我们提供了从小鼠分离主动脉并利用原子力显微镜测量其弹性模量的详细实验方案。
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摘要
摘要
动脉硬化是心血管疾病的重要风险因素和生物标志物，也是衰老的显著特征。原子力显微镜（AFM）是一种多功能分析工具，可用于表征多种材料的黏弹性力学特性，范围涵盖硬质材料（如塑料、玻璃、金属） 等等。)表面与任意基底上的细胞之间的相互作用。它已被广泛用于测量细胞的刚度，但较少用于测量主动脉的刚度。本文将介绍采用原子力显微镜（AFM）接触模式测量主动脉刚度的操作步骤 离体 未加载小鼠动脉的弹性模量。我们描述了小鼠主动脉的分离步骤，随后提供了原子力显微镜（AFM）分析的详细信息，包括激光束对准、AFM探针弹簧常数和挠度灵敏度的校准，以及力曲线采集的逐步操作指南。此外，我们还提供了力曲线数据分析的详细方案。
引言
动脉的生物力学特性是心血管疾病（CVD）和衰老过程中的关键决定因素。动脉僵硬度是一个主要的、独立于胆固醇水平的心血管疾病风险因子，也是心血管疾病进展的重要指标，其程度随血管损伤、动脉粥样硬化、年龄增长和糖尿病而增加1-8。动脉壁僵硬与血管平滑肌细胞的去分化、迁移和增殖增加密切相关9-12。此外，动脉僵硬度升高还与巨噬细胞黏附增强1、内皮通透性增加及白细胞跨内皮迁移13，以及血管壁重塑14,15相关。因此，能够预防心血管疾病或衰老过程中动脉僵化的治疗方法，可能作为现有降胆固醇药物治疗的有益补充，共同用于心血管疾病的防治。
原子力显微镜（AFM）是一种用于多种物理和生物应用的强大分析工具。AFM 越来越多地被用于获取高分辨率图像，并在纳米尺度上以高度精确性表征组织和细胞等软性生物样品的生物力学特性1,2,10,16,17。AFM 的一个主要优势在于其可用于活细胞研究。
本文介绍了我们测量小鼠动脉弹性模量的方法 离体 使用原子力显微镜（AFM）。本方法描述了我们如何 1）正确分离小鼠动脉（降主动脉和主动脉弓），以及 2）通过原子力显微镜（AFM）测量这些组织的弹性模量。对动脉在无负载状态下的弹性模量进行测量，有助于阐明在血管损伤、心血管疾病（CVD）和衰老过程中细胞外基质（ECM）发生的变化。
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方案
本研究的动物实验已获得宾夕法尼亚大学机构动物护理与使用委员会的批准。实验方法均按照批准的指南进行。
1. 小鼠准备与主动脉分离
- 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（80 - 100 mg/kg）、赛拉嗪（8 - 10 mg/kg）和乙酰丙嗪（1 - 2 mg/kg）进行麻醉。通过夹尾试验确认麻醉效果。待小鼠完全麻醉后，采用颈椎脱位法处死小鼠。
- 将小鼠仰卧放置，并用大头针将其固定于解剖板上。使用70%（v/v）乙醇擦拭液清洁腹部区域。
- 用镊子捏住腹中线处的皮肤，用中号显微外科剪刀在腹部做一小切口。用镊子夹住皮肤的同时，使用中号显微外科剪刀从中腹部向胸骨方向剪开皮肤和腹膜。
- 用中号显微外科剪刀剪除两侧肋骨。用小型显微外科剪刀小心移除肺和肝脏，保留心脏和主动脉。将小鼠连同解剖板转移至体视显微镜下。
- 用小型镊子夹住主动脉周围的脂肪组织，使用小型剪刀小心剥离主动脉周围的脂肪组织。
- 用镊子轻轻夹住主动脉，用小型显微外科剪刀在升主动脉起始处剪开一个口，再在降主动脉末端（腹主动脉上方）剪开第二个口。
- 将分离出的主动脉转移至含有1×磷酸盐缓冲液（PBS；不含钙和镁）的60 mm培养皿中。
- 继续使用小型显微外科剪刀去除主动脉上残留的脂肪组织。用小型剪刀沿纵轴切开主动脉。
- 用小型显微外科剪刀从降主动脉和主动脉弓处切下一小块组织（约 2 × 4 mm），用于原子力显微镜（AFM）分析（图1）。将组织置于60 mm塑料培养皿中，并用一滴PBS保持湿润。
图1：显示小鼠主动脉不同节段位置的示意图。 主动脉从心脏至横膈膜被完整分离，其中一小段降主动脉和主动脉弓用于测定弹性模量。比例尺：1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 准备用于原子力显微镜测量的组织样本
- 使用实验室擦拭纸小心移除 PBS，避免接触主动脉。确保组织的管腔面朝上。
- 用凝胶加样枪头在打开的主动脉两端各加入 5 - 10 μl 氰基丙烯酸酯粘合剂，轻轻将两端粘附于培养皿上（图 2）。
注意： 每端固定组织所需的胶量需通过实验确定。此过程中必须确保主动脉未被拉伸。 - 检查已粘附的主动脉，确保其无折叠或漂浮。待胶水在空气中干燥（30 - 60 秒）后，轻柔加入 PBS 并将样本完全浸没。
注意： 在组织准备进行分析的同时，可并行进行原子力显微镜的准备工作（步骤 3 - 5）。
图2：使用氰基丙烯酸酯胶水将主动脉组织段粘附于60 mm培养皿上的示意图。 正在将氰基丙烯酸酯胶水涂抹至主动脉样本边缘，以准备进行原子力显微镜（AFM）测量。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 加载探针
- 将流体探针支架安装到探针加载台。
- 使用镊子将带球形尖端的氮化硅原子力显微镜（AFM）探针（悬臂弹簧常数为 0.06 N/m）滑入探针支架中（我们曾使用直径为 1 µm 的 SiO2 微粒，但也可使用更大尺寸的微粒）。确保 AFM 探针牢固固定在探针支架上。
- 将探针支架滑入 AFM 头部的 Z 向扫描器安装座，并确保探针支架已牢固连接。
4. 调整探针上的激光对准
- 打开原子力显微镜（AFM）软件。在软件中选择实验类型；将实验类别设为接触模式，实验组设为液体中的接触模式，实验设为液体中的接触模式。点击软件中的加载实验，这将启动激光器。
- 向50 mm玻璃底培养皿中加入3 ml蒸馏水，并将培养皿放置在激光对准单元的载物台上。该单元可简化将激光束聚焦到悬臂背面的过程。
- 将AFM探头垂直安装到激光对准单元上，并开启激光对准单元的电源。在AFM探针尖端滴加约50 μl蒸馏水，形成液滴。
- 使用操纵杆降低AFM探头，使AFM探针尖端与培养皿中的水接触。如果AFM探针尖端未与培养皿中的水接触，可轻轻抬高培养皿直至接触。调节焦距、亮度和XY位置，使AFM探针尖端在对准单元的LCD屏幕上清晰可见。
- 通过调节AFM探头上的激光定位旋钮，将激光光斑对准AFM探针尖端。使用AFM探头上的探测器定位旋钮，调节光电二极管的位置，使垂直偏转信号值在0至-1 V之间，水平偏转信号值约为0 V。
- 检查激光总和信号是否达到最大。如有必要，重复步骤4.5，重新调节AFM探针尖端上的激光束位置和光电二极管位置，以获得最大总和信号。
注意：即使重复步骤4.5，也可能需要重新调整AFM探针在探针夹持器上的位置，以获得最大总和信号。
5. 校准原子力显微镜探针的偏转灵敏度和弹簧常数
- 用镊子在60-mm培养皿上划一道划痕，然后向培养皿中加入蒸馏水。将培养皿放置在样品支架板上。本实验中，将培养皿安装在倒置显微镜的电动XY扫描载台上。
- 将磁性板架放置在板上，以确保成像过程中板的稳定。
- 点击 “上”箭头 在软件的导航菜单中，将原子力显微镜（AFM）探头抬升至接近最高位置，以确保AFM探针不会触碰到培养皿。
注意： 此步骤非常重要，可避免损坏原子力显微镜针尖。 - 将原子力显微镜探头置于显微镜载物台上。
- 使用显微镜聚焦于培养板上的划痕处。使用操纵杆，或点击 向下箭头 在导航菜单中，缓慢而小心地将原子力显微镜探针降入磷酸盐缓冲液（PBS）中。将探针头部略微置于培养板划痕的上方。
注意： 若原子力显微镜探头的初始位置更接近样品，其接触时间将显著缩短。 - 在开始操作前，根据需要重新调整激光束在原子力显微镜探针上的位置以及光电二极管的位置，以获得最大的SUM信号。
- 通过点击选择吸头类型 更换探针 在“设置”菜单中。
- 点击 检查参数 并设置参数： 扫描尺寸 至 0， 扫描速率 至 1 Hz， 样本/谱系 至 256 和 偏转设定值 至20 nm。点击“Engage”。探针与孔板表面接触前，“Engage Status”窗口将保持开启。探针接触后，点击 斜坡.
- 点击 扩展模式 在扫描工具栏菜单中设置参数： 坡道尺寸 500 nm 至 1 µm, 升温速率 至 2 Hz， 样本数量 至 256， 尖端半径 至 500 nm， 样品泊松比 至 0.5（假设被测材料完全不可压缩）， 尖端半角 至 0， 触发模式 相对于 触发阈值 20 到 100 nm 之间
- 单击“斜坡工具栏”菜单中的“斜坡连续”以在样品台上获取力曲线（图 3A）。在此力曲线中，将通道1设置为 偏转误差.
注意： 这将允许软件绘制垂直偏转与 z 位置的关系图。- 点击力曲线的左侧或右侧末端，拖动光标以框选力曲线中的线性区域（图 3A，红色虚线）。使用这两条线标记需用直线拟合的倾斜区域的边界。
- 选择 斜坡 在工具栏中并单击 更新灵敏度. 记录数值，并重复此步骤四次。选择 校准 在工具栏中，然后单击 检测器在五次测量结果中输入一个平均值 偏转灵敏度 盒子
- 点击 移除 2 - 3 次以抬升原子力显微镜（AFM）探头。此步骤至关重要，可防止在热调谐过程中AFM针尖与载样台发生相互作用。点击 热调谐 在工具栏中。
- 设置 热调谐范围 1 至 100 kHz（此信息可从制造商的产品目录中获取）且 偏转灵敏度校正 1.144（V型悬臂）和1.106（矩形悬臂）。
- 在“热调谐”菜单中，单击 获取数据 以获得热调谐曲线（图3B）。使用AFM软件，在曲线两侧放置红色虚线（如图所示 图3B) 通过从图的边缘拖动鼠标来定义拟合边界。选择以下任意一项 洛伦兹（空气） 或 简谐振子（流体） 模型选择取决于哪个模型对数据的拟合更优。
- 点击 拟合数据，然后 计算弹簧常数 K 并保存该数值。重复进行多次弹簧常数校准，并使用平均值。点击 撤回 数次。
- 将原子力显微镜探头从显微镜载物台上取下，并放置于对准装置上。从显微镜载物台上取下培养皿。
图3：用于AFM探针校准的原子力显微镜力-距离曲线。(A) 一条典型的原子力显微镜力-距离曲线（校准曲线）。力-距离曲线中两条垂直红色虚线之间的伸出段用于确定悬臂梁的偏转灵敏度。 (B) 用于计算悬臂梁弹簧常数的简谐振子拟合图，方法如前所述20。 请点击此处查看该图的放大版本。
6. 离体测量小鼠动脉的弹性模量 Ex Vivo
- 将含有主动脉组织的 60-mm 培养皿放置于显微镜载物台上，并用磁性培养皿固定器固定培养皿。
- 将原子力显微镜（AFM）探头装置置于显微镜载物台上。确保 AFM 探针不与主动脉接触，而是轻轻接触 PBS 并形成弯月面。如有必要，将 AFM 探头装置放置于对准单元上，点击 撤回（Withdraw），直至有足够的间隙避免接触，然后将 AFM 探头装置放回显微镜载物台上。
- 点击 导航（Navigate）。使用操纵杆或点击 “向下箭头”，缓慢降低 AFM 探针，以定位悬臂梁在主动脉上方的位置。如有必要，使用 AFM 探头装置上的探测器定位旋钮调节光电二极管的位置。
- 点击 接触（Engage），使悬臂梁与主动脉接触。
- 一旦与主动脉建立接触，确保压电陶瓷中心位置稳定，然后点击 力-距离曲线扫描（Ramp）。若压电陶瓷中心位置出现波动，可能是由于错误接触所致。此时应撤回探针，并以小幅度（约 0.5 V）逐步增加激光在光电二极管上的垂直偏移量，然后重新接触。
- 此外，若探针距离样品表面过高，可在重新接触前手动将探针降低至接近样品表面。若前述步骤仍无法消除波动，尝试更换探针。
- 将 扫描范围（Ramp Size） 设置为 3 µm，触发模式（Trigger Mode） 设置为相对模式（Relative），触发阈值（Trigger Threshold） 设置为 100 nm，然后点击 连续扫描（Ramp Continuous）。观察探针与样品接触点是否出现在 Z 向扫描周期的中心至下部 ¾ 范围内。若未观察到此现象，应从样品脱离，根据需要调整扫描范围，然后重新与样品接触。
- 在菜单栏中点击 显微镜（Microscope），然后点击 接触设置（Engage Settings）。将 SPM 撤回距离（SPM Withdraw） 更改为 30 µm。在扫描工具栏菜单中点击 连续扫描（Ramp Continuous）。
- 观察力-距离曲线后，在菜单栏中点击 采集（Capture），然后点击 采集文件名（Capture Filename）。输入期望的文件名，结尾为“.000”（以便后续采集的文件编号自动递增）。选择指定文件夹并保存数据。
- 在采集工具栏菜单中点击 采集（Capture），然后点击 撤回（Withdraw） 和 导航（Navigate）。使用操纵杆或软件控制将悬臂梁移至主动脉的另一区域（紧邻初始测量点；参见 图 4）。
- 依次点击 接触（Engage）、扫描（Ramp） 和 连续扫描（Ramp Continuous）。观察力-距离曲线后，点击 停止（Stop），然后点击 采集（Capture）。
- 重复步骤 6.9 至 6.10。每个区域至少采集 5 次测量数据，如 图 4 所示。注意： 通常从每份组织的 3 至 5 个不同位置采集 15 至 25 条力-距离曲线，如 图 4 所示。
图4：悬臂梁接近并压入组织（区域1）的示意图。 该原子力显微镜（AFM）测量在每条动脉的3至5个不同位置（区域1至5）重复进行15至25次，以获取整个组织样本的刚度。 请点击此处查看此图的放大版本。
7. 数据分析
- 打开力曲线分析软件。
- 点击 查找 和 开放 在菜单栏中，双击要分析的文件。
- 点击 调整力参数 在工具栏菜单中检查挠度灵敏度、弹簧常数、针尖半径、针尖半角和泊松比。如需更改参数，请勾选其旁边的复选框，并在“新值”列中输入正确的数值，然后单击 执行.
- 如果力曲线噪声较大，点击 箱形滤波器 并设置输入参数 方向 以扩展， 平均点数 至 3 和 滤波器阶数 至 0th. 点击 执行 以平滑数据。
- 点击 基线校正 在菜单栏中设置输入参数 方向 以扩展， 绘图单位 施加力， 类型 分离， 校正顺序 至 1st 和 延长基线源 延伸。调整垂直的蓝色虚线，使其包含力曲线的平坦部分，然后单击 执行.
- 点击 压痕 在工具栏菜单中设置输入参数 活性曲线 延伸至， 拟合方法 基于接触点， 接触点算法 将“作为合适变量处理” 包含粘附力 至 No， 最大作用力拟合边界 至 30% 最小力配合边界 至 0% 并 拟合模型 转换为赫兹型（球面）。
注意： 在我们的测量中，探针与样品之间出现显著粘附（悬臂在回撤曲线中发生负向偏转）的情况很少见。当观察到此类粘附现象时，应采用适当的模型（DMT 或 JKR）进行分析18,19. - 保存杨氏模量的数值。分析在相互间距较小的区域内采集的 3 - 5 个区域（每个区域 5 条力曲线）的杨氏模量（弹性模量），如图所示 图4.
注意： 为消除伪影，需排除杨氏模量 > 100 kPa（通常约占总测量值的10%）从分析中剔除。 - 为已测量的3至5个区域分别计算平均杨氏模量值，并利用这些值进一步计算整个主动脉的平均弹性模量。
注意： 至少使用3个，更常见的是4 - 6个独立的主动脉样本，以获得对动脉僵硬度的准确定量评估。最终结果以“n”次独立实验的均值 ± 标准误（SEM）表示。所需主动脉样本的确切数量当然取决于所需的准确水平。
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结果
图5A 显示了6月龄雄性C57BL/6小鼠降主动脉（胸段）的相差显微图像。原子力显微镜（AFM）悬臂梁已定位在组织正上方，准备进行压痕操作。图5B 和 图5C 展示了通过接触模式下AFM压痕获得的典型力-距离曲线。图5B 和 图5C 中的绿色线条表示采用球形赫兹（Hertzian）模型拟合得到的最佳拟合曲线。在 图5D 中，根据文中所述方法，测定了三只独立小鼠的降主动脉和主动脉弓的平均刚度。需要注意的是，降主动脉和主动脉弓分别代表层流和扰动血流区域。然而，通过AFM测定，它们在无机械负载状态下的弹性模量相似。
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讨论
原子力显微镜压痕法可用于表征细胞和组织的刚度（弹性模量）。本文中，我们提供了详细的分步操作方案，用于分离小鼠的降主动脉和主动脉弓，并测定这些动脉区域的弹性模量 离体我们在此总结并讨论本文所述方法的技术问题与局限性。
由于小鼠主动脉体积小且质地纤薄，在其分离与分析过程中可能会遇到多种技术问题。当沿纵轴切开已清理的动脉时，需特别注意避免损伤内膜（管腔表面），因为弹性模量数据的采集正是在此区域进行。最终样本皿中若残留过多PBS，会影响动脉与皿底的粘附，因此在粘附前需使用纸巾小心吸除，但操作时不得触碰动脉。然而需注意，当试图去除多余PBS时，分离的动脉可能粘附于纸巾上，从而导致样本损伤。在将动脉粘附至培养皿时，极为重要的是不得牵拉动脉，并且仅需在动脉两端逐点施加少量粘合剂。进行原子力显微镜压痕（AFM-indentation）检测时，必须避免在已施加粘合剂的动脉末端区域进行探测。最后，由于弹性模量测量使用的是新鲜分离的动脉，因此应尽量缩短从组织获取到完成测量之间的时间间隔。
由于本研究中使用的球形探针尖端半径为500...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
原子力显微镜分析在宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院宾夕法尼亚肌肉研究所和转化医学与治疗学研究所支持的仪器上进行。本研究得到美国国立卫生研究院（NIH）资助项目HL62250和AG047373的支持。YHB获得了美国心脏协会博士后奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物范围催化剂原子力显微系统 | Bruker | ||
| 尼康Eclipse TE 200倒置显微镜 | Nikon Instruments | ||
| 氮化硅原子力显微探针 | Novascan Technologies | PT.SI02.SN.1 | 0.06 N/m悬臂；1 µm SiO2颗粒 |
| Dumont #5镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | 参见第1.4节 |
| Dumont #5SF镊子 | Fine Science Tools | 11252-00 | 参见第1.8节 |
| 精细剪刀-ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | 参见第1.4节（中号） |
| Vannas-Tübingen弹簧剪 | Fine Science Tools | 15008-08 | 参见第1.6节（小号） |
| 60 mm经组织培养处理的细胞培养皿 | Corning | 353004 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液，1x | Corning | 21-031-CM | 不含钙和镁 |
| Krazy Glue多功能速干液体胶水 | Krazy Glue | KG58548R | 参见第2.2节 |
| 凝胶加样枪头，1 - 200 µl | Fisher | 02-707-139 | 参见第2.2节 |
| 枪头镊子 | Electron Microscopy Sciences | 78092-CP | 参见第3.2节 |
| 50 mm透明壁玻璃底培养皿 | TED PELLA | 14027-20 | 参见第4.4节 |
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