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研究玻璃粘连蛋白在细菌黏附和血清抗性中作用的实验方法

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DOI：

10.3791/54653

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2018年10月16日

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Microbiology, Department of Translational Medicine, Lund University, 2Department of Molecular Biology, Umea University

本文内容

摘要

本报告描述了表征细菌外膜蛋白与人补体调节蛋白玻连蛋白相互作用的实验方案。这些方案可用于研究玻连蛋白在任何细菌物种中的结合反应及其生物学功能。

摘要

细菌利用补体调节因子作为逃避免疫系统攻击的手段。本文描述了评估细菌表面获取的玻璃粘连蛋白（vitronectin）在抵抗宿主免疫系统中所起作用的实验方案。通过流式细胞术实验，鉴定出人血浆中的玻璃粘连蛋白是流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）f型外膜蛋白H的配体。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对纯化的重组蛋白H与玻璃粘连蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用进行表征，并利用生物膜干涉技术（bio-layer interferometry）评估其结合亲和力。通过使用正常人血清和玻璃粘连蛋白耗竭血清进行血清抗性实验，验证了玻璃粘连蛋白与细菌表面蛋白H结合在逃避免疫应答中的生物学意义。通过使用经或未经玻璃粘连蛋白包被的玻片并结合革兰染色，分析玻璃粘连蛋白在细菌黏附中的作用。最后，研究了细菌对人肺泡上皮细胞单层的黏附能力。本文所述实验方案可轻松适用于任何感兴趣的细菌物种的研究。

引言

玻璃粘连蛋白（Vn）是一种重要的人类糖蛋白，通过调控纤溶系统参与维持体内稳态。Vn 还具有补体调节功能，可在 C5b6-7 复合物形成及 C9 聚合过程中抑制终末补体通路。已有研究表明，多种细菌病原体可将 Vn 招募至细胞表面，以此抵抗补体沉积。1,2,3此外，Vn 作为一种功能分子，具有 "三明治" 细菌与宿主上皮细胞受体之间的分子，从而促进病原体的黏附和内化2,4,5Vn 与细菌细胞表面的结合由其他目前尚未明确的蛋白质介导。因此，要完全阐明 Vn 结合在逃避免疫应答中的功能作用，还需鉴定出招募 Vn 的蛋白质。

鉴定Vn结合蛋白的初始步骤是检测目标病原体是否能够结合纯化的Vn。流式细胞术是一种便捷且直接的方法，用于确定Vn是否结合到病原体细胞上。在本研究中，我们评估了Vn与多种 流感嗜血杆菌 Hif 临床分离株6该方法具有定量性，可用于区分多种细菌菌株的结合能力。在之前的一项研究中，我们将流感嗜血杆菌的蛋白H（PH）鉴定为一种与Vn结合的蛋白7因此，在本研究中，我们检测了野生型（WT）Hif 及 Hif M10Δ 的 Vn 结合能力lph 使用所述方案对突变体进行了比较。

一旦确定病原体结合Vn，第二步便是表征其表面蛋白质组，以鉴定潜在的Vn结合蛋白。可用于此目的的方法有多种8,9，但本报告未描述这些方法学。最适合研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法是将选定的细菌表面蛋白在E. coli中进行重组表达，并通过亲和层析纯化。本文以PH及其与Vn的分子相互作用为例说明该方法。重组PH与Vn之间的相互作用通过酶联免疫吸附测定（ELISA）7以及一种新近开发的无标记技术——生物膜干涉技术（bio-layer interferometry, BLI）10,11进行表征。ELISA可用于确认蛋白质-蛋白质相互作用，而BLI则可提供有关相互作用动力学参数的详细数据。

为了研究Vn在细菌黏附中的功能作用，可采用两种不同的实验方法。此处描述的第一种方法是直接测定细菌对Vn包被玻璃表面的黏附，而第二种方法则检测细菌对上皮细胞表面的黏附。在第一种实验中，将玻璃载片用Vn包被，通过革兰染色和显微镜观察评估野生型（WT）或Hif突变株的结合能力。该技术可根据细菌结合Vn的能力对其进行明确区分12。随后通过将培养的细菌加入II型肺泡上皮细胞单层中，分析细菌对哺乳动物细胞的黏附；通过计数菌落形成单位（CFUs）来评估细菌的黏附情况。在有或无Vn的条件下，可区分黏附于细胞表面的细菌与被细胞内化的细菌4,13。

通过血清杀菌实验评估了Vn获取在细菌血清抗性中的作用（即血清杀菌活性）。为了评估细菌获取Vn在血清抗性中的意义，将Vn耗竭血清（VDS）的杀菌活性与正常人血清（NHS）进行比较。该方法可根据血清抗性有效区分结合Vn与非结合Vn的细菌。我们利用该方法研究了Vn在多种细菌病原体血清抗性中的作用4,12.

已有多种方法被报道用于研究宿主与病原体之间的相互作用。本文中，我们描述了一组可轻松适用于任何病原体研究的实验方案，以评估Vn在致病过程中的作用。我们已使用多种病原体对这些方案进行了测试，本报告以Hif为例进行说明。

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方案

1. Vn作为细菌表面蛋白配体的分析

  1. 使用流式细胞术检测细菌表面的Vn结合
    注意：在流式细胞术中，我们使用侧向散射和前向散射来圈定阳性事件。为检测与Vn的相互作用，使用了Hif临床分离株（n=10）7 与……一起被选中 大肠杆菌 BL21 (DE3) 作为阴性对照（图1A).
    1. 在补充有10 µg/mL NAD和血红素的脑心浸液（BHI）培养基中，于37 °C、200 rpm振荡条件下培养Hif临床分离株。使用LB培养基进行培养 E. coli14. 在对数生长中期收获 Hif（OD600 = 0.3)15，并将细菌重悬于含1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）中（封闭缓冲液；PBS-BSA）。调整菌液至109 CFU/mL
    2. 将含有 5 x 10 的等份试样转移6 将菌落形成单位（CFU）加入至5 mL聚苯乙烯圆底试管（12 x 75 mm）中2）并加入1 mL封闭缓冲液。将悬浮液在3,500 × g 室温（RT）16 5 分钟离心使细菌沉淀，然后小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
    3. 用含有250 nM Vn的50 μL封闭缓冲液重悬细菌沉淀，在室温下不振荡孵育1小时。孵育结束后，以3,500 x g离心收集细菌沉淀 g 5 分钟，然后用 PBS 洗涤沉淀物三次，并采用相似的离心步骤。
    4. 向细菌沉淀中加入50 μL以PBS-BSA按1:100稀释的一抗——羊抗人Vn多克隆抗体（pAbs），在室温下孵育1小时，然后用PBS洗涤细菌三次，以去除未结合的抗体（操作同步骤1.1.3）。
    5. 接着，加入50 μL含异硫氰酸荧光素（FITC）标记的驴抗羊多克隆抗体（1:100稀释）的PBS-BSA溶液，于室温避光孵育1小时。
    6. 仅将细菌与封闭缓冲液及不含Vn的pAbs共同孵育，制备空白对照。
    7. 用 1 mL 封闭缓冲液重悬细菌，洗涤 3 次，每次均按 1.1.2 节所述方法通过离心收集菌体沉淀。最后，用 300 µL PBS 重悬细菌沉淀，并进行流式细胞术分析7.
  2. 重组PH与Vn相互作用的ELISA分析
    注意：需要设置对照以排除非特异性结合。分别使用人因子 H（FH）和 C4b 结合蛋白（C4BP）作为阳性和阴性对照。
    1. 将每种人源蛋白（Vn、FH 和 C4BP）分别用 pH 9.0 的 Tris-HCl 缓冲液（包被缓冲液）稀释至 50 nM。每孔加入 100 µL 蛋白溶液至 Polysorp 微孔板的各孔中。盖上板盖，4 °C 孵育过夜（16 h），以促进蛋白在微孔板孔壁上的固定。
    2. 将微孔板倒置于水槽上，弃去孔内溶液，每孔加入 300 µL PBS，洗涤 3 次。用含 2.5%（w/v）BSA 的 PBS（PBS-BSA）在室温下封闭包被孔，孵育 1 h。
    3. 除去封闭液后，每孔加入300 µL含0.05% (v/v) Tween 20的PBS（PBST）洗涤3次。每孔加入100 µL 50 nM重组His标签PH蛋白，室温孵育1小时。对照孔仅加入100 µL PBS-BSA。
      注意： lph 通过PCR扩增了来自Hif的编码PH基因，并将其克隆至pET26b表达载体中，该载体可在表达蛋白的C末端添加一个6×His标签。将重组载体转化至 E. coli BL21(DE3)用于表达。采用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白15.
    4. 弃去蛋白溶液，每孔加入 300 µL PBST 洗涤液，洗涤 3 次，以去除未结合的蛋白。每孔加入 100 µL 含辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗 His 多克隆抗体（1:10,000 稀释）的 PBS-BSA 溶液，室温孵育 1 小时。
    5. 将四甲基联苯胺溶解于5%丙酮和45%甲醇的混合溶液中，配制成20 mM溶液A。称取19.2 g柠檬酸，溶于1,000 mL H2O，加入KOH调节pH至4.25，然后加入230 µL的30% H2O2将两种溶液于室温避光保存。使用前，取500 µL溶液B与9.5 mL溶液A混合，配制ELISA检测试剂。
    6. 用每孔 300 µL 的 PBST 洗涤各孔三次，然后向每孔中加入 100 µL ELISA 检测试剂以检测抗原-抗体复合物。
    7. 加入 50 µL 1 M H2SO4/孔以终止反应。使用酶标仪在450 nm处测定各孔的光密度。
  3. 利用BLI研究重组PH与Vn相互作用的动力学
    1. 采用胺偶联法，按照制造商说明书将人Vn固定在胺反应性传感器上11.
    2. 使用 PBS 将配体（重组 PH）从 0 到 4 µM 进行系列稀释，并将所得溶液转移至 96 孔黑色平底微孔板中。使用 BLI 仪器在 30 °C 下进行实验17.
    3. 在BLI数据分析软件中加载数据文件夹。选择 传感器选择 选项，然后选择“参考孔”（PBS中的Vn包被传感器）进行减法校正。
    4. 选择 将Y轴与基线对齐 并选择 步间校正并关联对齐点击“处理数据”，系统将自动打开分析选项卡。
    5. 在分析选项卡中，选择 结合与解离 曲线拟合选项。选择模型“1:1 结合与全局拟合”。按下 拟合曲线 并导出拟合数据17.

2. Vn在细菌黏附作用中的功能表征

  1. 研究细菌在纤连蛋白包被的玻璃表面的黏附性
    1. 在 PBS 中配制 2 µg/mL 的 Vn 溶液，取 10 µL 该溶液以单滴形式加至玻璃显微镜载玻片上。室温下静置 30 分钟，使液滴自然干燥。另以人血清白蛋白（HSA）包被一张载玻片作为阴性对照。
    2. 将蛋白包被的玻片浸入盛有PBS的烧杯中，每次2秒，重复洗涤3次，以去除未结合的过量蛋白。向无菌塑料培养皿中加入20 mL新鲜Hif培养基（见步骤1.1.1），并将Vn-/HSA包被的玻片完全浸没于培养基中。将培养皿置于37 °C、20 rpm振荡条件下孵育1小时。
      ​注意：Hif M10 和 Hif M10Δlph 在液体BHI培养基或巧克力琼脂平板上培养。用于培养的培养基为 lph 突变体中添加了10 µg/mL卡那霉素15.
    3. 孵育后，将载玻片浸入盛有PBS的烧杯中三次，以去除未结合的细菌。按照所述方法进行革兰染色以观察细菌。
      1. 倾斜载玻片并用滤纸接触边缘以去除多余的 PBS。室温下将载玻片晾干 3–5 分钟，通过将每张载玻片在火焰上往返通过三次来固定贴壁的细菌。
      2. 用两根手指捏住载玻片边缘，置于染色架上，加入3–4滴（200–300 µL）2.3%结晶紫溶液。静置60秒后，用缓流自来水冲洗载玻片3–4秒。
      3. 在载玻片上滴加3–4滴0.33%碘液，静置1分钟，然后用缓流自来水冲洗载玻片。用吸水纸小心吸干载玻片。
      4. 加入3–4滴脱色液（含75%异丙醇和25%丙酮）至载玻片上。5–10秒后，用流动的自来水轻轻冲洗载玻片。
      5. 加入3–4滴（200–300 µL）碱性品红溶液。静置1分钟，然后用缓流自来水冲洗载玻片。用吸水纸将载玻片擦干。
      6. 在光学显微镜下观察细菌，选择100倍油镜物镜18比较Hif野生型和突变型细菌在Vn和HSA包被的玻璃表面的黏附情况。
  2. 研究细菌对上皮细胞的Vn依赖性黏附
    注意：本高效的黏附实验已用于我们之前的研究中4,7.
    1. 在75 cm²培养瓶中培养A549细胞（II型肺泡上皮细胞）2 添加了10%（体积/体积）胎牛血清（FCS）（完全培养基）和5 µg/mL庆大霉素的F12培养基组织培养瓶。将培养瓶置于含5% CO₂的培养箱中培养2 在37 °C下培养3天，直至细胞融合度达到80%（可通过倒置显微镜观察细胞覆盖表面的程度来估算融合度）。以下四个步骤描述了如何为检测准备上皮细胞19,20.
      1. 用20 mL PBS轻轻晃动冲洗细胞培养瓶中的细胞单层两次。为使细胞从培养瓶表面脱离，加入2 mL细胞解离酶溶液，于37 °C孵育5分钟。用手掌轻拍培养瓶，使细胞完全从塑料表面脱落。反复吹打数次以分散细胞团块。
      2. 向烧瓶中加入18 mL F12完全培养基，将整个细胞悬液转移至50 mL无菌Falcon管中。以200 × g离心5分钟。 g 室温下离心并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于10 mL F12完全培养基中。
      3. 取10 µL细胞悬液置于Eppendorf管中，加入90 µL台盼蓝溶液。将盖玻片放置到位后，取少量样品滴入血细胞计数板（深度0.1 mm）中。
      4. 计数区域 A、B、C 和 D 中的所有活细胞（每个区域包含 16 个方格，每个方格的面积为 0.0025 mm²）2），然后计算细胞平均数（[A+B+C+D]/4）。使用以下公式计算每毫升的细胞数量：
        可存活细胞数/mL = 平均细胞计数 × 104 × 稀释因子20.
        注意：此处稀释倍数为10。
      5. 将细胞悬液稀释至 5.0 x 103 细胞/mL，使用含有5 µg/mL庆大霉素的完全培养基。将500 μL细胞悬液分装至24孔细胞培养板的每孔中。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 直到细胞融合度达到90%。
    2. 在细菌感染前，移除孔板中的培养基，加入不含胎牛血清的F12培养基，37 °C孵育过夜。
    3. 用 500 µL PBS 在室温下洗涤细胞单层 3 次。将培养板置于冰上，加入 100 µL 预冷的含 10 µg/mL Vn 的 F12 培养基。在 4 °C 孵育 1 小时。对照孔仅加入 F12 培养基。
    4. 孵育后，用移液器弃去溶液，在室温下用 1 mL PBS 洗涤细胞层两次。将新培养的 Hif M10 菌液（步骤 1.1.1）重悬于 F12 培养基中（2×108 CFU/mL）。向每孔中加入 100 µL 该细菌悬液，于 37 °C 培养 2 小时。
      注意：每孔含有约 2 x 105 A549细胞。用于感染，2 x 107 添加细菌CFU，对应的感染复数为100。
    5. 用移液器吸除培养基，用 PBS 洗涤 A549 上皮细胞 3 次。每孔加入 50 µL 细胞解离溶液，于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。
    6. 接着，每孔加入 50 µL F12 完全培养基以终止酶反应。转移上皮细胞（≈100 μL [即，每个孔的全部体积）转移至含有四颗玻璃珠的6 mL玻璃试管中。在室温下涡旋振荡2分钟以裂解细胞。
    7. 将10 µL细胞裂解液加入990 µL F12培养基中，稀释100倍。取10 µL稀释后的样品接种至巧克力琼脂平板上。
    8. 将巧克力琼脂平板在37 °C下孵育过夜，然后计数菌落。每个菌落代表一个菌落形成单位（CFU）。

3. 人血清杀菌活性下依赖Vn的抗性分析

  1. 从商业来源购买正常人血清（NHS）。按先前所述方法制备乏血清培养基（VDS）12。向VDS中补充180 nM的Vn，使其浓度相当于NHS中所含的Vn水平。
  2. 将NHS在56 °C加热30分钟，以灭活补体蛋白，从而制备热灭活血清（HIS）。
    注意：步骤3.3–3.7所述实验中最佳血清浓度（5%）和孵育时间（15分钟）是针对Hif通过实验确定的15；对于其他细菌病原体，这些参数可能有所不同。
  3. 将细菌（本实验中为Hif M10及其突变株Hif M10Δlph）培养至对数中期（OD600  = 0.3）。在3,500 × g离心10分钟，收集菌体沉淀。
  4. 用1体积含有2.5%（w/v）葡萄糖、2 mM MgCl2、0.15 mM CaCl2和0.1%（wt/vol）明胶的葡萄糖明胶巴比妥缓冲液（DGVB++；pH 7.3）重悬细菌沉淀。
  5. 将1.5 × 103 CFU细菌加入含5%血清（NHS、HIS、VDS或VDS+180 nM Vn）的100 µL DGVB++中。在37 °C、300 rpm振荡条件下孵育15分钟。
  6. 分别在0分钟（T0样本）和15分钟（Tt样本）时从反应体系中取出10 µL等分试样，涂布于巧克力琼脂平板上。将平板在37 °C过夜培养。
  7. 培养后，计数平板上出现的菌落。使用以下公式计算细菌杀灭百分比12：（Tt时的CFU数）/（T0时的CFU数）× 100。

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结果

通过流式细胞术测定 Vn 与细菌表面的结合情况。本研究中测试的所有 Hif 临床分离株均能招募 Vn 至细胞表面。在阴性对照菌株 E. coli 中未观察到 Vn 与细胞表面的相互作用（图 1A）。如 图 1B 所示，PH 是 Hif 细胞表面主要的 Vn 结合蛋白。野生型 Hif 菌株 M10 能够结合 Vn，导致群体发生偏移，而 Hif M10Δlph 突变株不能结合 Vn，其结果与对照相似。

通过ELISA和BLI评估了PH与Vn之间的蛋白质-蛋白质相互作用。将重组PH蛋白与包被在微孔板孔中的人补体因子H、Vn以及C4BP（阴性对照）孵育。使用抗His多克隆抗体检测结合的PH。结果明确显示，与C4BP相比，PH与Vn及补体因子...

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讨论

细菌病原体将Vn招募至细胞表面，并利用这种补体调节因子阻止补体成分的沉积以及膜攻击复合物的形成2。Vn还作为细菌表面蛋白与宿主细胞表面受体之间的桥梁分子，从而使病原体能够黏附于上皮细胞表面，并进一步介导其内化。在本研究中，我们描述了可用于评估以下内容的实验方案：i) Vn与细菌细胞表面的结合能力；ii) 蛋白质-蛋白质相互作用及其亲和常数；iii) Vn在赋予血清抗性及增强病原体对宿主细胞表面黏附能力方面的功能作用。

流式细胞术是一种常用于验证细菌结合纤连蛋白（Vn）的定量技术。然而，必须优化Vn的浓度，因为不同细菌种类的Vn结合能力（以及各种受体）可能存在差异。在本研究所描述的实验中，使用1–100 µg/mL的Vn来估算线性结合和饱和参数。在Vn浓度为20 µg/mL（250 nM）时，野生型Hif、Hif M10Δlph突变株以及阴性对照E. coli细胞的结合模式表现出明显差异。因此，所有流式细胞术实验均采用该浓度。使用高于饱和点浓度的Vn可能导致假阳性信号。针对每种病原体，一抗和二抗的稀释...

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披露

作者无经济利益冲突。

致谢

本工作获得了安娜与埃德温·伯杰基金会、拉尔斯·希耶尔塔基金会、O.E. 与埃德拉·约翰松基金会、瑞典医学研究委员会（资助号 K2015-57X-03163-43-4，www.vr.se）、马尔默大学医院癌症基金会、生理学会（福斯曼基金会）以及斯克åne County Council的研究与开发基金会

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 热混匀仪Eppendorf5355干式加热冷却振荡器
5 mL 聚苯乙烯圆底管 BD Falcon60819-13812 × 75 mm 规格
5% CO2 供应培养箱 Thermo Scientific BBD6220
6 mL 聚苯乙烯圆底管 VWR89000-478带盖 12 × 75 mm 规格
24 孔板BD Falcon08-772-1H细胞培养级
30% 过氧化氢（H2O2）溶液Sigma-AldrichH1009-100ML实验室分析级
75 cm2 组织培养瓶BD FalconBD353136通气型
96 孔黑色平底板Greiner Bio-One655090经组织培养处理的 µClear 黑色板
A549 人细胞系Sigma-Aldrich86012804-1VL
细胞解离酶（Accutase） Sigma-AldrichA6964-500ML细胞培养级
AR2G 传感器Pall Life Science18-5095通过氨基偶联将蛋白固定在传感器上 
丙酮VWR97064-786分析级
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA2058适用于细胞培养
吸水纸 VWR28511-007
生物膜干涉仪Pall Life ScienceFB-50258双层干涉测量设备
结晶紫溶液Sigma-AldrichHT90132-1L
C4BP（C4b 结合蛋白）Complement Technology, Inc.A109以冷冻液体形式购买
氯化钙（CaCl2）Sigma-AldrichC5670-500G
石炭酸品红溶液Sigma-AldrichHT8018-250ML
柠檬酸Sigma-Aldrich251275-500G美国化学会（ACS）级
脱色液Sigma-Aldrich75482-250ML-F
E. coli 宿主（E. coli BL21）Novagen69450-3蛋白表达宿主
F12 培养基Sigma-AldrichD6421细胞培养级
流式细胞仪 BD Biosciences651154用于科研应用的细胞分析级 
胎牛血清（FCS）Sigma-Aldrich12003C适用于细胞培养
正常人血清（NHS）Complement Technology, Inc.NHS混合人血清
FITC 标记的驴抗羊抗体 AbD SerotecSTAR88F多克隆
庆大霉素Sigma-AldrichG1397细胞培养级
葡萄糖Sigma-AldrichG8270-1KG
明胶Sigma-AldrichG9391适用于细胞培养
血细胞计数板Marienfeld640210
HRP 标记的抗 His 标签抗体Abcamab1269多克隆
人补体因子 HComplement Technology, Inc.A137以冷冻液体形式购买
C4BPComplement Technology, Inc.A109冷冻溶液
人血清白蛋白Sigma-AldrichA1653-10G冻干粉末
组氨酸亲和树脂柱（HisTrap HP）GE Health Care Life Science17-5247-01预装 Ni Sepharose 的柱子
带 His 标签的 PH在本实验室中重组表达并纯化
碘液Sigma-AldrichHT902-8FOZ
甲醇VWRBDH1135-1LP分析级
 显微镜OlympusIX73倒置显微镜
显微镜载玻片Sigma-AldrichS8902普通型，尺寸 25 mm × 75 mm 
氯化镁（MgCl2）Sigma-AldrichM8266-1KG
含有 C 末端 6x His 标签的质粒（pET26(b)）Novagen69862-3DNA 载体
Polysorb 微孔板 Sigma-AldrichM9410用于 ELISA
氢氧化钾（KOH）Sigma-Aldrich6009美国化学会（ACS）级
羊抗人 Vn 抗体AbD SerotecAHP396多克隆
振荡器 Stuart ScientificSTR6平台振荡器
组织培养瓶BD Falcon317516775 cm2
 热混匀仪 Sigma-AldrichT3317干式加热冷却振荡器
四甲基联苯胺Sigma-Aldrich860336-100MGELISA 级
人血浆来源的玻璃粘连蛋白（Vn）Sigma-AldrichV8379-50UG细胞培养级

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