我们提供了从小鼠分离主动脉并利用原子力显微镜测量其弹性模量的详细实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
动脉硬化是心血管疾病的重要风险因素和生物标志物，也是衰老的显著特征。原子力显微镜（AFM）是一种多功能分析工具，可用于表征多种材料的黏弹性力学特性，范围涵盖硬质材料（如塑料、玻璃、金属） 等等。)表面与任意基底上的细胞之间的相互作用。它已被广泛用于测量细胞的刚度，但较少用于测量主动脉的刚度。本文将介绍采用原子力显微镜（AFM）接触模式测量主动脉刚度的操作步骤 离体 未加载小鼠动脉的弹性模量。我们描述了小鼠主动脉的分离步骤，随后提供了原子力显微镜（AFM）分析的详细信息，包括激光束对准、AFM探针弹簧常数和挠度灵敏度的校准，以及力曲线采集的逐步操作指南。此外，我们还提供了力曲线数据分析的详细方案。
引言
动脉的生物力学特性是心血管疾病（CVD）和衰老过程中的关键决定因素。动脉僵硬度是一个主要的、独立于胆固醇水平的心血管疾病风险因子，也是心血管疾病进展的重要指标，其程度随血管损伤、动脉粥样硬化、年龄增长和糖尿病而增加1-8。动脉壁僵硬与血管平滑肌细胞的去分化、迁移和增殖增加密切相关9-12。此外，动脉僵硬度升高还与巨噬细胞黏附增强1、内皮通透性增加及白细胞跨内皮迁移13，以及血管壁重塑14,15相关。因此，能够预防心血管疾病或衰老过程中动脉僵化的治疗方法，可能作为现有降胆固醇药物治疗的有益补充，共同用于心血管疾病的防治。
原子力显微镜（AFM）是一种用于多种物理和生物应用的强大分析工具。AFM 越来越多地被用于获取高分辨率图像，并在纳米尺度上以高度精确性表征组织和细胞等软性生物样品的生物力学特性1,2,10,16,17。AFM 的一个主要优势在于其可用于活细胞研究。
本文介绍了我们测量小鼠动脉弹性模量的方法 离体 使用原子力显微镜（AFM）。本方法描述了我们如何 1）正确分离小鼠动脉（降主动脉和主动脉弓），以及 2）通过原子力显微镜（AFM）测量这些组织的弹性模量。对动脉在无负载状态下的弹性模量进行测量，有助于阐明在血管损伤、心血管疾病（CVD）和衰老过程中细胞外基质（ECM....
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方案
本研究的动物实验已获得宾夕法尼亚大学机构动物护理与使用委员会的批准。实验方法均按照批准的指南进行。
1. 小鼠准备与主动脉分离
- 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（80 - 100 mg/kg）、赛拉嗪（8 - 10 mg/kg）和乙酰丙嗪（1 - 2 mg/kg）进行麻醉。通过夹尾试验确认麻醉效果。待小鼠完全麻醉后，采用颈椎脱位法处死小鼠。
- 将小鼠仰卧放置，并用大头针将其固定于解剖板上。使用70%（v/v）乙醇擦拭液清洁腹部区域。
- 用镊子捏住腹中线处的皮肤，用中号显微外科剪刀在腹部做一小切口。用镊子夹住皮肤的同时，使用中号显微外科剪刀从中腹部向胸骨方向剪开皮肤和腹膜。
- 用中号显微外科剪刀剪除两侧肋骨。用小型显微外科剪刀小心移除肺和肝脏，保留心脏和主动脉。将小鼠连同解剖板转移至体视显微镜下。
- 用小型镊子夹住主动脉周围的脂肪组织，使用小型剪刀小心剥离主动脉周围的脂肪组织。
- 用镊子轻轻夹住主动脉，用小型显微外科剪刀在升主动脉起始处剪开一个口，再在降主动脉末端（腹主动脉上方）剪开第二个口。
- 将分离出的主动脉转移至含有1×磷酸盐缓冲液（PBS；不含钙和镁）的60 mm培养皿中。
- 继续使用小型显微外科剪刀去除主动脉上残留的脂肪组织。用小型剪刀沿纵轴切开主动脉。
- 用小型显微外科剪刀从降主动脉和主动脉弓处切下一小块组....
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结果
图5A 显示了6月龄雄性C57BL/6小鼠降主动脉（胸段）的相差显微图像。原子力显微镜（AFM）悬臂梁已定位在组织正上方，准备进行压痕操作。图5B 和 图5C 展示了通过接触模式下AFM压痕获得的典型力-距离曲线。图5B 和 图5C 中的绿色线条表示采用球形赫兹（Hertzian）模型拟合得到的最佳拟合曲线。在 图5D 中，根据文中所述方法，测定了三只独立小鼠的降主动脉和主动脉弓的平均刚度。需要注意的是，降主动脉和主动脉弓分别代表层流和扰动血流区域。然而，通过AFM测定，它们在无机械负载状态下的弹性模量相似。
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讨论
原子力显微镜压痕法可用于表征细胞和组织的刚度（弹性模量）。本文中，我们提供了详细的分步操作方案，用于分离小鼠的降主动脉和主动脉弓，并测定这些动脉区域的弹性模量 离体我们在此总结并讨论本文所述方法的技术问题与局限性。
由于小鼠主动脉体积小且质地纤薄，在其分离与分析过程中可能会遇到多种技术问题。当沿纵轴切开已清理的动脉时，需特别注意避免损伤内膜（管腔表面），因为弹性模量数据的采集正是在此区域进行。最终样本皿中若残留过多PBS，会影响动脉与皿底的粘附，因此在粘附前需使用纸巾小心吸除，但操作时不得触碰动脉。然而需注意，当试图去除多余PBS时，分离的动脉可能粘附于纸巾上，从而导致样本损伤。在将动脉粘附至培养皿时，极为重要的是不得牵拉动脉，并且仅需在动脉两端逐点施加少量粘合剂。进行原子力显微镜压痕（AFM-indentation）检测时，必须避免在已施加粘合剂的动脉末端区域进行探测。最后，由于弹性模量测量使用的是新鲜分离的动脉，因此应尽量缩短从组织获取到完成测量之间的时间间隔。
由于本研究中使用的球形探针尖端半径为500.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
原子力显微镜分析在宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院宾夕法尼亚肌肉研究所和转化医学与治疗学研究所支持的仪器上进行。本研究得到美国国立卫生研究院（NIH）资助项目HL62250和AG047373的支持。YHB获得了美国心脏协会博士后奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物范围催化剂原子力显微系统 | Bruker | ||
| 尼康Eclipse TE 200倒置显微镜 | Nikon Instruments | ||
| 氮化硅原子力显微探针 | Novascan Technologies | PT.SI02.SN.1 | 0.06 N/m悬臂；1 µm SiO2颗粒 |
| Dumont #5镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | 参见第1.4节 |
| Dumont #5SF镊子 | Fine Science Tools | 11252-00 | 参见第1.8节 |
| 精细剪刀-ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | 参见第1.4节（中号） |
| Vannas-Tübingen弹簧剪 | Fine Science Tools | 15008-08 | 参见第1.6节（小号） |
| 60 mm经组织培养处理的细胞培养皿 | Corning | 353004 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液，1x | Corning | 21-031-CM | 不含钙和镁 |
| Krazy Glue多功能速干液体胶水 | Krazy Glue | KG58548R | 参见第2.2节 |
| 凝胶加样枪头，1 - 200 µl | Fisher | 02-707-139 | 参见第2.2节 |
| 枪头镊子 | Electron Microscopy Sciences | 78092-CP | 参见第3.2节 |
| 50 mm透明壁玻璃底培养皿 | TED PELLA | 14027-20 | 参见第4.4节 |
参考文献
- Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
- Liu, S. -L., et al. Matrix me....
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