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表征活体生物膜中的电子传递

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DOI：

10.3791/54671

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2018年6月1日

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1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2George Mason University, 3Chemistry Division, Naval Research Laboratory, 4Departments of Physics, Biological Sciences, and Chemistry, University of Southern California, 5Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University

本文内容

摘要

介绍了一种在生理相关条件下测量活体微生物生物膜电导率的实验方案。

摘要

本文演示了一种电化学门控方法，用于在生理相关条件下表征电极上生长的微生物生物膜的电导率。1 这些测量在水相介质中对活体生物膜进行，使用在玻璃表面以特殊构型制备的源极和漏极电极，该构型称为叉指电极（interdigitated electrode, IDA）阵列。生物膜生长并跨越连接源极与漏极的间隙。在电极上施加电势（ES 和 ED），从而在电极之间的生物膜中产生源-漏电流（ISD）。通过系统地改变门电势（源极与漏极电势的平均值，EG = [ED + ES]/2）并测量相应的源-漏电流，可确定电导率对门电势的依赖关系。电导率对门电势的依赖性可提供关于特定生物膜电导机制的胞外电子传递过程的机理信息。本文所述的电化学门控测量方法直接基于20世纪80年代M. S. Wrighton2,3 及其同事，以及R. W. Murray4,5,6 及其同事用于研究薄膜导电聚合物的方法。

引言

胞外电子传递（EET）是一类使某些微生物能够在细胞内代谢过程与细胞外不溶性电子受体或供体（从天然矿物到电极）之间传递电子的过程。在某些情况下，EET使微生物能够在电极表面形成具有电导性的多细胞厚度生物膜，其中未直接接触电极的细胞仍可利用该电极作为代谢所需的电子受体或供体。此类生物膜作为电极催化剂在多种应用中受到广泛关注，例如微生物电合成、污染物检测与去除，以及远程能量生成与储存。7,8,9,10,11,12,13,14 由于微生物执行的代谢过程具有多样性，且与基于酶的生物电极相比，微生物生物膜具有更强的耐久性。15,16 此外，电子传递途径（EET）可能被用于通过电信号控制或调节天然存在或基因工程改造的微生物代谢过程，例如在目标产物生产或目标分析物或刺激物检测中的应用。电催化生物膜具有电....

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方案

1. 叉指微电极阵列（IDA）的制备

  1. 采用市售的在非导电基底上制备的IDA电极，或使用标准光刻方法自行制备。28
    注意：IDA 的尺寸和/或材料可根据不同实验所需的条件进行调整。本研究中使用的 IDA 为商业获得，由两组叉指型金微电极构成，电极图案化于玻璃基底上，并在阵列两端分别连接至较大的电极焊盘。电极部分暴露，而将电极与大尺寸接触焊盘相连的总线则涂覆有薄层绝缘材料。本研究所用的 IDA 由两组 10 µm宽约2毫米、长约2毫米的金微电极带（源极和漏极），其间距为 5 µm 在平坦玻璃表面制备的叉指电极阵列（IDAs）包含65对电极（共130个叉指状电极条带）。交替的电极条带分别连接至阵列两端相对的电极焊盘。
  2. 连接并绝缘IDA导线
    1. 使用导电银环氧树脂将一根导线连接到每个大电极片上。
      1. 根据所用导电环氧树脂的具体说明书，使用搅拌棒或移液器吸头按说明进行配制（不同厂家的说明可能有所不同）。
      2. 在每块金焊盘上放置一根导线，并用实验室胶带固定。使用混合棒或移液器吸头将银环氧树脂覆盖在导线和焊盘上。
      3. 小心移动至 80 °C 在烘箱中加热1小时以固化，或根据所用特定导电银环氧树脂的制造商建议进行固化。
      4. 环氧树脂固化后，使用万用表检测导线末端与焊盘之间的电连续性。导线与焊盘之间的电阻应 &#....

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结果

将IDA连接导线、绝缘并进行测试，以确保两个电极彼此电学隔离（图1）。将反应器组装后接种G. sulfurreducens，并培养至生物膜在电极之间形成桥接。可直接观察到G. sulfurreducens生物膜覆盖了整个阵列。其他类型的生物膜可能需要研究人员进行电化学门控测量，以判断两个电极是否已实现电学连接。还应使用显微镜验证阵列中电极之间的连接情况。通过电化学门控实验确定ISD对EG的依赖关系（图2）。随后利用门控实验中测得的传导电流计算活体生物膜的电导率。由于IDA构型可实现较高的信噪比，这些测量具有很高的精确度和准确性。同时还测定了ISD随温度T的变化关系，并计算了电子在生物膜中传递的活化能（图2）。本研究获得的结果与先前报道的结果相似17.......

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讨论

在搭建IDA过程中，必须测试源极和漏极在电化学栅极测量前是否发生短路，因为短路会改变ISD与EG的关系曲线，可能导致错误的结果和解释。同时，必须选择合适的VSD和v，使得电流与VSD呈线性关系，且与v无关。若不满足此条件，则无法使用上述方程计算电导率。

必须考虑并从测得的传导电流中去除至少两种背景电流。第一种是由于门电极电势扫描过程中氧化还原辅因子发生法拉第充电/放电而产生的背景电流。这种背景电流受电极表面电学上可及的氧化还原辅因子数量的显著影响。第二种背景电流来自双电层电容。第三种背景电流源于细胞对代谢性电子受体/供体的周转反应，该背景电流仅在发生周转反应的条件下存在。本研究中通过从 VSD = 0.01 V 时测得的漏极电流中减去源极电流来消除背景电流。该方法假设两个电极处的背景电流相等，且源极与漏极电流在两个电极上的大小相等但符号相反。在此情况下，源极与漏极电流相减后所得的传导电流幅值为实际值的两倍，因此应除以2。需注意，该假设仅在 VSD 极小.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

M.D.Y、S.M.G-S. 和 L.M.T. 感谢美国海军研究办公室（资助编号：N0001415WX01038 和 N0001415WX00195）、美国海军研究实验室以及海军研究实验室纳米科学研究所的支持；M.Y.E.-N. 的研究得到了美国能源部资助 DE-FG02-13ER16415 的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IDAsCH Instruments012125由 ALS-Japan 生产，CH Instruments 销售
导线DigikeyW7-ND
导电银环氧树脂Electron microscopy sciences12670-EE
绝缘材料3M2131-BScotchast 阻燃化合物
15 mL 圆锥形离心管VWR89004-368
21 号针头VWRBD-305165
5 mL 移液器吸头VWR82018-842
5 mL 移液器VWR89079-976
淡水培养基组分Sigma Aldrich所有标准实验室化学品
    氯化铵
    磷酸二氢钠
    碳酸氢钠
人工海水培养基组分Sigma Aldrich所有标准实验室化学品
    氯化钠
    六水合氯化镁
    七水合硫酸镁
    氯化钾
    碳酸氢钠
    二水合氯化钙
    氯化铵
    磷酸氢二钾
Ag/AgCl 参比电极BasiMF-2079
石墨棒对电极Electron microscopy sciences70230
循环水浴槽Thermo Scientific152-5256
双恒电位仪Pine InstrumentsWD-20http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
搅拌子VWR58947-114
G. sulfurreducens 培养物ATCC51573
夹套反应器Pine InstrumentsRRPG085

参考文献

  1. Boyd, D. A., et al. Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , John Wiley & Sons, Inc. 177-210 (2015).
  2. Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
  3. Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electroc....

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重印与许可

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Geobacter sulfurreducens

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