方法文章

表征活体生物膜中的电子传递

DOI：

10.3791/54671

⸱

2018年6月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2George Mason University, 3Chemistry Division, Naval Research Laboratory, 4Departments of Physics, Biological Sciences, and Chemistry, University of Southern California, 5Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

介绍了一种在生理相关条件下测量活体微生物生物膜电导率的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文演示了一种电化学门控方法，用于在生理相关条件下表征电极上生长的微生物生物膜的电导率。1 这些测量在水相介质中对活体生物膜进行，使用在玻璃表面以特殊构型制备的源极和漏极电极，该构型称为叉指电极（interdigitated electrode, IDA）阵列。生物膜生长并跨越连接源极与漏极的间隙。在电极上施加电势（ES 和 ED），从而在电极之间的生物膜中产生源-漏电流（ISD）。通过系统地改变门电势（源极与漏极电势的平均值，EG = [ED + ES]/2）并测量相应的源-漏电流，可确定电导率对门电势的依赖关系。电导率对门电势的依赖性可提供关于特定生物膜电导机制的胞外电子传递过程的机理信息。本文所述的电化学门控测量方法直接基于20世纪80年代M. S. Wrighton2,3 及其同事，以及R. W. Murray4,5,6 及其同事用于研究薄膜导电聚合物的方法。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胞外电子传递（EET）是一类使某些微生物能够在细胞内代谢过程与细胞外不溶性电子受体或供体（从天然矿物到电极）之间传递电子的过程。在某些情况下，EET使微生物能够在电极表面形成具有电导性的多细胞厚度生物膜，其中未直接接触电极的细胞仍可利用该电极作为代谢所需的电子受体或供体。此类生物膜作为电极催化剂在多种应用中受到广泛关注，例如微生物电合成、污染物检测与去除，以及远程能量生成与储存。7,8,9,10,11,12,13,14 由于微生物执行的代谢过程具有多样性，且与基于酶的生物电极相比，微生物生物膜具有更强的耐久性。15,16 此外，电子传递途径（EET）可能被用于通过电信号控制或调节天然存在或基因工程改造的微生物代谢过程，例如在目标产物生产或目标分析物或刺激物检测中的应用。电催化生物膜具有电导性，使其区别于其他生物材料，这是其电催化特性的核心特征；然而，关于电极环境中EET过程的基本机制，目前了解甚少，且已有认知仍存在较大争议。17,18,19,20,21,22,23,24

本文介绍一种双电极法，用于通过叉指电极阵列（IDAs）测量在电极上生长的活体生物膜的导电性。IDAs由平行的矩形电极构成，这些电极图案化地排列在平坦的玻璃表面，使得每隔一个电极带在阵列的相对两侧相连，从而形成两个电极（源极和漏极）。仔细观察IDAs（例如参见参考文献#1中的图6.12b）可发现，相邻电极带之间的间隙也以特定方式连接，形成一条单一的、在阵列上反复曲折延伸的狭长间隙，将两个电极分隔开。其结果是源极与漏极之间被一条长而窄的间隙隔开，当在阵列上形成、浇铸、聚合或生长（如本文所讨论的生物膜类型）导电材料时，可产生非常高的源-漏电流。此外，由于电极尺寸小，使用IDAs进行电导测量所需的材料量极小，因此由电容充电以及导电材料氧化态随栅极电势变化所引起的背景电流也较小。此处描述的基于IDAs的电化学栅控技术最初用于表征薄膜导电聚合物2,3,4,25，最近才被应用于活体系统18。另一种用于测量活体生物膜电导的技术采用大面积的分体式源极和漏极电极，并结合源表来设定栅极电势26,27。然而，这些方法存在的问题此前已有详细论述18。

以下方案总结了我们对活体Geobacter sulfurreducens和生物阴极MCL生物膜进行电导率测量的经验。G. sulfurreducens是一种典型的电极还原性微生物，能够利用包括电极在内的不溶性材料作为唯一的代谢电子受体。此外，它可形成较厚的生物膜，能够将电子传递跨越多个细胞长度，因此是研究阳极远距离胞外电子传递的理想模式生物。本方案还包括对生物阴极MCL的研究细节，该生物膜为好氧、自养的混合群落，分离自底栖微生物燃料电池的阴极。生物阴极MCL（以其三种主要组分Marinobacter、Chromatiaceaea和Labrenzia命名）能够以电极为唯一的电子供体，并实现跨越多个细胞长度的电子传递，是一种具有研究价值的阴极体系。此外，利用本方法测得的生物阴极MCL是迄今报道中活体系统中电导率最高的。本方案中纳入这些不同类型的电活性生物膜，旨在强调该技术适用于测量任何能够与电极发生电学相互作用的活体生物膜中的电子传递过程。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 叉指微电极阵列（IDA）的制备

  1. 采用市售的在非导电基底上制备的IDA电极，或使用标准光刻方法自行制备。28
    注意：IDA 的尺寸和/或材料可根据不同实验所需的条件进行调整。本研究中使用的 IDA 为商业获得，由两组叉指型金微电极构成，电极图案化于玻璃基底上，并在阵列两端分别连接至较大的电极焊盘。电极部分暴露，而将电极与大尺寸接触焊盘相连的总线则涂覆有薄层绝缘材料。本研究所用的 IDA 由两组 10 µm宽约2毫米、长约2毫米的金微电极带（源极和漏极），其间距为 5 µm 在平坦玻璃表面制备的叉指电极阵列（IDAs）包含65对电极（共130个叉指状电极条带）。交替的电极条带分别连接至阵列两端相对的电极焊盘。
  2. 连接并绝缘IDA导线
    1. 使用导电银环氧树脂将一根导线连接到每个大电极片上。
      1. 根据所用导电环氧树脂的具体说明书，使用搅拌棒或移液器吸头按说明进行配制（不同厂家的说明可能有所不同）。
      2. 在每块金焊盘上放置一根导线，并用实验室胶带固定。使用混合棒或移液器吸头将银环氧树脂覆盖在导线和焊盘上。
      3. 小心移动至 80 °C 在烘箱中加热1小时以固化，或根据所用特定导电银环氧树脂的制造商建议进行固化。
      4. 环氧树脂固化后，使用万用表检测导线末端与焊盘之间的电连续性。导线与焊盘之间的电阻应 < 5 Ω此外，使用万用表检查是否存在导电银胶连接多个电极焊盘的情况，因为这可能导致阵列短路。如果导电银胶连接了多条引线，应使用刻划笔将引线分离开。
    2. 使用具有耐热性、电绝缘性和防水性的绝缘材料涂覆环氧连接处，以对连接处进行绝缘。阻燃型聚氨酯树脂通常较为合适。
      1. 移除一个15 mL圆锥形离心管的管尖部分（约在2.5 mL刻度处），作为绝缘材料的模具。使用21号针头在底部打两个小孔，用于导线穿过。
      2. 将IDA插入模具中，并使导线穿过模具底部的孔。
      3. 制备特定的绝缘材料。按照所获得的特定树脂附带的说明进行操作。
      4. 用移液器将绝缘材料加入模具中，直至完全覆盖银环氧树脂（约2.5 mL），然后按照制造商的说明进行干燥。

2. 电化学反应器的搭建、测试与接种

  1. 搭建电化学池。
    1. 将叉指阵列电极（IDA）、对电极和参比电极插入电化学池中。
      注意：所使用的电化学反应器可以有多种类型，只要所有电极均能放入即可。需注意的一点是，在反应器实际限制条件下，参比电极应尽可能靠近工作电极。本实验中采用单室反应器，参比电极距离工作电极约 2–3 cm。此外，对电极的面积应大于工作电极，以确保其在系统中不成为限制因素。
    2. 若使用纯培养体系，需将对电极置于反应器内一同灭菌。参比电极通过在次氯酸钠溶液中浸泡 10 分钟，再用无菌去离子水冲洗 10 分钟进行灭菌。IDA 电极则在次氯酸钠溶液中浸蘸 5 秒，随后用无菌去离子水冲洗 10 秒，再插入反应器中。
    3. 向电化学池中加入适合生物膜生长的无菌培养基。对于 G. sulfurreducens17,18，使用不含延胡索酸的淡水培养基；对于生物阴极 MCL9，使用人工海水培养基9。
    4. 将电极连接至双恒电位仪。将一个 IDA 电极连接至工作电极引线 1，另一个 IDA 电极连接至工作电极引线 2，参比电极连接至参比电极引线，对电极连接至对电极引线。
  2. IDA 的电化学测试。
    注意：该测试的主要目的是确保两个电极在电学上相互隔离。所有电化学技术均可通过控制双恒电位仪的软件实现。
    1. 在生物膜生长前进行控制性导电性测试，以确保 IDA 正常工作，使用双恒电位仪完成。
      1. 测量每个电极的开路电位，持续 1 分钟。
        注意：在某些仪器上，需通过恒电流采集程序并将电流设为 0 mA 来实现开路电位测量。
      2. 在对电极 1 施加循环伏安法扫描（相对于标准氢电极 SHE，+0.2 V 至 +0.6 V，扫描速率为 20 mV/s）的同时，测量电极 2 的开路电位。
        注意：可根据需要使用其他电位范围和扫描速率，但应避免产生氢气或氧气的电位。
      3. 通过恒电位仪软件验证，在循环伏安扫描过程中，电极 2 测得的开路电位不应与电极 1 的电位变化同步。
        注意：电极 2 的开路电位可能会发生变化，但其变化应独立于电极 1 的电位。
      4. 重复步骤 2.2.1.1 至 2.2.1.3，但改为控制电极 2 的电位，同时测量电极 1 的开路电位。
    2. 使用双恒电位仪软件将工作电极的电位设定为所需电活性生物膜的生长电位。例如，Geobacter sulfurreducens 使用 +0.5 V（vs. SHE），生物阴极 MCL 使用 +0.31 V（vs. SHE）。
  3. 培养目标电活性生物膜
    1. 采用标准无菌微生物操作技术，从目标电活性微生物的保存培养物或富集培养物中接种电化学反应器。标准测试中，以 OD600 = 0.5 的培养液按 1:20 的比例（接种液体积与反应器总体积之比）接种。
    2. 根据目标生物膜的生长条件，将反应器的搅拌速度设定至所需水平（约 200 rpm），并将培养箱或水浴温度设定至所需温度。对于 G. sulfurreducens，采用 30 °C 以获得最佳生长。
    3. 根据目标微生物的具体需求孵育系统，直至生物膜连接两个电极之间的间隙。对于静止培养的 G. sulfurreducens 生物膜，孵育约 7–10 天；对于生物阴极 MCL，孵育约 7 天。在每种情况下，均将温度控制在 30 °C。

3. 电化学门控实验

  1. 选择用于确定门控测量中电流-电位依赖关系的实验参数。
    1. 确定将施加到叉指阵列电极（IDA）上的门电位范围，以获得该系统的漏源电流（ISD）随门电位（EG）变化的曲线。
      注意：所考察的门电位范围应涵盖所有可能发生氧化还原活性的电位。若对目标系统无先验信息，应使用较宽的电位范围（相对于标准氢电极SHE为-0.55至+0.6 V）。可根据具体研究体系通过试错法进一步优化该范围。门电位定义如下：
      figure-protocol-1
      其中ED为漏电极电位，ES为源电极电位。所用门电位范围受限于特定系统的实际需求和限制条件。18
      注意：应避免使用会导致析氧或析氢的源极和漏极电位，因为这些过程可能破坏生物膜。
    2. 确定将用作电子从源极向漏极通过薄膜传输驱动力的源漏电压（VSD）。源漏电压定义如下：
      figure-protocol-2
      注意：源漏电压应足够小，以确保ISD与VSD呈线性关系。17
    3. 选择一个扫描速率（v），使EG随时间线性变化且独立于ISD，从而在每个门电位下系统可近似处于稳态。
      注意：对于生物系统，通常使用的扫描速率小于0.002 V/s。29,30
    4. 根据上述考虑，设置双恒电位仪软件，在选定的电位范围内、选定的源漏电压下以及期望的扫描速率下进行门控测量（即扫描门电位）。
      注意：此前对G. sulfurreducens进行的门控测量中17,19，EG = -0.55 V 至 0.6 V（vs. SHE），VSD = 0.01 V 或 0.1 V，v = 0.001 V/s。对于生物阴极MCL，EG = 0.25 V 至 0.7 V（vs. SHE），VSD = 0.002 V，v = 0.0002 V/s。
      1. 此外，在VSD = 0.000 V条件下（即同时记录各独立电极的循环伏安曲线）以步骤3.1.3中选定的相同v值进行基线测量。
    5. 在有转化（存在可溶性电子供体或受体）和无转化（无任何可溶性电子供体或受体）条件下，使用3.1.4中的条件进行门控测量。
      注意：无转化条件具有优势，因为测量不会受到细胞代谢过程中可溶性化合物氧化或还原的干扰；尽管如此，只要扣除背景电流（详见3.1.8），两种条件下应得到相似结果。
      1. 通过使用与细菌在电极上生长时相同的反应器培养基来实现转化条件。该培养基含有可溶性电子供体（如G. sulfurreducens中的乙酸盐）17，或电子受体（如生物阴极MCL中的氧气）。
      2. 通过配制与细菌在电极上生长所用相同的反应器培养基，但省略可溶性电子供体或受体，以实现无转化条件。在确认恒电位仪关闭后，无菌移除原有培养基，并加入不含电子供体（阳极系统）或电子受体（阴极系统）的新鲜培养基。或者，可建立连续流动系统，缓慢替换为适用于无转化条件的培养基。
        注意：若氧气为可溶性电子受体（如生物阴极MCL），则用约15% CO2 和 85% N2 的混合气体（或能维持培养基适当pH的其他气体混合物）对系统进行鼓泡处理。
    6. 完成门控测量后，使用恒电位仪软件将各电极电位恢复至生长电位，使系统重新稳定（使用与2.2.2中相同的数值）。
    7. 若满足上述所有条件（ISD与v无关且与VSD呈线性关系），则如先前所述31，使用以下方程将ISD值转换为电导率：
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4
    8. 其中G为电导，S为依赖于系统的比例因子，包含电极尺寸、间隙大小和生物膜高度等因素。对于某些系统，S可通过预定义方程确定。31 或者，如先前所述17，可使用建模软件进行数值计算。
    9. 扣除背景电流，以识别传导电流的形状和大小。可将VSD = 0.00 V时产生的电流从VSD = 0.01 V时产生的电流中减去，或从VSD = 0.01 V时源极产生的电流中减去漏极电流。任一方法均可消除背景电流，仅保留传导电流。
  2. 温度依赖性电化学门控测量
    1. 确定感兴趣的温度范围。该范围高度依赖于所研究的系统，但应使用生理相关温度。
      注意：以往研究中曾使用10 °C 至 30 °C 的温度范围，以研究中温微生物在生理相关条件下的电子传递。17
    2. 配备循环水浴或培养箱以调节反应器温度，并设置对照反应器，确保设定值与培养基实际温度一致。
      1. 将温度计或热电偶置于对照反应器中原本放置IDA的位置。
    3. 使用双恒电位仪，在选定的温度范围内，按照以下两种程序之一，在转化和无转化条件（见步骤3.1.5）下进行ISD测量（参见3.1.4）。
      1. 如上所述（见3.1），在感兴趣的温度范围内，为每个温度生成ISD vs. EG曲线。对于表现出氧化还原电导性的材料（如G. sulfurreducens和生物阴极MCL），利用每个温度下的峰值电流确定ISD与温度T的依赖关系。
        注意：此方法可为每个温度生成完整的ISD vs. EG曲线，但比第二种方法耗时更长。
      2. 或者，使用双恒电位仪将IDA固定在产生最大传导电流的门电位（由ISD vs. EG曲线确定，见步骤3.1.4），同时利用水浴或培养箱的内置控制功能在选定温度范围内循环改变温度，并记录每个温度下的最大传导电流。
        注意：采用本实验所用的电极/反应器几何结构，ISD和T需至少稳定20分钟，每个温度下取平均稳定ISD值。具体系统可能需要更长或更短的稳定时间。该方法比第一种更快，且对生物膜造成的压力更小，但无法生成完整的门控曲线。
      3. 利用培养箱或水浴的内置控制功能，在两个设定温度之间往返循环，以判断反应的可逆性，确保温度循环不会损害生物膜。
    4. 使用培养箱或水浴的内置控制功能将温度恢复至正常生长温度，并让系统重新稳定。
      注意：对于氧化还原导体，ISD与1/T的数据可用阿伦尼乌斯速率方程拟合，从而计算活化能，如下所示：
      figure-protocol-5
      figure-protocol-6
      其中Ea为相邻氧化还原辅因子间电子转移的活化能，k为玻尔兹曼常数。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将IDA连接导线、绝缘并进行测试，以确保两个电极彼此电学隔离（图1）。将反应器组装后接种G. sulfurreducens，并培养至生物膜在电极之间形成桥接。可直接观察到G. sulfurreducens生物膜覆盖了整个阵列。其他类型的生物膜可能需要研究人员进行电化学门控测量，以判断两个电极是否已实现电学连接。还应使用显微镜验证阵列中电极之间的连接情况。通过电化学门控实验确定ISD对EG的依赖关系（图2）。随后利用门控实验中测得的传导电流计算活体生物膜的电导率。由于IDA构型可实现较高的信噪比，这些测量具有很高的精确度和准确性。同时还测定了ISD随温度T的变化关系，并计算了电子在生物膜中传递的活化能（图2）。本研究获得的结果与先前报道的结果相似17...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在搭建IDA过程中，必须测试源极和漏极在电化学栅极测量前是否发生短路，因为短路会改变ISD与EG的关系曲线，可能导致错误的结果和解释。同时，必须选择合适的VSD和v，使得电流与VSD呈线性关系，且与v无关。若不满足此条件，则无法使用上述方程计算电导率。

必须考虑并从测得的传导电流中去除至少两种背景电流。第一种是由于门电极电势扫描过程中氧化还原辅因子发生法拉第充电/放电而产生的背景电流。这种背景电流受电极表面电学上可及的氧化还原辅因子数量的显著影响。第二种背景电流来自双电层电容。第三种背景电流源于细胞对代谢性电子受体/供体的周转反应，该背景电流仅在发生周转反应的条件下存在。本研究中通过从 VSD = 0.01 V 时测得的漏极电流中减去源极电流来消除背景电流。该方法假设两个电极处的背景电流相等，且源极与漏极电流在两个电极上的大小相等但符号相反。在此情况下，源极与漏极电流相减后所得的传导电流幅值为实际值的两倍，因此应除以2。需注意，该假设仅在 VSD 极小...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.D.Y、S.M.G-S. 和 L.M.T. 感谢美国海军研究办公室（资助编号：N0001415WX01038 和 N0001415WX00195）、美国海军研究实验室以及海军研究实验室纳米科学研究所的支持；M.Y.E.-N. 的研究得到了美国能源部资助 DE-FG02-13ER16415 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IDAsCH Instruments012125由 ALS-Japan 生产，CH Instruments 销售
导线DigikeyW7-ND
导电银环氧树脂Electron microscopy sciences12670-EE
绝缘材料3M2131-BScotchast 阻燃化合物
15 mL 圆锥形离心管VWR89004-368
21 号针头VWRBD-305165
5 mL 移液器吸头VWR82018-842
5 mL 移液器VWR89079-976
淡水培养基组分Sigma Aldrich所有标准实验室化学品
    氯化铵
    磷酸二氢钠
    碳酸氢钠
人工海水培养基组分Sigma Aldrich所有标准实验室化学品
    氯化钠
    六水合氯化镁
    七水合硫酸镁
    氯化钾
    碳酸氢钠
    二水合氯化钙
    氯化铵
    磷酸氢二钾
Ag/AgCl 参比电极BasiMF-2079
石墨棒对电极Electron microscopy sciences70230
循环水浴槽Thermo Scientific152-5256
双恒电位仪Pine InstrumentsWD-20http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
搅拌子VWR58947-114
G. sulfurreducens 培养物ATCC51573
夹套反应器Pine InstrumentsRRPG085

参考文献

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