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方法文章

利用荧光激活细胞分选法从鼠骨髓中纯化浆细胞样树突状细胞

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DOI：

10.3791/54641

⸱

2016年11月4日

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

本文内容

摘要

我们报道了一种利用荧光激活细胞分选技术从易患狼疮小鼠的骨髓中高纯度分离浆细胞样树突状细胞（pDC）的方案，用于pDC的功能研究。

摘要

荧光激活细胞分选（FACS）是一种基于流式细胞术检测表型来纯化特定细胞群体的技术。该方法使研究人员能够在不受其他细胞干扰的情况下，更深入地了解单一细胞群体的特性。与其他细胞富集方法（如磁珠激活细胞分选（MCS））相比，FACS凭借流式细胞术的表型检测能力，在细胞分离方面具有更高的灵活性和准确性。此外，FACS通常能够同时分离多个细胞群体，从而提高实验的效率和多样性。尽管FACS存在一定的局限性，但它已被广泛应用于功能研究中细胞的纯化，无论是在 体外 和 体内 设置。本文报道了一种利用荧光激活细胞分选技术，从易感狼疮小鼠的骨髓中高纯度分离极稀有免疫细胞群体——浆细胞样树突状细胞（pDC）的实验方案，用于 体外 pDC的功能研究

引言

从其他细胞中高效分离出目标细胞群体，使得对这些特定细胞的研究成为可能，而这些研究在其他情况下往往难以实现。1,2 荧光激活细胞分选（FACS）是一种能够以高纯度富集特定细胞群体的方法。不同类型的细胞通常在细胞质膜上表达独特的分子，或多种分子的独特组合，从而能够将一个细胞群体与其他群体区分开来。当特异性荧光标记抗体与这些细胞表面分子结合后，一种称为流式细胞仪/分选仪的检测设备即可激发并检测来自不同荧光染料的光信号，从而在单细胞水平上识别细胞上不同分子标记物的表达情况。这些信息综合起来，包括光信号的存在（代表相应表面分子的阳性表达）或光信号的缺失（代表分子的阴性表达），共同定义了细胞的表型。在通过检测器后，具有相同目标表型的细胞会根据其电荷被引导至指定的收集管中。

只要待富集的细胞群体带有荧光标记，流式细胞分选（FACS）便可广泛应用于各类研究中。3-7 该技术已被用于从肠道微生物群中分离免疫球蛋白（Ig）A包被的细菌与非IgA包被的细菌8，以及分选表达荧光蛋白的基因工程细胞群体。9 重要的是，FACS能够同时分离多个细胞群体，这不仅节省时间和试剂，还支持更复杂的研究设计。10 然而，FACS也存在局限性。若目标细胞群体极为稀少（少于1%），分选效率可能降低，导致显著的细胞损失。此外，某些抗体结合可能激活细胞内信号转导，从而诱导分选后细胞群体的功能改变。11 因此，用于分选的表型应谨慎选择。

除了流式细胞荧光分选（FACS）之外，还有其他基于细胞表面标志物来富集特定细胞群体的方法，例如磁珠激活细胞分选（MCS）。12 与FACS类似，偶联抗体的磁珠可靶向特定的细胞表面分子。当抗体与抗原结合后，经过磁场作用，被磁珠包被的细胞便可与未被包被的细胞分离。然而，由于磁珠不像FACS中多种荧光染料那样可被区分，因此在MCS中能够同时靶向的分子数量有限。13,14 正因如此，MCS难以对具有复杂表面标志物组合的细胞表型进行精确界定。此外，MCS还可能引起靶细胞的非预期激活。

在我们对系统性红斑狼疮（SLE）小鼠模型的研究中15，我们原本计划纯化浆细胞样树突状细胞（pDC），以探究其在疾病进展过程中的功能变化。我们首先使用磁珠分选（MCS）技术，通过靶向PDCA-1分子从骨髓中富集pDC，该分子在稳态下于小鼠pDC表面高度且特异性表达16。然而，细胞纯度意外偏低，可能是因为在SLE等炎症环境中，其他细胞群体也上调了PDCA-1的表达16。最终，我们采用荧光激活细胞分选（FACS）技术，联合使用四种表面标志物（CD11c、CD11b、B220和PDCA-1），将高纯度的pDC定义为CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+细胞群。小鼠pDC还具有另一特异性表面标志物Siglec-H。我们决定不使用Siglec-H，因为针对该分子的抗体结合会抑制pDC产生干扰素α（IFNα）的功能11。

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方案

注意：MRL/Mp-Faslpr（MRL/lpr）狼疮易感小鼠在弗吉尼亚理工学院（Virginia Tech）机构动物照护与使用委员会（IACUC）（动物福利保证编号：A3208-01）规定的特定病原体-free设施中进行繁育和饲养。本研究严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物照护与使用指南》中的建议进行。所有动物实验均在IACUC方案编号#12-062下开展。

1. 细胞培养基和分选缓冲液

  1. 使用 RPMI 1640 培养基配制完全细胞培养基（C10），添加 10% 胎牛血清、1 mM 丙酮酸钠、1% 100 MEM 非必需氨基酸、10 mM HEPES、55 µM 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和 100 U/ml 青霉素-链霉素。
  2. 使用 1× Hank's 平衡盐溶液（HBSS）配制分选缓冲液（HBSS-full），添加 10 mM HEPES、2.5 mg/ml 牛血清白蛋白、0.05 mM MgCl2 和 0.2 U/ml DNase I。

2. 小鼠解剖

  1. 准备两个直径为6 cm的培养皿，每皿中加入4 ml C10。将培养皿置于冰上。
  2. 通过吸入CO2处死小鼠。
  3. 取出脾脏，并将其保存在盛有C10并置于冰上的培养皿中。
    1. 将小鼠仰面固定在解剖板上。用70%乙醇喷洒体表进行消毒。
    2. 沿腹中线从耻骨联合至颈部切开皮肤，并将皮肤与下方肌层分离。
    3. 从第一切口沿后肢至踝关节处切开皮肤。
    4. 将两侧皮肤向后固定，从第一切口处沿体侧肌层切至膈肌。
    5. 将右侧肌层向头部方向翻折并固定。
    6. 在小鼠右侧、小肠下方及胃旁定位脾脏。夹住脾脏一端，将其与胃部分离。
  4. 切除双侧后肢，包括股骨和胫骨，并尽可能去除所有肌肉组织。
    1. 用锋利的剪刀沿后肢从骨盆/髋关节至踝关节剪除肌肉，注意尽量避开血管。
    2. 在骨盆/髋关节和踝/足关节处剪断，完整取出后肢，避免暴露骨髓内容物。
    3. 用刀片反复刮除骨头上残留的肌肉，并在关节处剪除残余肌肉组织。
  5. 将骨骼置于盛有4 ml C10并置于冰上的6 cm培养皿中。继续解剖下一只小鼠。

3. 脾细胞分离

  1. 将脾脏置于含有 4 ml C10 的培养皿上方的 70-µm 细胞筛网上，用注射器活塞轻轻研磨，直至无可见红色组织碎片。
  2. 通过细胞筛网向培养皿中再加入 6 ml C10，然后将总共 10 ml 的细胞悬液转移至 15 ml 圆锥形离心管中。
  3. 在 4 °C 条件下，以 800 × g 离心 5 分钟。
  4. 离心后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 2 ml 1 × 红细胞（RBC）裂解缓冲液中，在室温下孵育 5 分钟。
  5. 孵育结束后，将离心管在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 5 分钟。
  6. 离心后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 ml C10 中。弃去大的细胞团块（死细胞），将离心管置于冰上备用。
    注意：若存在较多小团块，可使用 70-µm 细胞筛网将细胞悬液过滤一次。
  7. 使用自动细胞计数仪结合台盼蓝染色对细胞数量进行计数。

4. 骨髓细胞分离

  1. 将骨骼与 4 ml C10 转移至研钵中，并加入 6 ml C10，使总体积达到 10 ml C10。
  2. 使用研杵在研钵中轻轻敲碎骨骼。
  3. 用研杵轻轻搅拌，使骨髓释放到 C10 中。
  4. 将含有骨髓的 10 ml C10 通过 70-µm 细胞筛过滤，转移至冰上放置的 50 ml 锥形管中。向仍含有骨骼的研钵中加入 10 ml 新鲜 C10。
    注意：若可见红色团块，应在过滤前用移液器将含骨髓的溶液反复吹打数次。
  5. 重复步骤 4.2 至 4.4 两次。最后一次洗涤后，骨骼应呈现白色。
  6. 将 50 ml 锥形管在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 5 分钟。同时，在室温下准备 5 ml 即用型密度梯度介质于 15 ml 锥形离心管中。
  7. 离心后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 ml C10 中。
  8. 将 10 ml 细胞悬液缓慢铺加到 5 ml 密度梯度介质上方，保持两相之间界面清晰。然后将 15 ml 锥形管在室温（20 °C）下以 1,363 × g 离心 30 分钟，加速度设为 9，减速度设为 0（或关闭刹车）。
  9. 离心后，小心移除上方 8 ml 溶液，并收集界面处的 2 ml 白膜层（单个核细胞层）至新的 15 ml 锥形管中。
  10. 向含有骨髓单个核细胞的 15 ml 锥形管中加入 12 ml 冰冷的 C10，盖紧管盖并反复倒置数次以充分混匀，然后在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 10 分钟。

5. 用于FACS的细胞表面染色

  1. 样品染色
    1. 配制抗小鼠 CD16/32 抗体溶液（以 HBSS-full 按 1:100 稀释，终浓度为 5 µg/ml）。
    2. 在步骤4.10离心后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于100 µl抗小鼠CD16/32抗体溶液中，以阻断单个核细胞上的Fc受体。冰上孵育10分钟。
    3. 配制荧光标记抗体混合液（按制造商推荐，以HBSS完全培养基配制，终体积为每样本100 µl，包含抗小鼠CD11c-PE 1:40稀释、抗小鼠CD11b-APC-Cy7 1:80稀释、抗小鼠PDCA-1-FITC 1:40稀释以及抗小鼠B220-V500 1:40稀释）。
      注意：使用抗体前必须进行滴定。
    4. 在步骤5.1.2孵育10分钟后，加入4 ml预冷的HBSS-full，于4 °C、800 × g离心5 min，以去除未结合的抗小鼠CD16/32抗体。
    5. 离心后，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于100 µl荧光标记抗体混合液中，冰上避光孵育15分钟。
    6. 孵育15分钟后，加入4 ml预冷的HBSS-full，于4 °C、800 × g离心5 min，以去除未结合的荧光标记抗体。
    7. 配制FACS上样溶液（含500 ng/ml DAPI的HBSS-full）。
    8. 在步骤5.1.6离心后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于500 µl FACS上样溶液中。将细胞悬液转移至12 x 75 mm圆底管（FACS管）中，置于冰上避光保存，并在1小时内进行分选。
  2. 补偿染色
    1. 将6个FACS管标记为PE、APC-CY7、FITC、V500、DAPI或未染色。每管分装1 × 10⁶个脾细胞。6 将细胞/管中的样品转移至FACS管中，加入4 ml HBSS-full，于4 °C、800 × g离心5 min。
      注意：使用DNA结合型荧光染料DAPI区分活细胞与死细胞。DAPI可穿透死细胞（但不能穿透活细胞）的质膜，并与染色体DNA结合。
    2. 吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于100 µl HBSS-full中。
    3. 在每个相应的流式管中，分别加入以下一种抗体：按制造商推荐，抗小鼠CD19-PE（1:40稀释）、抗小鼠CD11b-APC-Cy7（1:80稀释）、抗小鼠PDCA-1-FITC（1:40稀释）或抗小鼠B220-V500（1:40稀释）。留下5th (DAPI) 和 6th （未染色的）FACS 管保持原样，轻轻振荡混匀，将所有 FACS 管置于冰上避光孵育 15 分钟。
    4. 孵育后，向每支试管中加入4 ml预冷的HBSS-full，于4 °C、800 × g离心5 min。
    5. 离心后，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于500 µl预冷的HBSS-full中，标记为DAPI的试管除外，该管中的沉淀重悬于500 µl FACS上样溶液中。将全部6个试管置于冰上避光保存，直至分选。

6. 细胞分选仪上的分选

注意：流式细胞仪及其软件的分选程序操作已由公司提供详细说明并实现标准化。简而言之，我们使用100微米喷嘴，压力设为20 psi，目标细胞浓度设定在每毫升500万至1000万个之间，分选效率调整至70%或更高即，将冲突控制在30%以内。

  1. 准备收集用的 FACS 管，每管中加入含 100 U/ml 青霉素-链霉素的 500 µl FBS。
  2. 使用第 5.2 步中的单染补偿管调整细胞分选仪的补偿参数。
    1. 在未染色管中记录 10,000 个细胞，以设定每种荧光强度的阴性门。
    2. 在其他单染补偿管中记录 10,000 个细胞，以设定每种荧光强度的阳性门。
      注意：软件将自动计算补偿参数。
  3. 取第 5.1 步中的一个样本，记录 3,000 个细胞以设定待分选细胞群体的门。以荧光强度作为 X 轴和 Y 轴的参数，在图上手动圈选目标细胞群体，使其表现为明显与其他细胞点分离的一群点。
    注意：该设门策略可根据研究人员的需求灵活调整。若研究人员希望基于一个或多个标记物获得更高纯度的细胞，可根据相应的荧光强度将门设得更高。
  4. 装载收集管并开始分选目标细胞群体。
  5. 分选完成后，将收集管置于冰上保存，直至所有样本管处理完毕。
  6. 向收集管中加入预冷的 C10 至总体积达 4 ml，盖紧管盖并颠倒混匀。
  7. 将收集管在 800 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，然后吸去上清液，保留约 200 µl 液体，避免扰动细胞沉淀。
  8. 加入 1 ml 预冷的 C10 重悬细胞沉淀，并将全部细胞悬液转移至 1.5 ml 离心管中。
  9. 将 1.5 ml 离心管在 800 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，吸去上清液，保留约 100 µl 液体，避免扰动细胞沉淀。
  10. 将分选后的细胞群体置于冰上保存，待后续使用。

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结果

我们的目标是从年轻和年老的 MRL/lpr 狼疮易感小鼠中，以高纯度富集骨髓中的 pDC，并排除其他细胞类型的干扰，以研究 pDC 在产生 IFNα 能力方面的功能变化。首先采用的纯化策略是 MCS，该方法 图1 显示，在富集后纯度仅为7.75%。与MCS相比，FACS富集的pDC纯度高达96.4%。为确保高纯度，采用了逐步设门策略。如图所示 图2单个核细胞通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数设门，以区分并排除碎片。利用FSC-宽度（FSC-W） 与 FSC-高度（FSC-H）与SSC-W 对比 SSC-H，通过圈选单细胞以排除聚集体产生的假阳性信号。随后，以DAPI标记的活单细胞被圈选为门控目标。- 种群（DAPI+ 细胞处于死亡或凋亡状态）。从活的单个细胞中，CD11c+CD11b- 群体被设门，从中选取B220+PDCA-1+ 群体进一步设门...

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讨论

本论文所述方案旨在高纯度富集仍具有产生干扰素α（IFNα）能力的活体浆细胞样树突状细胞（pDC）。该方案的应用范围包括但不限于从MRL/lpr小鼠及其他品系小鼠的骨髓中纯化pDC和/或任何其他单核细胞，用于细胞与分子功能研究。本方案中有多个关键步骤，以确保分选所得pDC具有高存活率和高纯度。第一个关键步骤是从骨骼中释放骨髓。为尽量减少对骨髓细胞的损伤，应轻柔敲裂骨骼，并用研杵轻轻搅拌，避免猛烈砸碎骨骼。第二个关键步骤是利用密度梯度介质富集单核细胞。在加载细胞悬液时，必须在下层（密度梯度介质）与上层（细胞悬液）之间形成清晰的界面。离心条件也至关重要，以确保形成主要含单核细胞的中间白膜层。离心后，骨碎片、红细胞和高密度的中性粒细胞被排除在白膜层之外，沉于离心管底部。第三个关键步骤是在低温条件（冰上或4 °C）下用荧光标记抗体孵育细胞。染色后，充分洗涤细胞也非常重要，以确保抗体特异性结合，并最大限度减少细胞分选仪可检测到的非特异性结合或背景信号。最后，单染补偿管对于调整补偿参数至关重要且必不可少，以确保细胞分选仪仅检测和分析正确的信号。除使用分离的脾细胞进行补偿外，当细胞数量有限时， commercially available compen...

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披露

作者声明，本文的发表不存在利益冲突。

致谢

我们感谢弗吉尼亚-马里兰兽医学院流式细胞术实验室提供流式细胞术核心设施的使用支持。本工作由XML的启动资金资助。XL是生物医学与兽医科学研究生项目中的斯达姆斯研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
胎牛血清HyCloneSH30396.03
丙酮酸钠gibco by life technologies11360-070
MEM 非必需氨基酸gibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-巯基乙醇gibco by life technologies21985-023
L-谷氨酰胺 gibco by life technologies25030-164
青霉素-链霉素gibco by life technologies15140-122
1× Hank’s 平衡盐溶液 gibco by life technologies14175-079
MACS BSA 储存液Miltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNase ISIGMAD4527
红细胞（RBC）裂解缓冲液 eBioscience00-4300-54
密度梯度介质GE Healthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
抗小鼠 CD19-PEBD Pharmingen553786
抗小鼠 CD11c-PEeBioscience12-0114-82
抗小鼠 CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
抗小鼠 PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
抗小鼠 B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
浆细胞样树突状细胞分离试剂盒 II，小鼠Miltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I 流式细胞仪 BD Biosciences643178
BD FACS Diva 版本 6BD Biosciences

参考文献

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