本文介绍了一种方法，用于制备并施加负载目标化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球至体外培养的完整小鼠胰岛，并随后进行β细胞增殖的免疫荧光分析。该方法适用于评估候选β细胞有丝分裂原的有效性。
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本文内容
摘要
摘要
生物材料的发展显著提升了将药物靶向递送至多种细胞和组织类型（包括胰腺β细胞）的潜力。此外，生物材料颗粒、水凝胶和支架还为在培养体系及移植组织模型中向β细胞进行持续、可控的药物递送提供了独特的机会。这些技术使得研究人员能够在保持胰岛完整性的前提下，利用具有转化医学相关性的系统来研究候选的β细胞增殖因子。而且，在推进到后续研究之前，确定这些候选因子在培养体系中促进β细胞增殖的有效性和可行性至关重要。 体内 模型。本文描述了一种将完整的小鼠胰岛与负载待测化合物（COI）的可生物降解聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球共培养的方法，旨在评估持续释放的COI对胰岛功能的影响。 原位 促有丝分裂因子对β细胞增殖的影响。本技术详细描述了如何使用市售试剂制备包含特定负载物的PLGA微球。尽管本方法以重组人结缔组织生长因子（rhCTGF）为例，但可轻松适用于多种其他货物分子（COI）。此外，该方法采用96孔板以最大限度减少评估β细胞增殖所需的试剂用量。本方案可便捷地拓展应用于其他生物材料，以及评估其他内分泌细胞特性，如细胞存活率和分化状态。
引言
胰腺β细胞是体内唯一产生胰岛素的细胞，对维持血糖稳态至关重要。健康个体具有足够的β细胞质量和功能，以适当调节血糖水平；而糖尿病患者则表现为β细胞质量不足和/或功能缺陷。1,2有研究提出，诱导β细胞增殖最终可增加β细胞质量，并恢复糖尿病患者的葡萄糖稳态3然而，在开发有效的治疗方法之前，必须在完整的胰岛中对潜在的β细胞增殖化合物进行评估和验证。将尸体来源的人胰岛移植给糖尿病患者可在一段时间内恢复血糖稳态，但该实验性手术的可用性和成功率受到可用于移植的人胰岛数量不足以及移植后胰岛内β细胞死亡的限制。4即使发现了能够诱导胰岛素生成细胞增殖的因子，如何将这些因子递送至靶部位仍然是一个重大挑战 体内一种实现β细胞增殖化合物持续局部递送的策略是使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）。由于PLGA具有高安全性、可生物降解性以及长效释放动力学，已被广泛应用于美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物递送产品中。5具体而言，PLGA 是乳酸和乙醇酸的共聚物，可通过水解反应在水的作用下降解 体内 或在培养中降解为乳酸和乙醇酸，二者均为体内天然存在的代谢物。包封的药物化合物可通过扩散和/或降解控制释放机制在周围环境中释放。COI 的包封可防止其发生酶解降解，与未包封的 COI 相比，提高了试剂的生物利用度5我们建议，PLGA微球可用于向培养中的完整胰岛递送候选化合物，并最终 体内测试PLGA向....
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方案
所有操作均经范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循其规定执行。
1. 对 COI 进行荧光标记（可选）
- 选择一种可与游离伯胺发生反应的荧光染料（例如，用于蛋白质）的荧光染料，如琥珀酰亚胺酯或荧光素衍生物，以可视化微球内容物。将过量8倍摩尔量（相对于COI的摩尔数）的荧光染料溶解于200 µl二甲基亚砜（DMSO）中。
- 将50 mg的COI用载体溶液重悬至终体积800 µl（终浓度为62.5 ng/µl）。载体溶液的组成取决于COI的来源。
注：常用的溶剂包括磷酸盐缓冲液（PBS）或二甲基亚砜（DMSO）。 - 从步骤1.1中加入全部荧光染料/DMSO溶液，重悬COI。在4 °C条件下涡旋振荡过夜。或者，可在室温（RT）下涡旋振荡反应混合物4小时。
- 标记反应完成后，使用脱盐柱去除多余的荧光染料。
- 从脱盐柱中排出储存缓冲液，并用16 ml去离子水冲洗。弃去所有流出液。
- 将荧光标记的COI加入脱盐柱中，用1.2 ml去离子水洗脱，并收集流出液。
- 重复洗脱步骤四次，每次加入 1.2 ml 去离子水，并将流出液作为单独样品收集。
- 将所有收集的穿流样品在 -80 °C 冻存，并根据制造商说明冻干 24 小时。
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结果
图1 是采用上述方案制备的微球的可视化图示。本方案可制备出不同尺寸的重组人结缔组织生长因子（rhCTGF）负载微球。大多数微球的直径范围在1至10 µm之间，但部分微球可能更大（图2）。如有需要，可通过调节制备参数（如均质速度与时间、所用表面活性剂浓度以及各水/油/水相的相对体积）来优化和调控微球的尺寸10。
在将经PLGA微球处理的完整胰岛分散并进行免疫标记后，通常会在细胞之间的样本区域观察到无任何标记的空白区域（图3）。尽管在培养处理期结束后，大多数仍保持完整的微球会在洗涤步骤中被去除，但在胰岛被离心至显微镜载玻片后，仍有部分微球残留。这些微球在成像过程中会形成类似孔洞的结构。这些残留的微球通常不会干扰后续的定量分析。
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讨论
在培养条件下研究β细胞增殖通常面临多种困难。首先，永生化β细胞系的增殖程度高于活体胰岛中内源性β细胞的增殖水平。此外，这些永生化细胞系缺乏维持正常β细胞功能所必需的正常细胞结构。上述两点使得难以判断利用永生化β细胞系获得的研究结果在应用于内源性β细胞时是否依然成立 体内 或整个胰岛中。我们所描述的方案采用新鲜分离的完整小鼠胰岛，可避免上述问题，因为胰岛结构得以维持，且β细胞增殖水平与体内情况相当 体内.
培养完整胰岛时的一个重要问题是胰岛核心内的细胞可能发生缺氧诱导的坏死，或无法充分接触重组人CTGF（rhCTGF）。因此，在培养基中添加终浓度为0.1 mM的EGTA，以松解细胞间连接，同时不破坏胰岛的整体结构。我们此前已发表研究指出，单独添加EGTA即可促进β细胞增殖，这可能是由于培养基中的营养物质和有丝分裂原更易进入胰岛核心12。EGTA诱导的β细胞增殖增加也可能源于细胞间接触减少本身所引发的效应13,14。本实验方案中所述培养基使用马血清替代了更常用的胎牛血清。这一替换的原因在于胎牛血清中含有胎盘.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢范德堡大学的 Bethany Carboneau 对本文手稿的审阅。我们还感谢范德堡大学医学中心胰岛分离与分析核心实验室的 Anastasia Coldren 提供胰岛分离技术支持，并感谢范德堡大学医学中心的 Alvin C. Powers 博士和范德堡大学的 David Jacobson 博士提供离心机和组织培养设施的使用支持。本研究使用了由美国国立卫生研究院资助（资助号 DK20593）的范德堡糖尿病研究与培训中心下属的胰岛分离与分析核心实验室的资源。本研究工作得到了美国心脏协会博士后奖学金（14POST20380262）对 R.C.P. 的资助，以及青少年糖尿病研究基金会（1-2011-592）和美国退伍军人事务部（1BX00090-01A1）对 M.A.G. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 俄勒冈绿 488 乙酸，琥珀酰亚胺酯，6-异构体 | ThermoFisher Scientific | O6149 | 用于用荧光染料标记待测化合物 |
| DMSO 二甲基亚砜 | Fisher BioReagents | BP231-1 | 用于第1步中溶解荧光染料 |
| 一次性 PD-10 脱盐柱 | GE Healthcare | 17-0851-01 | 步骤1中使用的脱盐柱 |
| Resomer RG 505，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)，酯端基，分子量 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | 用于第2步微球制备 |
| 聚乙烯醇分子量 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | 用于第2步中微球的制备 |
| RPMI 1640 | 赛默飞世尔科技 | 11879-020 | 用于胰岛培养 |
| 无水右旋糖 | Fisher BioReagents | 200-075-1 | 胰岛培养基补充剂 |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | 胰岛培养基用抗生素 |
| 正常马血清 | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | 胰岛培养基补充剂 |
| 96孔组织培养板 | 康宁 | 3603 | 用于胰岛培养 |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'四乙酸 | Sigma-Aldrich | E4378 | 预实验用胰岛培养基补充剂 |
| Cytospin 4 细胞离心涂片机 | 赛默飞世尔科技 | A78300003 | 用于将细胞离心至显微镜载玻片上 |
| EZ单细胞进样器 | Thermo Scientific | A78710020 | 用于将细胞离心至显微镜载玻片 |
| 乙二胺四乙酸 | Fisher BioReagents | BP118-500 | 用于解离胰岛 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 用于固定细胞 |
| 曲拉通 X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | 用于细胞透化 |
| 正常驴血清 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 免疫荧光封闭试剂 |
| 抗Ki67抗体 | abcam | ab15580 | Ki67 免疫荧光检测 |
| 多克隆豚鼠抗胰岛素 | Dako | A0564 | 胰岛素免疫荧光检测 |
| Cy3 AffiniPure 驴抗兔 | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Ki67 免疫荧光检测 |
| Cy5 AffiniPure 驴抗豚鼠 | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | 胰岛素免疫荧光检测 |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐） | ThermoFisher Scientific | D1306 | 用于免疫荧光中的细胞核可视化 |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | 快速干燥封片介质 |
| FreeZone -105 °C 4.5 升级联台式冷冻干燥系统 | Labconco | 7382020 | 用于微球的冻干 |
参考文献
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R.
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重印与许可
