荧光激活细胞分选从小鼠骨髓浆树突状细胞的分离纯化

摘要

我们使用荧光激活细胞分选来分离浆细胞样树突细胞（PDC）与来自狼疮易感小鼠的骨髓供的pDC的功能研究的高纯度报告的协议。

摘要

荧光激活细胞分选 （FACS） 是一种根据流式细胞术检测到的表型纯化特定细胞群的技术。这种方法使研究人员能够在不受其他细胞影响的情况下更好地了解单个细胞群的特征。与其他细胞富集方法（如磁激活细胞分选 （MCS））相比，FACS 由于能够通过流式细胞术进行表型检测，因此在细胞分离方面更加灵活和准确。此外，FACS 通常能够同时分离多个细胞群，从而提高实验的效率和多样性。尽管 FACS 有一些局限性，但它已被广泛用于纯化细胞，用于体外和体内功能研究。在这里，我们报告了一种使用荧光激活细胞分选的方案，从狼疮易感小鼠的骨髓中分离出一种非常罕见的免疫细胞群，浆细胞样树突状细胞 （pDC），纯度高，用于 pDC 的体外功能研究。

引言

将所选细胞群与其他细胞有效分离，从而能够对细胞群进行研究，否则可能无法进行研究。荧光激活细胞分选 （FACS） 是一种以高纯度富集感兴趣的细胞群的方法。^1,2 不同的细胞类型通常在质膜上表达独特的分子或多个分子的独特组合，这些分子可以区分一个细胞群与另一个细胞群。当这些细胞表面分子与特异性荧光偶联抗体结合后，称为流式细胞仪/分选仪的检测机能够激发和检测代表细胞上不同分子标志物的不同荧光染料的光信号。由光信号的存在（代表相应表面分子的阳性表达）或光信号的不存在（代表分子的阴性表达）组成的组合信息定义了细胞的表型。通过检测器后，具有相同目标表型的细胞根据电荷被转移到指定的收集管。

FACS 在各种研究中得到广泛应用，只要要富集的群体用荧光标记即可。^3-7 它已被用于分离肠道微生物群中免疫球蛋白 （Ig）A 包被的细菌和非 IgA 包被的细菌 ⁸，并对表达荧光蛋白的基因工程细胞群进行分类。⁹ 重要的是，它能够同时分离多个群体，这不仅节省了时间和试剂，还允许进行更复杂的研究设计。¹⁰ 然而，FACS 也有其局限性。如果感兴趣的群体非常罕见（小于 1%），则分选效率可能会降低，从而导致大量细胞损失。此外，一些抗体结合可能会激活细胞内信号转导，从而诱导分选细胞群的功能变化。¹¹ 因此，应仔细选择用于排序的表型。

除了 FACS 之外，还有其他方法也基于细胞表面标志物来富集特定细胞群，例如磁激活细胞分选 （MCS）。¹² 与 FACS 类似，磁珠偶联抗体可以靶向特定的细胞表面分子。在抗体-抗原相互作用时，磁珠包被的细胞在通过磁场后可以与未包被的细胞分离。然而，MCS 中只能靶向有限数量的分子，因为与 FACS 中的各种荧光颜色不同，磁珠无法区分。因此，MCS 很难定义具有复杂表面标志物组合的细胞表型。^13,14 此外，MCS 还能够导致靶细胞的意外激活。

在我们对系统性红斑狼疮 （SLE） 小鼠模型的研究中，¹⁵ 我们打算纯化浆细胞样树突状细胞 （pDC），以研究它们随疾病进展而发生的功能变化。我们首先使用 MCS 通过靶向 PDCA-1 从骨髓中富集 pDC，PDCA-1 是一种在稳态下在小鼠 pDC 上高度独特表达的分子。¹⁶ 然而，细胞纯度出乎意料地低，这可能是由于 PDCA-1 在炎症环境（如 SLE）中的其他细胞群上调。¹⁶ 最终，我们使用了四种表面标志物（CD11c、CD11b、B220 和 PDCA-1）的组合 FACS 来分离高纯度 pDC，作为 CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ 群体。小鼠 pDC 具有另一个特异性表面标志物 Siglec-H。我们决定不使用 Siglec-H，因为该分子的抗体结合会抑制 pDC 产生 IFNα 的功能。¹¹

方案

注:MRL / MP-FAS ^LPR狼疮易感小鼠饲养，并保持在以下机构动物护理和使用委员会（IACUC）在弗吉尼亚理工大学（动物福利保障号码要求的无特定病原体设施（MRL / LPR）: A3208-01）。本研究是在严格按照指南中的建议，美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用进行。所有动物实验均根据IACUC协议＃12-062进行。

1.细胞培养基和排序缓冲区

1. 准备完整的细胞培养基（C10），使用RPMI 1640补充有10％胎牛血清，1mM的丙酮酸钠，1％100 MEM非必需氨基酸，10毫米的HEPES，55μM2-巯基乙醇，2mM的L-谷氨酰胺和100U / ml的青霉素 - 链霉素。
2. 制备分拣缓冲液（HBSS满），使用1×Hank氏补充有10mM HEPES平衡盐溶液（HBSS），2.5毫克/毫升牛血清白蛋白，0.05毫米氯化镁₂和0.2 U / ml的DNA酶I.

2.鼠标解剖

1. 准备包含4毫升C10两个6厘米直径的菜肴。将餐具上的冰。
2. 安乐死的CO ₂吸入鼠标。
3. 收获脾肾保持以上ice用C10一个dish，
   1. 针按下鼠标与夹层板朝上的肚子。通过喷洒70％的乙醇消毒的机构。
   2. 切开皮肤和皮肤从肌肉壁沿着从耻骨联合到颈部腹侧中线下方分开。
   3. 切割沿从第一切口到脚踝的后肢皮肤。
   4. 针在皮肤背面的两侧，并从第一切口的地方膜片切割沿两侧的肌肉壁。
   5. 针肌壁背面的头部的右侧。
   6. 定位在小鼠小肠下方和胃旁的右侧脾脏。拿起日的一端Ë脾它从肚子分开。
4. 切都后肢了包括股骨和胫骨，并尽可能去除所有的肌肉成为可能。
   1. 切沿骨盆/髋关节用锋利的剪刀脚踝后肢肌肉，尽量避免血管。
   2. 通过在骨盆/髋关节和踝/足关节无切削的骨髓内容曝光分开后肢出来。
   3. 骨头上的清洁剩余肌肉通过用刀片反复刮伤和在接合点切割的肌肉。
5. 保持骨骼含有冰4毫升C10一个直径6cm培养皿。继续解剖下一个鼠标。

3.脾细胞分离

1. 与反对含4毫升C10，直到没有红条是可见的菜的顶部有70微米的细胞过滤注射器活塞轻轻均质脾脏。
2. 通过一个过滤器添加其他6毫升C10入菜第二则总共10个ml的细胞悬液转移到15毫升锥形管中。
3. 离心锥形管在800×g离心5分钟，4℃。
4. 离心后，吸出上清液和重悬细胞沉淀在2ml 1×红细胞（RBC）溶胞缓冲液。孵育在室温下5分钟。
5. 温育后，离心锥形管在800×g离心5分钟，4℃。
6. 离心后，吸出上清液和重悬细胞沉淀在1ml C10。放弃任何大的团块（死细胞），并保持管冰上更高版本。
   注:如果有许多小团块，用一个70微米的细胞过滤一次过滤细胞悬液。
7. 计数使用自动细胞计数器用锥虫蓝的细胞数。

4.骨髓细胞分离

1. 传送用4ml C10骨头研钵中，加入6毫升C10，使在总10毫升C10的体积。
2. 通过使用AP轻轻敲碎骨头砂浆estle。
3. 用杵释放骨髓成C10轻轻搅拌。
4. 通过一个70微米的细胞滤网转移含有骨髓10毫升C10到50毫升锥形管在冰上。加10毫升的新鲜C10成仍含有骨头砂浆。
   注:含吸取骨髓上下几次通过过滤网，如果红色团块可见之前的解决方案。
5. 重复步骤4.2至4.4倍。最后一次洗涤后，骨头应该显示为白色。
6. 离心50ml锥形管中，在800×g离心5分钟，4℃。同时，准备5毫升现成使用密度梯度介质中在RT 15毫升锥形离心管中。
7. 离心后，吸出上清液和重悬细胞沉淀在10ml C10。
8. 慢慢层上中的5毫升的密度梯度介质的顶部10 ml的细胞悬液中，并保持两相之间的明确的界面。然后离心15毫升锥形管在1363克在30分钟RT（20°C）以设置的加速度为9和减速设置为0（或制动OFF）。
9. 离心后，小心地取出顶部8ml上述溶液，并收集在界面（单核细胞的层）2 mL萃取棕黄层到一个新的15毫升锥形管中。
10. 基础上加12 1ml冰冷C10到15毫升锥形管含有骨髓单个核细胞，帽和颠倒几次拌匀，然后在800 XG离心管10分钟，4℃。

5.细胞表面染色用于FACS

1. 样品染色
   1. 制备抗小鼠CD16 / 32抗体溶液（1至100稀释于HBSS-充分，5微克/毫升的最终浓度）。
   2. 在步骤4.10离心后，吸出上清液和重悬细胞沉淀在100μl抗小鼠CD16 / 32的抗体溶液以阻止在单核细胞Fc受体。在冰上孵育10分钟。
   3. 制备荧光缀合的抗体混合物（蚂蚁的i-小鼠的CD11c-PE的1点40稀释，抗 - 小鼠的CD11b-APC-CY7 1:80稀释，抗 - 小鼠PDCA-1-FITC 1点40的稀释和抗小鼠B220-V500 1点40稀释在HBSS-满于每个样品100μl的最终体积）制造商推荐的。
      注意:使用前滴定的抗体是非常重要的。
   4. 10分钟温育在步骤5.1.2后，加入4ml冰冷的HBSS-充分和离心机在800×g离心5分钟，4℃以除去未结合的抗小鼠CD16 / 32。
   5. 离心后，吸出上清液并重新悬浮于100μl荧光缀合的抗体混合物的细胞沉淀。冰上孵育在黑暗中15分钟。
   6. 15分钟温育后，加入4ml冰冷的HBSS-充分和离心机在800×g离心5分钟，4℃以除去未结合的荧光标记的抗体。
   7. 准备FACS装载溶液（500毫微克/毫升的DAPI在HBSS满）。
   8. 在步骤5.1.6离心后，吸出上清液，重悬在500μ细胞沉淀; l FACS负载的解决方案。细胞悬液转移到12×75mm的圆底管（FACS管），并保持在管上在黑暗中冰上直至1小时内分选。
2. 染色赔偿
   1. 标签6 FACS管为PE，APC-CY7，FITC，V500，DAPI或不染。以1×10 ^6个细胞/管进入FACS管，和等分脾细胞用4ml的HBSS-充分洗涤，在800×g离心5分钟，4℃。
      注意:使用DNA结合的荧光染料，DAPI，从死细胞区分活细胞。 DAPI可以穿过死细胞的质膜（但不是活细胞），并结合染色体的DNA。
   2. 吸上清，悬浮细胞沉淀在100微升HBSS满。
   3. 在每一个相应的FACS管中，加入下列抗体之一:抗鼠CD19-PE 1:40稀释，抗小鼠的CD11b-APC-CY7 1:80稀释，抗小鼠PDCA-1-FITC 1:40稀释或所推荐的厂家专业抗小鼠B220-V500 1:40稀释cturer。离开^第 5（DAPI）和^第 6 ^次 （未染色的）FACS管，因为它们。通过摇动拌匀，并在冰上所有的流式细胞仪管在黑暗中15分钟。
   4. 温育后，在800 xg离心加4ml冰冷的HBSS满到每个管中，离心FACS管5分钟，4℃。
   5. 离心后，吸出上清液并重新悬浮于500μl冰冷的细胞沉淀冷HBSS满除了在管标记的DAPI，其再悬浮于500μlFACS加载溶液沉淀。保持所有6管冰在黑暗中，直到排序。

6.排序的细胞分选

注:上仪和软件排序程序的操作是规范与公司提供的详细的说明。简言之，我们用在20psi 100微米的喷嘴，5之间设置靶细胞浓度-在10万元左右毫升，并调整效率到70％或更高（ 即 ，冲突保持在30％）。

1. 准备用含100 U / ml青霉素，链霉素500微升FBS /管收集流式细胞仪管。
2. 采用单染色补偿管从步骤5.2调整细胞分选仪的补偿参数。
   1. 记录10,000个细胞中未染色的管设置负门对每个荧光强度。
   2. 记录10,000个细胞在其他单污点补偿管设置正栅极每个荧光强度。
      注意:软件自动计算补偿参数。
3. 从步骤5.1使用一个样本通过记录3000细胞组分类的细胞群的大门。使用荧光强度为X轴和Y轴曲线图中，栅极靶细胞群体手动作为一组从其他点明显分开的点的参数。
   注意:此浇口套是柔性的和任意基于研究人员的要求。如果研究人员期望基于一个或多个标记物纯度较高，将栅极更高根据相应的荧光强度。
4. 装入收集管，并开始排序的靶细胞群。
5. 保持收集管冰排序，直到所有的样品管完成之后。
6. 冰冷的C10添加到收集管达4毫升，帽和反转混合。
7. 离心收集管，在800×g离心5分钟，4℃，然后吸出上清液，留下约200微升与细胞沉淀不变。
8. 加入1ml冰冷的C10至重悬细胞沉淀，并转移所有细胞悬浮到1.5毫升离心管中。
9. 离心机在800×g离心5分钟，4℃1.5 ml管和吸出上清液，留下100微升与细胞沉淀不变。
10. 储存在冰上排序的细胞群，直到使用。

结果

我们的目的是丰富的骨髓PDC上高纯度，且无其它细胞类型的影响，从年轻和老年学习的PDC对他们产生IFNα能力的功能变化的MRL / lpr狼疮狼疮易感小鼠。使用的第一纯化策略是MCS，其中， 如图1所示，导致只有7.75纯度％的富集。相比于MCS，FACS丰富的pDC，纯度高达96.4％。以确保高纯度，进行一步一步门控策略。正如图2所示，单核细胞进行门控，并通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数从碎片分离。利用FSC-宽度（FSC-W） 与 FSC高度（FSC-H）和SSC-W与SSC-H，单个细胞进行门控，以避免由聚集体产生的假阳性信号。接活的单细胞被门控的DAPI ^-人口（DAPI ⁺细胞死亡或凋亡）。从活的单细胞，CD11c的⁺ CD11b的^-人口门控，从中B220 ⁺ PDCA-1 ⁺人口进一步门控为PDC。排序后的pDC不仅纯度高，而且功能...

讨论

本手稿中描述的方案用于高纯度富集保留产生IFNα能力的活pDC。该协议的应用包括但不限于从MRL / lpr的骨髓和任何其他小鼠品系中纯化pDC和/或任何其他单核细胞，以研究细胞和分子功能。该协议中的几个关键步骤是确保分选的pDC的高活力和纯度。第一个关键步骤是从骨骼中释放骨髓。为了尽量减少对骨髓细胞的破坏，重要的是轻轻敲碎骨头并搅拌杵，而不是砸碎骨头。第二个关键步骤是用密度梯度培养基富集单核细胞。在加载细胞悬液时，在下相（密度梯度培养基）和上相（细胞悬液）之间建立清晰的界面至关重要。离心条件对于主要包含单核细胞的血沉棕黄层的形成也至关重要。离心后，骨碎片、红细胞和高密度中性粒细胞被排除在血沉棕黄层之外，并留在管的底部。第三个关键步骤是将细胞与荧光偶联抗体在低温（冰上或4°C）下孵育。染色后，广泛清洗细胞以确保特异性抗体结合，并将假阳性或背景信号降到最低，细胞分选仪很容易检测到。最后，单染色补偿管对于调整补偿参数非常重要且必要，以确保在细胞分选机上仅测量和分析正确的信号。除了使用分离的脾细胞进行补偿外，如果细胞有限，市售的补偿珠也可以作为替代方案。在这项特殊的研究中，由于我们需要富集尽可能多的 pDC 以进行进一步的功能研究，为了避免骨...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	gibco	11875-093
胎牛血清	HyClone	SH30396.03
丙酮酸钠	gibco	11360-070
MEM 非必需氨基酸	gibco	11140-050
HEPES	gibco	15630-080
21985-023		2-巯基乙醇	Gibco
	Life Technologies 的 gibco	25030-164
青霉素-链霉素	gibco by life technologies	15140-122
1x Hank's 平衡盐溶液	gibco by Life Technologies	14175-079
MACS BSA 原液	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl2	SIGMA	M8266
DNase I	SIGMA	D4527
红细胞 （RBC） 裂解缓冲液	eBioscience	00-4300-54
密度梯度培养基	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
抗小鼠 CD19-PE	BD 药	553786
抗小鼠 CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
抗小鼠 CD11b-APC-CY7	BD 药	557657
抗小鼠 PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
抗小鼠 B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
浆细胞样树突状细胞分离试剂盒II，小鼠	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I 流式细胞仪	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva 第 6 版	BD Biosciences