水滴作为酶促微反应器及其电磁驱动

摘要

液滴实验室反应系统可在微流控尺度下灵活地实现复杂反应。已开发出由3×3电磁线圈阵列组成的自动驱动平台，并成功用于合并两个10 µL的微反应器，从而在生成的液态弹珠中启动酶促反应。

摘要

为了成功实现微流控反应系统（如PCR和电泳）的应用，微量液体的操控至关重要。在传统的芯片实验室平台中，溶剂和样品需通过具有复杂流体控制装置的特定微流控通道进行传输。本文介绍的液滴驱动平台是一种颇具前景的替代方案。该平台可在反应基底（即“液滴实验室”）的平面表面上移动液滴（微反应器）。微反应器在平台疏水表面的驱动依赖于作用在液滴外层上的磁力，该外层由一层超疏水性磁铁矿颗粒构成。平台的疏水表面可避免液滴核心与基底之间的任何接触，从而实现微反应器的顺畅移动。在该平台上，可同时定位并移动一个或多个体积为10 µL的微反应器。平台本身由一个3×3排列的双线圈阵列组成，线圈中可装入钕磁铁或铁磁芯。磁场梯度可实现自动控制。通过调节磁场梯度，可自动操控微反应器的磁性疏水外壳，从而驱动微反应器移动，或可逆地打开外壳。通过合并微反应器或将微反应器与固定在表面的催化剂接触，即可启动底物与其相应酶之间的反应。

引言

微反应的技术应用主要在预定义的微通道芯片中进行。这类系统已在文献中得到广泛确立和全面描述（例如^1,2,3）。2011年，全球微流控技术的市场规模达到62亿欧元⁴。相比之下，可自由移动的微反应器单元此前仅被有限地研究和报道。移动水相微液滴最常见的方法是电润湿⁵。其他驱动液滴在表面运动的方法包括利用电场⁶、磁力⁷或声学驱动⁸。由于这些基于液滴的微反应系统具有不利的表面积与体积比，因而会受到强烈的蒸发效应影响。因此，液滴运动通常采用液-液两相体系实现，其中上层相具有高沸点，以保护水相免于蒸发。然而，这种方法存在反应液滴因不受控扩散而被污染的高风险，这成为上述系统在技术上推广应用的重要障碍。

近期研究关注非黏附性液-固相变过程。一种高效的方法是使用超疏水表面，以形成球形水滴。该反应概念的进一步延伸是采用具有超疏水表面或外壳的微反应器，其可由聚四氟乙烯（PTFE）颗粒构成⁹。这类材料在表面上的接触角通常在160°左右（取决于表面粗糙度）。此类球形反应器在表面移动时阻力极小，同时可有效防止水分蒸发。

水滴表面包覆微米级PTFE颗粒后，可维持其球形形态至直径约2 mm。当体积更大时，疏水性外壳通常不再完全闭合。 ¹⁰通过使用离子液体，Gao 和 McCarthy 实现了其他壳材料的影响以及将液态弹珠的应用领域扩展至非极性溶剂 ¹²对于疏水性颗粒基外壳的形成，迄今为止已有直径在10 nm至30 µm范围内的颗粒被报道 ^11,14,16新研究显示，作为壳材料的疏水性纳米颗粒比微粒更为有效。 ¹³初步稳定性研究表明，当粒径从 约 600 nm 至 约 100 nm。这可能是由于在水相球体周围颗粒分布更密集所致。 ¹⁵.

由疏水外壳保护水相反应腔室并将其命名为液滴弹珠（liquid marbles）的概念，最早于2001年由Aussillous描述。 等 和 Mahadevan 等 ^17,18此后，这些明确定义的反应区域的应用报道较少。例如，一种基于液体弹珠的气体传感器 ¹⁹ 并已开发出一种基于光学定性原理的水质污染检测方法 ²⁰作者强调了其微反应系统具有反应速率高和化学品消耗低的优势。近期的文献报道了pH敏感型液体弹珠的制备。 ¹⁶ 或具有两种不同功能涂层的“Janus颗粒”的制备。例如，Bormashenko 等 可合成由特氟龙和半导体炭黑制成壳层的微反应器 ²¹此外，研究还证明，微反应器能够通过可渗透的气液界面吸收外部氧气作为共聚单体，从而高效且便捷地合成聚过氧化物。 ²⁴在另一种方法中，基于二氧化硅颗粒的液态弹珠外壳提供了反应性基底表面，以调控经典的银镜反应。 ²⁶目前，亲水核-疏水壳液滴在研发领域面临的问题包括颗粒尺寸调控、单分散液滴的可重复制备、表面润湿性，以及第二层亲水壳对微反应区室的影响。 ²²以及对液滴轨迹的更好控制， 例如 用于连续微流控PCR系统的开发 ⁴.

对这些微反应器进行磁驱动具有在生化系统中实现相对较大幅度运动以及良好力选择性的优势。使用疏水性磁铁矿颗粒时，它们不仅能够将磁力传递至微反应器以实现其运动，同时还起到疏水外壳的作用。2006年，Lehmann et al. ²³ 与 Shikida et al. ²⁵ 首次提出在液滴内部含有磁性颗粒的情况下，通过手动移动永磁体作为驱动器来操控单个液滴的运动。另一种移动少量液体的方法由 Zhao et al. 实现，他们将疏水性 Fe₃O₄ 粒子用作磁性外壳。通过施加垂直反向磁场，可在液滴顶部打开磁性液态弹珠的外壳²⁷。基于此概念，Xue et al. 成功开发出可形成表面张力为 20.1 dyne cm⁻¹ 的微反应器的颗粒²⁸。Lin et al. 制备了新型基于纤维素的微/纳米分级球体，兼具超顺磁性和超疏水性，为磁性液滴的运输与操控提供了良好的稳定性³¹。然而，该研究迄今仅作为原理验证性研究发布，尚未应用于任何实际场景。目前，对液态弹珠的磁控与电控正处于初步探索阶段。Zhao et al.（2010年）¹⁵ 与 Zhang et al.（2012年）²⁹ 已实现通过手动操作位于核壳结构液滴下方的永磁体来操控液滴。Bormashenko et al. ¹¹ 通过靠近钕磁体，使铁磁性液态弹珠加速至 25 cm s^-1 的速度。上述原理性研究均完全依赖手动移动小型永磁体完成。作为进一步的发展，Zhao et al. 近期通过调节永磁体的距离，估算了驱动磁性液态弹珠所需磁通密度的阈值³⁰。要实现与常规芯片实验室系统相当的反应控制，对离散液体体积进行自动化控制似乎是不可避免的。为满足这一需求，我们开发了一种基于可变场梯度的新控制体系，用于固定、移动和开启磁性微反应器。

方案

1. 磁性纳米颗粒的疏水化

1. 为合成疏水性磁性颗粒，加入0.85 g FeCl₃ 六水合物（3.14 mmol）和 0.30 g FeCl₂ 四水合物（1.51 mmol）加入200 mL水/乙醇溶液（4:1 v/v）中。
2. 向该混合物中加入0.20 mL 1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷（PFOTES）（5.23 mmol），并在磁力搅拌器（500 rpm）剧烈搅拌下混合。在惰性气体氛围（N₂）中进行合成反应。₂使用圆底烧瓶并用软木塞密封，以防止磁铁矿颗粒发生二次氧化。
3. 使用氨水溶液（1.5 M）将溶液逐滴调节至 pH 8（pH 值由 pH 计测定）。使用磁力搅拌器搅拌溶液 24 小时。
4. 将烧瓶置于条形磁铁（钕铁硼长方体磁铁 40 × 20 × 10 mm，吸附力 25 kg）上，通过磁力将颗粒从溶液中分离。保持磁铁吸附在烧瓶底部，倾倒出溶液。
5. 用条形磁铁按照1.4)中的描述，使用水/乙醇溶液洗涤颗粒三次。在60 °C下干燥颗粒24小时（产率 约 0.43 g
6. 按照制造商的说明，使用扫描电子显微镜分析颗粒。

2. 微反应器的制备

1. 使用玻璃研杵将所有干燥的颗粒轻轻研磨，随后将全部颗粒直接放入称量盘（46 × 46 × 8 mm，聚苯乙烯材质）中。
2. 用移液器将10 µL反应溶液（成分见5.1节）滴加到所有颗粒上，并轻轻以圆形方式移动称量盘约10秒（10 µL微反应器的颗粒质量：约 3.2 × 10^-7 kg ³³）。将未围绕反应溶液自组装的剩余颗粒在室温下保存，以备后续使用。
3. 为测量微反应器的接触角，使用水构建一个5 µL的微反应器（如2.2节所述），将其置于聚四氟乙烯膜上，并按照制造商说明，使用光学接触角测量仪分析接触角。

3. 线圈体的3D打印

1. 设计双线圈主体，高度为16 mm（单腔），直径为10 mm，内径为 约 4 mm，具体操作请参照制造商说明使用CAD软件进行。
2. 使用聚乳酸丝等材料，按照制造商说明通过3D打印机打印线圈主体。使用计算机控制的绕线机，以0.08 mm铜线在线圈主体上缠绕4,500匝。

4. 驱动平台的制备

1. 将双线圈排列成矩阵（例如 3 × 3 矩阵）安装在带有下方帕尔帖元件的电路板上，将双线圈旋紧并通过扁平电缆连接至控制器（图3).
2. 根据所需的应用，加入一个铁芯（32 mm 高，4 mm 直径）或一个钕磁铁（12.5 mm 高，4 mm 直径，1,035 kA m⁻¹）^-1) 连接到线圈主体，以获得更强的磁场。
3. 在完成平台搭建时，将一块平板（推荐使用石英玻璃）放置于线圈基质上，平板最大高度为1 mm。
4. 将微反应器放置在平台表面。
5. 使用4.1节中所述的控制器启动内部含有钕磁铁的线圈，以从反应溶液中吸出上层颗粒，从而打开微反应器；要再次关闭微反应器，则关闭线圈。
6. 将两个初始分离的微反应器合并 约 10 mm 间距处，使用 4.2 节所述的钕磁铁。通过激活线圈，将所需线圈体中的磁铁抬起 约 25秒内打开一个微反应器（微反应器与磁铁之间的所需距离约为12 mm），并将另一个微反应器移动至平台上的相同位置。
7. 关闭平台表面微反应器下方线圈矩阵底部的帕尔帖元件，以降低微反应器中反应溶液的温度，并降低线圈温度（如4.1）所述。

5. 通过合并微反应器进行酶促反应

1. 将辣根过氧化物酶溶解至浓度为 0.1 µg/mL^-1 在磷酸钾缓冲液（0.1 M，pH 6.5）中稀释底物10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪（10 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO）），使其终浓度为200 µM。
2. 使用上述每种溶液各10 µL，按照2.2)中的描述构建两个微反应器。通过磁力（钕铁硼圆柱磁铁：12.5 mm × 4 mm，1,035 kA/m）将两个微反应器合并。^-1如4.6节所述，在25 °C下进行。
3. 通过将荧光探针（激发波长：570 nm，发射波长：585 nm）置于适当位置来检测反应 约 在合并前，位于打开的微反应器正上方10 mm处。

结果

壳颗粒的直径约为 640 nm。包封在该氟硅烷壳颗粒内的磁性纳米颗粒直径范围在 22 nm 至 37 nm 之间。以水为液核的 5 µL 微反应器接触角约为 160°。

移动如上所述的10 µL微反应器所需的力为1.34 ± 0.08 µN。图1展示了由4,500匝铜线绕组和内铁芯构成的线圈在通以58 mA电流时所产生的电磁力。通过有限元模型（FEM）估算力的分布，以确定驱动微反应器所需的线圈参数。如图1所示，该线圈所产生的磁力足以驱动微反应器移动至距离线圈中心超过10 mm的位置。

打开微反应器所需的磁力为 0.85 ± 0.05 mN，远高于移动液滴所需的力。由于带铁芯的线圈（

讨论

为了成功应用微流控技术，根据生物技术合成与分析的需求来移动相应的反应体积至关重要。本文介绍的驱动平台可通过磁力实现微流控液滴的移动。通过使用磁性超疏水外壳包裹液滴，可在反应平台的平面表面实现液滴在二维空间内的自由移动。该方法提供了一种替代传统微流控系统中预设微通道及复杂流体控制装置的新体系，用于传递溶剂和样品。因此，对微小反应液滴的自动化驱动显著简化了现有的芯片实验室平台。此外，该平台还能够可逆地打开微反应器，以添加或移除反应样品。结合分配系统，可实现高度自动化的反应控制，这是迈向 计算机模拟 虚拟液滴实验室中可设计的微反应。该技术的主要局限在于微反应器只能使用小体积构建（最大至 约 30 µL）。该方案中的一个关键步骤是检测微反应器内的酶促反应，因为必须适当调整荧光探针。另一种可能的检测方法是紫外/可见光光谱法。

平台的开发过程表明，直径为10 mm的电磁线圈足以实现液滴的移动。然而，填充空气或铁芯的双线圈无法产生打开微反应器外壳所需的磁力。因此，线圈中选用了钕铁硼磁芯来完成此任务。所产生的磁场梯度还可以通过磁体相对于反应平台垂直方向的电磁移动...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D 打印机	FelixPrinters	Pro1
10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪（Amplex Red）	Life Technologies	A12222
氢氧化铵	TU-KL	1072
CAD 软件	Siemens	Soled edge
接触角测量仪	Dataphysics	OCA 20
圆柱形磁铁	Webcraft GmbH	S-04-13-N	https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
磷酸氢二钾	Bernd Kraft	7758-11
干燥箱	Binder	FD 115
乙醇	Sigma-Aldrich	68-17-5
FeCl2 四水合物	TU-KL	1625
FeCl3 六水合物	TU-KL	1622
荧光探针	PerkinElmer	LS 55
辣根过氧化物酶	Carl Roth	9003-99-0
过氧化氢	Th.Geyer GmbH & Co	7722-84-1
磷酸二氢钾	Bernd Kraft	7778-77-0
帕尔贴元件	Conrad	193569
全氟辛基三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	51851-37-7
扫描电子显微镜	FEI	Helios NanoLab 650 DualBeam
分离用条形磁铁	Webcraft GmbH	Q-40-20-10-N
绕线机	IWT GmbH	FW122