利用荧光激活细胞分选法从鼠骨髓中纯化浆细胞样树突状细胞

摘要

我们报道了一种利用荧光激活细胞分选技术从易患狼疮小鼠的骨髓中高纯度分离浆细胞样树突状细胞（pDC）的方案，用于pDC的功能研究。

摘要

荧光激活细胞分选（FACS）是一种基于流式细胞术检测表型来纯化特定细胞群体的技术。该方法使研究人员能够在不受其他细胞干扰的情况下，更深入地了解单一细胞群体的特性。与其他细胞富集方法（如磁珠激活细胞分选（MCS））相比，FACS凭借流式细胞术的表型检测能力，在细胞分离方面具有更高的灵活性和准确性。此外，FACS通常能够同时分离多个细胞群体，从而提高实验的效率和多样性。尽管FACS存在一定的局限性，但它已被广泛应用于功能研究中细胞的纯化，无论是在 体外 和 体内 设置。本文报道了一种利用荧光激活细胞分选技术，从易感狼疮小鼠的骨髓中高纯度分离极稀有免疫细胞群体——浆细胞样树突状细胞（pDC）的实验方案，用于 体外 pDC的功能研究

引言

从其他细胞中高效分离出目标细胞群体，使得对这些特定细胞的研究成为可能，而这些研究在其他情况下往往难以实现。^1,2 荧光激活细胞分选（FACS）是一种能够以高纯度富集特定细胞群体的方法。不同类型的细胞通常在细胞质膜上表达独特的分子，或多种分子的独特组合，从而能够将一个细胞群体与其他群体区分开来。当特异性荧光标记抗体与这些细胞表面分子结合后，一种称为流式细胞仪/分选仪的检测设备即可激发并检测来自不同荧光染料的光信号，从而在单细胞水平上识别细胞上不同分子标记物的表达情况。这些信息综合起来，包括光信号的存在（代表相应表面分子的阳性表达）或光信号的缺失（代表分子的阴性表达），共同定义了细胞的表型。在通过检测器后，具有相同目标表型的细胞会根据其电荷被引导至指定的收集管中。

只要待富集的细胞群体带有荧光标记，流式细胞分选（FACS）便可广泛应用于各类研究中。^3-7 该技术已被用于从肠道微生物群中分离免疫球蛋白（Ig）A包被的细菌与非IgA包被的细菌⁸，以及分选表达荧光蛋白的基因工程细胞群体。⁹ 重要的是，FACS能够同时分离多个细胞群体，这不仅节省时间和试剂，还支持更复杂的研究设计。¹⁰ 然而，FACS也存在局限性。若目标细胞群体极为稀少（少于1%），分选效率可能降低，导致显著的细胞损失。此外，某些抗体结合可能激活细胞内信号转导，从而诱导分选后细胞群体的功能改变。¹¹

方案

注意：MRL/Mp-Fas^lpr（MRL/lpr）狼疮易感小鼠在弗吉尼亚理工学院（Virginia Tech）机构动物照护与使用委员会（IACUC）（动物福利保证编号：A3208-01）规定的特定病原体-free设施中进行繁育和饲养。本研究严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物照护与使用指南》中的建议进行。所有动物实验均在IACUC方案编号#12-062下开展。

1. 细胞培养基和分选缓冲液

1. 使用 RPMI 1640 培养基配制完全细胞培养基（C10），添加 10% 胎牛血清、1 mM 丙酮酸钠、1% 100 MEM 非必需氨基酸、10 mM HEPES、55 µM 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和 100 U/ml 青霉素-链霉素。
2. 使用 1× Hank's 平衡盐溶液（HBSS）配制分选缓冲液（HBSS-full），添加 10 mM HEPES、2.5 mg/ml 牛血清白蛋白、0.05 mM MgCl₂ 和 0.2 U/ml DNase I。

2. 小鼠解剖

1. 准备两个直径为6 cm的培养皿，每皿中加入4 ml C10。将培养皿置于冰上。
2. 通过吸入CO₂处死小鼠。
3. 取出脾脏，并将其保存在盛有C10并置于冰上的....

结果

我们的目标是从年轻和年老的 MRL/lpr 狼疮易感小鼠中，以高纯度富集骨髓中的 pDC，并排除其他细胞类型的干扰，以研究 pDC 在产生 IFNα 能力方面的功能变化。首先采用的纯化策略是 MCS，该方法 图1 显示，在富集后纯度仅为7.75%。与MCS相比，FACS富集的pDC纯度高达96.4%。为确保高纯度，采用了逐步设门策略。如图所示 图2单个核细胞通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数设门，以区分并排除碎片。利用FSC-宽度（FSC-W） 与 FSC-高度（FSC-H）与SSC-W 对比 SSC-H，通过圈选单细胞以排除聚集体产生的假阳性信号。随后，以DAPI标记的活单细胞被圈选为门控目标。^- 种群（DAPI⁺ 细胞处于死亡或凋亡状态）。从活的单个细胞中，CD11c⁺CD11b^- 群体被设门，从中选取B220⁺PDCA-1⁺ 群体进一步设门.......

讨论

本论文所述方案旨在高纯度富集仍具有产生干扰素α（IFNα）能力的活体浆细胞样树突状细胞（pDC）。该方案的应用范围包括但不限于从MRL/lpr小鼠及其他品系小鼠的骨髓中纯化pDC和/或任何其他单核细胞，用于细胞与分子功能研究。本方案中有多个关键步骤，以确保分选所得pDC具有高存活率和高纯度。第一个关键步骤是从骨骼中释放骨髓。为尽量减少对骨髓细胞的损伤，应轻柔敲裂骨骼，并用研杵轻轻搅拌，避免猛烈砸碎骨骼。第二个关键步骤是利用密度梯度介质富集单核细胞。在加载细胞悬液时，必须在下层（密度梯度介质）与上层（细胞悬液）之间形成清晰的界面。离心条件也至关重要，以确保形成主要含单核细胞的中间白膜层。离心后，骨碎片、红细胞和高密度的中性粒细胞被排除在白膜层之外，沉于离心管底部。第三个关键步骤是在低温条件（冰上或4 °C）下用荧光标记抗体孵育细胞。染色后，充分洗涤细胞也非常重要，以确保抗体特异性结合，并最大限度减少细胞分选仪可检测到的非特异性结合或背景信号。最后，单染补偿管对于调整补偿参数至关重要且必不可少，以确保细胞分选仪仅检测和分析正确的信号。除使用分离的脾细胞进行补偿外，当细胞数量有限时， commercially available compen.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
胎牛血清	HyClone	SH30396.03
丙酮酸钠	gibco by life technologies	11360-070
MEM 非必需氨基酸	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-巯基乙醇	gibco by life technologies	21985-023
L-谷氨酰胺	gibco by life technologies	25030-164
青霉素-链霉素	gibco by life technologies	15140-122
1× Hank’s 平衡盐溶液	gibco by life technologies	14175-079
MACS BSA 储存液	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl2	SIGMA	M8266
DNase I	SIGMA	D4527
红细胞（RBC）裂解缓冲液	eBioscience	00-4300-54
密度梯度介质	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
抗小鼠 CD19-PE	BD Pharmingen	553786
抗小鼠 CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
抗小鼠 CD11b-APC-CY7	BD Pharmingen	557657
抗小鼠 PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
抗小鼠 B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
浆细胞样树突状细胞分离试剂盒 II，小鼠	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I 流式细胞仪	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva 版本 6	BD Biosciences