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方法文章

肾内注射 大肠杆菌 在肾盂肾炎大鼠模型中

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DOI：

10.3791/54649

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2017年7月18日

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1Department of Radiology, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Case Western Reserve University, 3Department of Urology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

本文内容

摘要

本论文描述了一种通过直接肾内感染建立大鼠肾盂肾炎的外科手术模型 大肠杆菌 进入肾盂。该实验方法可用于研究肾盂肾炎的发病机制及其相关的炎症和纤维化过程。

摘要

肾盂肾炎是一种由细菌引起的肾脏感染，最常见病原体为Escherichia coli。反复感染可导致显著的肾脏炎症和纤维化，最终引起肾功能下降。在建立更有效的肾盂肾炎临床管理和预防措施之前，必须首先建立可靠的动物模型，以研究其进展机制、复发规律及治疗效果。经尿道感染模型虽能较好模拟人类肾盂肾炎，但由于依赖尿液反流将细菌输送至肾脏，存在较大个体差异。本文提供了一种详细的手术方案，通过直接向大鼠肾盂注射细菌，并经无创磁共振成像（MRI）验证。采用该方案，动物可直接暴露于设定浓度的E. coli细菌，且在适当的术后护理下能够完全恢复。这为后续对实验动物模型进行纵向MRI评估创造了条件，并可与生理盐水对照组（假手术组）进行比较。通过这种直接递送方式，感染严重程度可控，适用于疾病进展机制研究以及新型治疗策略的开发。

引言

啮齿类动物模型已被用于研究多种人类疾病表现，包括肾盂肾炎和尿路感染（UTI）。尿路感染是一个全球性的健康问题，可影响各个年龄段的儿童、男性和女性。1,2,3 尿路感染的初始表现为膀胱炎，若感染沿输尿管上行，则可能继发肾脏感染（肾盂肾炎）。与此同时，全球糖尿病患病人数已接近4亿。4,5 重要的是，在肥胖或患有2型糖尿病的患者中，尿路感染的发病率可能高达普通人群的4倍，从而增加复发性尿路感染（rUTI）、脓毒症、肾盂肾炎所致的肾纤维化以及膀胱功能障碍的风险。6,7,8 啮齿类动物模型在尿路感染研究中具有重要意义，因为目前的抗生素治疗仅在部分尿路感染患者中产生持续且预防性的效果。为了改善尿路感染的临床诊疗，关键步骤在于阐明从急性感染到炎症再到纤维化的复发性尿路感染机制及其病理生理过程，并明确2型糖尿病对其的影响。

改进动物模型的目标是开发出能够更准确评估疾病进展和治疗干预效果的技术。为了研究肾脏损伤的病理生理学、抗生素治疗的影响以及其他尿路感染自然病程的相关方面，已有多种不同方法被用于在大鼠和/或小鼠中诱导肾盂肾炎。建立逆行性尿路感染的常用方法是经尿道插管10,11,12,13。该方法通过尿道将细菌引入麻醉动物的膀胱中。尽管该技术能较好地模拟人类肾盂肾炎，但由于多种因素的影响，肾盂肾炎感染的实际发生率和严重程度可能具有高度变异性，其中包括接种期间或接种后缺乏自发性输尿管反流或排尿现象11。因此，诱导上行性肾盂肾炎感染时存在的实验变异性可能限制该模型在研究肾脏感染及治疗策略方面的应用价值。

本报告描述了一种手术诱导的肾盂肾炎大鼠模型，其中 E. coli 直接注射到大鼠肾脏中。尽管该大鼠模型具有侵入性，但其用量 E. coli 输送到肾脏的病原体可被有效控制，从而引发强烈的肾脏感染和炎症。14 在此方案中，我们还描述了如何利用纵向成像技术对这些诱导的肾脏感染进行长期监测 体内 磁共振成像（MRI）

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方案

所有动物实验均按照凯斯西储大学经批准的机构动物护理与使用委员会（IACUC）方案进行。下述手术过程持续时间约为45-60分钟。每次时间点的磁共振成像（MRI）过程本身约需15分钟。

1. 麻醉

  1. 将大鼠置于异氟烷麻醉舱中，调节异氟烷浓度为2%，并与氧气混合，以在腹腔注射麻醉剂前便于动物操作和固定。
  2. 暴露于异氟烷3-5分钟后，检查动物是否已进入麻醉状态，对足趾夹捏无反应。
  3. 通过腹腔注射给予赛拉嗪和氯胺酮混合液进行进一步镇静：氯胺酮75 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg。进行腹腔注射时，应回抽针芯，确保未刺破肠管或其他重要器官。
  4. 在切口部位皮下注射2 mg/kg布比卡因，以提供局部镇痛作用。

2. 手术区域的准备

  1. 手术器械和用品在使用前应进行灭菌处理，并放置于无菌手术垫上以维持无菌状态。大多数器械和用品可经高压灭菌后重复使用。
  2. 所有外科手术操作均应佩戴无菌手套。
  3. 使用电动剃刀剃除动物右侧的毛发，剃毛范围从肋骨下缘至后肢上部，以提供足够大的无毛区域用于手术切口。
  4. 将动物置于无菌手术垫上，以隔离已消毒区域与周围环境。
  5. 使用聚维酮碘或碘伏等消毒剂擦拭皮肤。从手术区域中心开始，以环形方式向外周擦拭。每次使用新的聚维酮碘或碘伏棉片，至少重复三次。
  6. 用70%酒精棉片擦拭手术部位，直至皮肤透明，因为碘可能具有毒性，若被吸收可能造成不良影响。

3. 手术步骤

  1. 在无菌条件下进行此操作。
  2. 将麻醉后的动物置于温热的加热垫上，取左侧卧位，右侧腰部朝上。
    注意：必须注意维持动物核心体温在 35–37 °C，以防止低体温。该加热垫也应根据需要进行灭菌，以维持无菌条件。
  3. 触摸肋骨位置，使用无菌10号手术刀片，在肋骨底部起始处，做一条长约2–3 cm的右侧背侧腹膜后切口。
  4. 沿切口两侧纵向放置无菌纱布。
  5. 分离皮下组织、脂肪和肌肉，以暴露并进入腹腔。使用弯头Mayo剪刀以深入切口并剪开较厚的组织。
  6. 当肝脏清晰可见并易于接触时，使用钝头镊子将肝脏向上牵拉。
  7. 用另一只手的另一对钝头镊子暴露右肾，使其刚好位于腹腔外。
  8. 用左手的食指和拇指固定肾脏位置。右手持无菌注射器，缓慢而稳定地向肾盂（呈现为白色小泡状结构）内注射0.1 ml UTI89 E. coli 菌液（浓度为 1 × 108–1 × 109）15。
    注意：细菌滴度的制备方法参见文献15。
  9. 在穿刺针上方放置一条可吸收止血材料，防止接种液流入腹膜腔。缓慢将针头从肾盂中抽出。
    注意：操作时应避免刺破或污染周围组织，以防造成非靶向感染和/或并发症。
  10. 在将肾脏放回腹腔前，使用较大注射器用生理盐水彻底冲洗肾脏。

4. 缝合

注意：将埋入组织内的缝线应使用4-0不可吸收编织缝线。不可使用可吸收缝线或单股缝线。 缝线可用于体表。

  1. 缝合线应均匀放置，并尽可能靠近组织边缘，以防止血流受阻；通常距离边缘不超过 0.3 cm 即可。
  2. 用一对细齿镊子夹住皮肤并轻微外翻，将持针器旋转至旋前位置，为穿刺皮肤做准备。
  3. 通过旋后手腕带动针旋转，使针穿透全层皮肤。
  4. 对靠近操作者一侧的皮肤边缘重复此过程。
  5. 收紧缝线至组织边缘对合即可。过度收紧会阻碍血液供应，延缓伤口愈合，并可能导致伤口裂开。
  6. 使用方结打结，如同单纯间断缝合一样，但仅剪断短端，留下约 3–4 mm 的线尾。
  7. 第一个缝合打结完成后，准备在距离第一个缝合约 3 mm 处进行第二个缝合，并继续进行连续缝合。
  8. 当到达切口末端时，不要将最后一针完全拉出。相反，应将持针器夹持的这一侧环状线作为短端，用于打结关闭缝合线的远端。
  9. 使用器械打结法，以方结打结。最终在远端打结处形成三条线头向上突出。

5. 动物恢复

  1. 术后腹腔注射育亨宾（Yohimbine）2.1 mg/kg以逆转麻醉。动物预计在术后3–5 小时内完全恢复。
  2. 术后将动物置于加热垫上（以防低体温），并使用吸水性软垫料。
  3. 在动物恢复常规进食前（24小时内），给予口服或肠外补液以防止脱水。术后立即腹腔注射约0.6 ml生理盐水溶液，以减轻脱水影响。
  4. 按照IACUC批准的动物护理与使用方案提供镇痛。皮下注射卡洛芬（carprofen）5 mg/kg用于疼痛管理。
  5. 定期检查切口部位是否存在肿胀、渗出、疼痛或裂开情况。

6. 验证 通过 磁共振成像

  1. 进行 in 体内 高场小型动物磁共振成像扫描仪上的磁共振成像实验。
  2. 使用3%异氟烷（溶于氧气）诱导麻醉，将动物置于MRI扫描仪中，使其右肾位于等中心位置，并配备适当的射频线圈。在整个成像过程中，通过鼻罩持续给予1-2%异氟烷以维持麻醉。
    注意：对于 体内 所示 MRI 图像 图1采用了一个大鼠尺寸的容积线圈（内径 = 72 mm）。
  3. 使用动物监测与控制系统维持每只动物的呼吸频率（40-60 次/分钟）和核心体温（35 ± 1 °C）。
  4. 采用多层多回波自旋回波 MRI 采集方法，获取感染组与对照组肾脏的高分辨率轴向 T2 加权图像。典型的 MRI 采集参数为：重复时间 = 5,000 毫秒，回波时间 = 40 毫秒，层厚 = 2.0 mm，平面内空间分辨率 = 200 µm，信号平均次数 = 3，采集时间 = 8 分钟。

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结果

医学影像技术为无创评估尿路感染（UTI）及治疗效果提供了可能。因此，本研究采用磁共振成像（MRI）验证注射 1-2 × 107 UTI89 E. coli 后急性感染的诱导情况，并可视化手术前后肾脏的变化。图1a-b 显示肾脏感染区域逐渐扩大（黄色箭头）。在感染后第1天和第4天对每只动物获取的MRI图像有助于表征急性肾盂肾炎感染的发展过程。

时间推移分析，第1-4天，MRI结果，箭头处突出显示结构变化。
图1： 感染后第（a）1天和第（b）4天由E. coli...

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讨论

啮齿类动物上行性急性肾盂肾炎 即 可通过经尿道导管术制备小鼠和大鼠的（样本/模型）。16,17,18 这种经尿道感染方法具有非侵入性的优点，并能模拟人类上行性感染的病理生理过程。17,18,19,20 然而，该方法也可能存在感染率不规则和结果变异的问题 E. coli 由于排尿等生理限制以及解剖结构的个体差异，导致向肾脏给药困难。11 菲勒尔 等 (1971) 年报道，在输注后，40 只大鼠中有 6 只（15%）肾脏显示出肾盂肾炎的证据 E. coli 进入膀胱。15

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致谢

作者谨此感谢美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所 K12 DK100014 项目（Lan Lu）、凯斯综合癌症中心（美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 P30 CA43703）以及克利夫兰临床与转化科学协作中心（美国国立卫生研究院/国家转化科学促进中心 UL1 TR000439）提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸收垫Fisher14-127-47
无菌棉纱垫Fisher22-415-469
乳胶外科手套Henry Schein Animal Health21540
弯型Mayo剪刀FisherS17341
直型钝头镊Fisher08-895
手术刀柄 Fisher08-913-5
无菌手术刀片Fisher53220
1 ml鲁尔锁注射器BD Biosciences309628用于细菌注射
20 ml鲁尔锁注射器 BD Biosciences301031用于生理盐水冲洗
止血钳Seneca Medical240267
23 G 3/4 英寸针头 BD Biosciences305143
30 G 1 英寸针头 BD Biosciences305128
U-100胰岛素注射器Exel International 25846用于药物注射
异氟烷Henry Schein Animal Health050033
赛拉嗪Henry Schein Animal Health33197腹腔注射
氯胺酮Patterson Vetrinary 07-881-9413腹腔注射
育亨宾（阿替美唑）Patterson Vetrinary 07-867-7097术后腹腔注射
布比卡因（马比卡因）Patterson Vetrinary 07-890-4584在切口部位皮下注射 
4-0铬制肠线缝合线Ethicon Inc.U203H
4-0编织聚乳酸羟基乙酸缝合线Ethicon Inc.J304H
1 ml皮下注射器BD Biosciences309597
E. coli  UTI89 或 CFT073ATCC700928
Surgicel可吸收止血剂Ethicon Inc.ETH1951CS 
Biospec 9.4T磁共振成像仪 Bruker 94/20 USR

参考文献

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