐期末期）方面存在差异。林分年龄的时间序列可能在此处所列植被类型中造...

讨论

SFI 方法是一种有效的检测手段，可用于评估不同管理措施（如施肥、耕作、植被控制和收获方式）及土壤条件下土壤活性有机碳（LOC）含量和潜在碳周转速率差异的实验方案。土壤活性有机碳含量和碳周转速率可用于理解养分循环的变化。SFI 方法还可通过首次熏蒸-培养过程测定微生物生物量碳。能够同时测定土壤活性有机碳、碳周转速率和微生物生物量碳，使 SFI 方法成为一种相对经济高效的分析方法。

在采用SFI方法的同时测定其他土壤参数，有助于更全面地理解土壤活性碳（LOC）及其相关变量变化对养分循环的影响。测定土壤总碳浓度可用于确定土壤活性碳库容相对于总碳的变化²⁹。检测土壤酶活性有助于理解微生物对易利用碳底物的利用过程，从而揭示土壤养分形态和含量的变化机制。例如，脱氢酶在有机质降解过程中发挥关键作用，是反映整体微生物活性的有效指标³⁰。脲酶和磷酸酶是与养分循环相关的酶类实例，因其分别与氮素和磷素的微生物转化过程密切相关^31,32。

SFI 方法的操作步骤存在多种变异，熏蒸-培...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
土壤取样钻具套装	JMC	PN039	市面上还可提供多家其他品牌的冲压式取土钻具
帕拉菲姆封口膜（Parafilm）	Curwood	PM999
铝制称量舟	Fisherbrand	08-732-103
通用型干燥烘箱	Fisher Scientific	15-103-0511	市面上还可提供多家其他品牌的通用型实验室烘箱
10.5 L 真空干燥器	Corning	3121-250
玻璃闪烁瓶	Wheaton	968560
带螺纹玻璃瓶，41 ml	Fisherbrand	03-339-21N
氯仿（以戊烯稳定化）	Sigma-Aldrich	67-66-3
沸石	Fisher Scientific	S25201
玻璃棒	Fisherbrand	S63449
10 号橡胶塞	Fisherbrand	14-130P	橡胶塞可购买实心塞后在中心打孔以安装玻璃棒，也可直接购买带孔橡胶塞用于插入玻璃棒
广口聚丙烯共聚物（PPCO）瓶，0.5 L	ThermoScientific	3121050016
氢氧化钠，试剂级	Sigma-Aldrich	S5881
氯化钡	Sigma-Aldrich	202738
酚酞指示剂	Fisher Scientific	S25466
盐酸溶液，0.1 N	Fisher Scientific	SA54-4