通过核糖体间隔区PCR（RS-PCR）对Staphylococcus aureus进行基因分型

摘要

本研究中，核糖体间隔区PCR（RS-PCR）与微型电泳系统结合，作为一种快速、高分辨率且成本适中的方法，可用于高通量的金黄色葡萄球菌（S. aureus）基因分型。

摘要

核糖体间隔区PCR（RS-PCR）是一种高分辨力且稳健的基因分型方法 S. aureus 可在中等成本下实现高通量，因此适用于常规用途。为获得最佳分辨率、数据评估与数据管理效果，需配合使用微型电泳系统。结合该电泳系统及实验室自主开发的软件（可在此处免费获取），可实现条带模式向基因型指派的标准化与简便化。DNA提取操作简单（煮沸法提取），反应体系构建便捷，且可在任意标准PCR仪上运行。PCR扩增程序常规，仅需延长升降温过渡时间与延伸时间。相较于 spa 分型和多位点序列分型（MLST）相比，RS-PCR无需DNA测序，从而显著简化了分析流程，并实现了高通量检测。此外，该方法对牛源菌株具有较高的分辨能力。 S. aureus 至少与……一样好 spa 分型效果优于MLST或脉冲场凝胶电泳（PFGE）。目前，RS-PCR数据库共包含141种基因型及其变异型。该方法与毒力基因模式、传染性及致病性高度相关 S. aureus 参与牛乳腺炎的菌株。 S. aureus 基因型B（GTB）具有传染性，可导致牛群出现健康问题，给瑞士及其他欧洲国家带来巨大的经济损失。在瑞士发现的其他所有基因型仅感染个体奶牛或乳腺四分之一部分。通过RS-PCR进行基因分型，可对病原体的流行病学特征及致病潜力进行可靠预测。 S. aureus 参与牛乳腺内感染（IMI）的病原体检测，是临床兽医学中的两个关键因素。鉴于该方法具有上述优势，加之成本适中、样本通量高，本文旨在提供一份详细的分步操作指南，以帮助便捷地建立和开展用于基因分型的RS-PCR技术 S. aureus 在其他实验室中。

引言

金黄色葡萄球菌 (S. aureus) 被认为是全球范围内引起牛乳腺内感染（IMI）的最重要病原体 ¹Fournier 的研究 等 ² 在瑞士奶牛中得到证实，以及Cosandey的研究 等 ³ 和 Boss 等 ⁴ 在12个欧洲国家的奶牛中 S. aureus 从牛乳腺炎分离的菌株为遗传异质性群体。通过16S-23S rRNA间隔区（RS-PCR）的PCR扩增，在101株流行病学上独立的分离株中最初检测到17种基因型 ²基因型B和基因型C（GTC）最为常见，占80%，而其他15种基因型（GTs）出现频率较低，每种仅占所有分离株的1%至4%。在欧洲层面 ³GTB、GTC、GTF、GTI 和 GTR 是最重要的基因型，占所有分析菌株（n = 456）的 76%。GTB 主要分布于中欧地区，而其他基因型则广泛传播。其余 24% 的菌株包含 41 种基因型，其中许多仅被观察到一次。

Fournier 等²、Cosandey 等³ 以及 Graber 等⁵ 的研究进一步表明，基因型与其毒力基因模式高度相关，无论是在瑞士层面还是欧洲层面均如此。这些研究还揭示了S. aureus GTB、GTC 与其他基因型之间在乳房内感染（IMI）流行率上存在巨大差异^2,5：以 GTB 为例，一个牛群中高达 87% 的奶牛都感染了该基因型；然而对于 GTC 及其他基因型，每个牛群中仅发现 1 至 2 头奶牛发生 IMI。

S. aureus 引起的乳房炎通常会导致相应乳腺组织发炎，并引起乳汁中炎性细胞数量增加。因此，乳汁体细胞数（SCC）——大多数国家衡量乳品质量的关键指标——会升高，从而导致牛奶价格下降，甚至停止收奶。

除了Fournier的RS-PCR 等 ²，已有其他分型方法用于对牛源性菌株进行亚型分类 S. aureus ^8-11两种常见的包括 spa 分型 ¹² 多位点序列分型（MLST） ¹³前者基于对葡萄球菌可变间隔区的DNA测序 spa 编码蛋白A的基因，而后者需要对7个看家基因进行测序。这意味着一种 ¹² 以及七次 PCR ¹³，分别需要进行扩增子纯化、测序反应，并使用特定设备进行分析。与RS-PCR相比，这些方法在实验室中需要额外耗费大量工作，导致样本通量低且成本高。其中，PFGE的通量尤其低。考虑到这些方法对牛源菌株的分辨能力 S. aureus，RS-PCR 至少与 spa 分型 ⁴ 优于MLST ⁴ 或脉冲场凝胶电泳（PFGE） ¹⁵.

包括二元分型¹³在内的所有这些方法在深入理解由S. aureus引起的牛乳腺炎的发病机制方面已显示出其有效性，但由于存在上述限制，它们在大规模临床研究中的适用性较低。此外，Fournier et al.²所描述的通过RS-PCR进行的基因分型，能够可靠地预测参与牛乳腺炎的S. aureus的流行病学潜力和致病潜力，这两项指标在临床兽医学中具有关键意义。

方案

1. 金黄色葡萄球菌 分离株

1. 在含5%羊血的哥伦比亚琼脂平板（BA）上，涂布10 µl金黄色葡萄球菌（S. aureus）储备培养物，或挑取选择性培养基上生长的一个单菌落进行涂布。
2. 于37 °C有氧条件下孵育18小时至24小时。

2. DNA 提取

1. 配制含有10 mM Tris-HCl和10 mM Na₂EDTA、pH 8.5的TEL缓冲液。分装后于121 °C高压灭菌15分钟。
2. 用无菌塑料接种环或无菌木签从BA培养基上挑取1个单菌落，重悬于100 µl TEL缓冲液中。使用带螺旋盖的1.5 ml离心管。
3. 在95 °C孵育10分钟。随后立即将样品置于湿冰上冷却。
4. 用适用于PCR的H₂O将样品稀释100倍（作为PCR的模板DNA）。未稀释和已稀释的样品可在-20 °C保存1个月。

3. RS-PCR

1. 每个样本取 1.5 µl H₂O、12.5 µl Taq Master Mix、2 µl 10 µM G1 引物、2 µl 10 µM L1 引物，以及约相当于 30 ng 纯 DNA 的 7 µl 模板 DNA，用移液器加入 PCR 管中²。
2. 在标准 PCR 扩增仪中运行以下循环程序：95 °C 预变性 15 分钟，随后进行 27 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 1 分钟，升温斜坡 2 分钟后于 55 °C 退火 7 分钟；再经 2 分钟升温斜坡后，在 72 °C 延伸 2 分钟。最后在 72 °C 进行终延伸 10 分钟，然后降温至 4 °C 结束 PCR。
   注意：PCR 产物可在 -20 °C 下保存 5 天。
3. 每次 RS-PCR 实验均需设置阳性对照，i.e., 使用已知基因型的样本（通常为 GTB）作为阳性对照，同时设置阴性对照（H₂O）。

4. 电泳

1. 使用市售的DNA微型电泳试剂盒（MED试剂盒）以及连接至计算机并安装了配套软件的生物分析仪。仔细阅读制造商提供的相应说明书。
2. 根据制造商的说明书设置芯片预处理工作站，并调整注射器夹具。
3. 根据制造商的说明书配制凝胶-染料混合液。
4. 加载凝胶-染料混合液（按照制造商说明书操作）。
   1. 使用前将凝胶-染料混合液在室温下平衡30分钟。
   2. 将新的DNA芯片放置于芯片预处理工作站上。向标记为“G”的孔中加入9 µl凝胶-染料混合液。
   3. 确保推杆位于1 ml位置，然后关闭芯片预处理工作站。按下推杆直至被注射器夹具固定。准确等待30秒后松开注射器夹具。
   4. 等待5秒，缓慢将推杆拉回至1 ml位置。
   5. 打开芯片预处理工作站，向两个标记为“G”的孔中各加入9 µl凝胶-染料混合液。
5. 加载标记物
   1. 向全部12个样品孔以及梯状标记孔中各加入5 µl标记物。这13个孔均不得留空。
6. 加载梯状标记物和样品
   1. 向标记有梯状符号的孔中加入1 µl DNA梯状标记物。
   2. 向已使用的样品孔中加入1 µl样品，或向未使用的孔中加入1 µl去离子水。
   3. 将芯片水平放入适配器中，在2,400 rpm条件下涡旋振荡1分钟。
   4. 在5分钟内将芯片放入生物分析仪中运行。
7. 运行分析
   1. 启动生物分析仪及连接的计算机，打开软件。
   2. 打开生物分析仪的盖子，将芯片放入芯片架中（芯片仅能以一种方向正确安装），小心关闭盖子。
   3. 在软件的 Instrument 菜单中选择 "Electrophoresis" > "dsDNA" > "DNA 7500"。接受软件当前的 File Prefix 或进行修改。
   4. 点击软件中的开始按钮，输入样品名称。芯片运行完成后（约30分钟后），生物分析仪软件中将显示 End of Run 提示信息。
   5. 取出芯片，并根据制造商的说明清洁生物分析仪的电极。

5. 从电泳图谱推断基因型

1. 加载 Mahal 软件（该软件可从作者处免费获取）。
2. 将参考数据导入 Mahal 软件："文件" > "导入参考数据"
3. 在生物分析仪软件的 数据 环境中打开电泳运行文件。选择一个样本的电泳图谱。
4. 检查相关峰。
   1. 使用 Mahal 软件检查相关峰："工具" > "平均荧光强度"。将从生物分析仪软件中读取的荧光单位（FU）数值填入 "荧光强度" 框中。将荧光强度最高的 4 个（或 3 个）峰按升序排列并以逗号分隔后输入。示例：126,130,132,137。
      注：如果生物分析仪软件未显示所有这些峰的荧光强度值，则需通过读取图谱进行估算。
5. 点击 "计算" 按钮。若观测到的荧光强度超过 "最小峰高" 框中给出的数值，则该峰为相关峰。
6. 推断基因型。
   1. 在 Mahal 的文本框 "输入峰（bp）" 中，按升序排列并以逗号分隔输入所有相关峰的大小（单位为 bp）。示例：440,462,519,579,637。
      注：如果生物分析仪软件未显示所有峰的大小，则需通过读取图谱进行估算。
7. 点击 "计算" 按钮。
8. 在列表框中查找最小的马氏平方距离 "d2m"。如果其右侧对应的 P 值 ≥0.05，则拒绝零假设 H₀ 的概率 ≥5%（H₀：观测图谱与参考图谱相同），即认为观测图谱与所指示基因型的参考图谱相同。
9. 如果 d2m 最小但对应 P 值字段为空，则以 <5% 的概率拒绝 H₀。
   注：这意味着尽管 d2m 最小，图谱仍不相同。此类结果可能源于非标准的电泳条件。
   1. 为校正这些偏差，在文本框 "观测峰（bp）" 中输入数值 395，然后点击 "计算" 按钮。再次检查是否存在最小的 d2m 及对应的 P 值 ≥0.05。若未成功，尝试输入 405、415 和 425。
      注：有时需使用更小的步长。若仍不成功，则表明观测图谱未包含在参考数据中，可能为一种新的基因型或变异体。
10. 多种图谱
    1. 对每个电泳图谱分别重复步骤 5.6 至 5.9。

结果

基因型的定义及其变异类型

电泳图谱若在多于一条条带上的表现与所有已鉴定基因型均不同，则被视为一种新的基因型。新基因型的命名与扩展遵循 Fournier 等人 ⁵ 的方法，由此产生了从 GTA 到 GTZ 的基因型，随后是 GTAA 到 GTAZ、GTBA 到 GTBZ，以及目前的 GTCA 到 GTCC。仅一条条带存在差异的情况被视为基因型变体，该变体以罗马数字上标形式标注在基因型名称之后（例如，GTRI、GTRII）。目前，参考数据库中总共包含 141 种基因型及其变体。

在上述条件下，采用Fournier的RS-PCR方法 等 ⁵ 基因型鉴定菌株具有高度可重复性 S. aureus已知基因型或变异的明确鉴定在排除技...

讨论

整个实验过程中最关键的步骤是RS-PCR中DNA过量时（>30 ng 纯DNA/反应）²。通常情况下，若电泳图谱中所有峰的起始和终止均位于基线位置，则分辨率最佳。如果两个峰过于接近，则会导致分辨率不完全。在此情况下，生物分析仪软件可能会错误识别峰，因此需要进行人工识别。

所有可见分离且相关的以 bp 或 FU 表示的峰均被纳入进一步分析。RS-PCR 中模板 DNA 过多会导致峰变宽，从而引起峰重叠和峰分辨率下降。此外，迁移速度变慢会导致峰大小被错误地增高，使得无法准确推断基因型。最后，无关峰的数量也会增加。对于含有超过 3 个峰的图谱，荧光强度最高的峰通常不应超过 150 FU。

如所述，基于RS-PCR的基因分型受限于需要投入专用仪器，并且必须使用免费的Mahal软件。实际上，该方法需要标准PCR仪和生物分析仪。前者目前价格相对低廉，而后者则较为昂贵。即使使用高分辨率琼脂糖，基于琼脂糖的电泳分辨率仍不足够。在此条件下，仅能区分GTB、GTC以及所有其他基因型。然而，使用MED试剂盒或琼脂糖电泳...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三（羟甲基）氨基甲烷	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol；该物质相当于 Na2EDTA·2H2O
盐酸，5 mol/L	Merck	1.09911.0001
哥伦比亚琼脂 + 5% 羊血	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 试剂盒	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 生物分析仪	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 Expert 软件	Agilent Technologies
HotStarTaq 预混液	Qiagen	203445
引物 L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
引物 G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'