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一种用于检测细胞和组织中RNA N6-甲基腺苷修饰的方法

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DOI：

10.3791/54672

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2016年12月5日

 ,  , 
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种改良的Northern印迹法，用于检测RNA中的N6-甲基腺苷（m6A）修饰。该方法可在不同实验设计条件下，检测多种RNA及其对照样本中的修饰情况。

摘要

RNA 上的 N6-甲基腺苷（m6A）修饰在真核生物中广泛存在且具有多样性，可出现在 mRNA、rRNA、tRNA 和 microRNA 中。近期研究表明，这些可逆的 RNA 修饰能够影响 RNA 的剪接、翻译、降解和定位过程。多种生理过程，如昼夜节律、干细胞多能性、纤维化、甘油三酯代谢以及肥胖，也受到 m6A 修饰的调控。目前常用于检测 m6A 修饰的方法包括免疫沉淀/测序、质谱分析以及改良的 Northern 印迹技术。本文介绍一种用于检测 m6A 修饰的 Northeastern 印迹技术。本实验方案可实现良好的 RNA 片段大小分离，适用于多种实验设计，具有较高的可重复性和标准化潜力，并能清晰地揭示不同来源 RNA 中的 m6A 修饰情况。尽管已知 m6A 修饰在与昼夜节律和肥胖相关的人体生理过程中具有关键作用，但其在其他（病理）生理状态中的功能仍不明确。因此，对 m6A 修饰的研究有望为分子生理学提供重要的机制性见解。

引言

动态且可逆的 RNA 修饰在 RNA 稳态中具有重要作用。四十年前，人们发现N6-甲基腺苷（m6A）修饰在真核生物转录组中广泛存在1。这种修饰在信使 RNA（mRNA）、核糖体 RNA（rRNA）、核仁小 RNA、转运 RNA 以及微小 RNA 中均具有多种功能2。m6A 对 mRNA 的剪接3、翻译4、降解5和定位2均产生影响。此外，它还参与调控核糖体的生物合成及微小 RNA 的功能6。从单细胞细菌到多细胞人类，RNA 上 m6A 修饰的进化保守性已被广泛注意到7。目前，关于 m6A 修饰功能的解析正处于深入研究之中，这些研究有望为转录调控提供新的见解。最近的研究表明，mRNA 上的其他化学修饰8也在 RNA 代谢过程中发挥关键作用。

昼夜节律9、干细胞多能性10、甘油三酯代谢4、纤维化11、肥胖12以及重度抑郁症13是已知由m6A修饰调控结果的若干过程。许多昼夜节律钟基因的转录本含有m6A位点14。调节m6A甲基转移酶或去甲基化酶可引起昼夜节律周期的改变15。Mettl3是一种m6A转移酶，可调控干细胞的多能性。Mettl3的缺失会导致胚胎早期致死以及在着床后阶段出现异常的谱系启动10。在脂肪细胞中，m6A去甲基化酶脂肪量和肥胖相关基因（FTO）的缺失通过转录后调控Angptl4影响脂肪酸动员和体重4。这些研究表明，m6A不仅调控mRNA的加工过程，还在胚胎发育及病理生理过程中发挥关键作用。m6A修饰的功能对未来治疗策略具有重要意义。

有多种方法可用于测量m6RNA 的修饰16-18. 传统上，薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）被用于研究m的分布6多种RNA中的A19,20质谱法是一种用于检测 m 的灵敏工具6RNA的修饰。然而，在通过质谱分析之前，需要先用RNase将RNA切割成短片段21. 甲基化RNA免疫沉淀测序（methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing，m6A-Seq22 免疫沉淀片段化RNA与m6A特异性抗体并进行平行RNA测序。该方法可生成全转录组范围的m6景观。m的高分辨率绘图6单核苷酸分辨率的交联免疫沉淀技术（miCLIP）进一步绘制了m6单核苷酸分辨率下的修饰23两种方法均提供了 m 的详细信息6全转录组范围内的修饰，包含特定基因的信息。然而，当实验需要比较多种条件时，这两种方法的定量与标准化均较为困难。此外，用于m的RNA片段化6A-Seq 改变了原始的 RNA 结构，这可能影响天然的 m6A水平。为了检测全局m6一种RNA修饰及其在不同实验条件下变化的研究方法，我们报道了一种采用改良的Northern印迹技术。该方法通过凝胶电泳根据分子量分离RNA18该方法为涉及多种条件或样本的实验提供了更佳的标准化和定量分析。同时，它也提供了特定的 m6不同RNA（如rRNA、mRNA或microRNA）的修饰信息

方案

注意：总RNA的m6A水平包括rRNA、mRNA及其他小RNA。由于核糖体RNA含有丰富的m6A修饰，因此在测定m6A水平时需考虑这一因素。

1. RNA 提取

  1. 使用核糖核酸酶去污染溶液（喷洒于纸巾上）擦拭移液器和实验台表面。再用无核酸酶水润湿纸巾，再次擦拭移液器和实验台表面。
  2. RNA 提取
    1. 总 RNA 分离
      1. 使用顶置式搅拌器，在 1 mL 保持于 4 °C 的 RNA 分离溶液中匀浆 50–100 mg 组织或 5–10 × 106 个细胞。
        注意：由于小鼠脂肪组织样本中 RNA 浓度较低，可能需要更多组织（100–150 mg）。先前研究已使用来自小鼠心脏、肝脏、骨骼肌、肺、脑及巨噬细胞的样本4。
      2. 将样品匀浆液在室温下孵育 5 分钟。
      3. 每 1 mL 样品匀浆液中加入 100 µL 1-溴-3-氯丙烷（BCP），剧烈振荡试管 15 秒，然后按照制造商说明书24进行总 RNA 的提取。
    2. 从分离的总 RNA 中纯化多聚腺苷酸化 mRNA
      1. 使用现有的试剂盒或方案纯化多聚腺苷酸化 mRNA。
        1. 充分振荡以重悬以下各溶液：2× 结合溶液、寡聚(dT) 聚苯乙烯磁珠和洗涤溶液。确保寡聚(dT) 磁珠在使用前恢复至室温。
        2. 将每份制备所需的 120 µL 洗脱液转移至离心管中，并在加热块中加热至 70 °C。
        3. 用移液器将最多 500 µg 总 RNA 加入微量离心管中，并用无核酸酶水调整体积至 250 µL。
        4. 向总 RNA 溶液中加入 250 µL 2× 结合溶液，短暂涡旋混匀。
        5. 加入 15 µL 寡聚(dT) 磁珠，充分涡旋混匀。
        6. 将混合物在 70 °C 下孵育 3 分钟。
        7. 从加热块中取出样品，在室温下静置 10 分钟。
        8. 在 15,000 × g 下离心 2 分钟。
        9. 小心移除上清液，保留约 50 µL。
        10. 用移液器加入 500 µL 洗涤溶液以重悬沉淀。
        11. 将悬液转移至离心过滤装置（含收集管）中。
        12. 在 15,000 × g 下离心 2 分钟。将滤柱从收集管中取出，弃去穿滤液，再将滤柱放回收集管中。
        13. 用移液器将 500 µL 洗涤溶液加至离心滤膜上。
        14. 在 15,000 × g 下离心 2 分钟。
        15. 将离心滤柱转移至新的收集管中。
        16. 用移液器将 50 µL 预热至 70 °C 的洗脱液加至离心滤膜中心。
        17. 在 70 °C 下孵育 2–5 分钟，在 15,000 × g 下离心 1 分钟。
        18. 再用移液器将额外的 50 µL 预热至 70 °C 的洗脱液加至离心滤膜中心。
        19. 重复步骤 1.2.2.1.18。
      2. 加入终浓度为 100 µg/mL 的糖原、0.1 倍体积的 3 M 醋酸钠缓冲液（pH 5.2）以及 2.5 倍体积的无水乙醇，在 -80 °C 下沉淀过夜。
      3. 在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 25 分钟，弃去上清液。
      4. 用 1 mL 75% 乙醇洗涤沉淀，在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 15 分钟，小心去除乙醇。
      5. 空气中干燥 3–5 分钟。
      6. 加入 10 µL 无核酸酶水以溶解沉淀。
      7. 于 -70 °C 保存。
  3. RNA 质量评估与定量
    1. 使用分光光度计，通过测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光度确定 RNA 浓度。A260/A280 比值应在 1.8–2.2 之间。
    2. 使用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 样品质量25。
      注意：完整的真核生物总 RNA 应显示清晰且强的 28S 和 18S rRNA 条带。高质量 RNA 制品中，28S 与 18S rRNA 条带强度的比值约为 2。

2. 凝胶电泳与转膜

注意：缓冲液配制方案见表1。

  1. 甲醛凝胶制备（1%）
    1. 使用焦碳酸二乙酯（DEPC）水冲洗所有电泳设备。
    2. 在微波炉中将2.5 g琼脂糖完全溶于215 mL DEPC水中。
    3. 加入12.5 mL 10× 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）缓冲液和22.5 mL 37%甲醛。
    4. 将混合液倒入带有1.5 mm厚梳子的电泳装置中。
    5. 消除气泡，或用干净的梳子将气泡推至凝胶边缘。
    6. 在室温下使凝胶凝固。
  2. 样品制备
    1. 将1–10 µg总RNA与11.3 µL上样缓冲液混合。
    2. 将2 µg RNA Marker（1 µg/µL）与11.3 µL上样缓冲液混合。
    3. 用无核酸酶水将2.2.1和2.2.2中的样品补至总体积16 µL。
    4. 在60 °C加热5分钟，然后置于冰上冷却。
    5. 在冰上将2.2.3中的16 μL样品与4 μL上样染料混合，上样染料中含有0.1 μg/μL溴化乙锭。
      注意：溴化乙锭可能具有致畸性和毒性，吸入时有害。请阅读溴化乙锭安全数据表。
  3. 电泳
    1. 将200 mL 10× MOPS缓冲液加入1,800 mL ddH2O中，配制成1× MOPS电泳缓冲液。
    2. 用1× MOPS电泳缓冲液冲洗凝胶的加样孔。
    3. 以20 V预电泳5分钟。
    4. 将RNA样品加入凝胶的加样孔中。
    5. 用铝箔覆盖以避免光照，以35 V电泳约17小时（过夜）。
    6. 在紫外光下观察并拍摄凝胶图像。
  4. 转膜
    1. 切去凝胶未使用的部分。
    2. 配制500 mL 10× SSC缓冲液（250 mL 20× SSC缓冲液加250 mL DEPC水）。
    3. 用10× SSC缓冲液振荡洗涤凝胶两次，每次20分钟，振速为50 rpm。
    4. 裁剪一张足够大的滤纸作为引流纸，用于从转膜槽中吸收转膜缓冲液（图1）。
    5. 裁剪4张与凝胶大小相同的滤纸。
    6. 裁剪一张带正电荷的尼龙膜，使其与凝胶大小相同。
    7. 在凝胶和膜上标记一个缺口作为方向标记，以确保正确取向。
    8. 将膜浸泡于2× SSC缓冲液中15分钟。
    9. 将500 mL 10× SSC缓冲液倒入转膜槽中。
    10. 将大张滤纸平铺在玻璃板上，并用转膜缓冲液润湿滤纸。
    11. 用移液器滚压去除任何气泡。
    12. 将2张预先裁剪好的滤纸浸入转膜缓冲液后，放置在步骤2.4.5的滤纸中央，去除气泡。
    13. 将凝胶正面朝下放置在滤纸上。
    14. 将膜放置在凝胶上方，对齐凝胶和膜上的缺口。
    15. 在膜上方放置2张预先裁剪好的滤纸，并用转膜缓冲液润湿。
    16. 去除各层之间的气泡。
    17. 用塑料膜包裹凝胶，确保吸水纸仅吸收穿过凝胶和膜的缓冲液。
    18. 在滤纸上堆叠吸水纸巾。
    19. 在纸巾上方放置一块较大的玻璃板。
    20. 在堆叠物上方放置重物。
    21. 静置过夜，使RNA从凝胶转移至膜上。

3. 检测 N6m⁶A（N6-甲基腺苷）

  1. 膜交联
    1. 用2x SSC缓冲液保持膜的湿润。
    2. 将两张浸有10x SSC缓冲液的滤纸放入紫外交联仪中。
    3. 将膜放置在滤纸上方，使吸附RNA的一面朝上。
    4. 选择 "自动交联模式" （120,000 µJ）并按下 "开始" 按钮以启动辐照。
    5. 使用紫外凝胶成像仪检查膜和凝胶，以确认RNA已从凝胶转移至膜上。
  2. 免疫印迹法
    1. 在室温下用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭膜1小时。
    2. 用 TBST 缓冲液洗涤三次，每次 15 分钟。
    3. 将膜在 m 中孵育过夜6A (N6-methyladenosine) 抗体溶液（用5%脱脂牛奶TBST缓冲液按1:1,000稀释），4 °C孵育。
    4. 用 TBST 缓冲液洗涤膜三次，每次 15 分钟。
    5. 将膜置于HRP标记的驴抗兔抗体溶液（用5%脱脂牛奶TBST缓冲液按1:2,000稀释）中，室温孵育1小时。
    6. 用 TBST 缓冲液洗涤膜三次，每次 15 分钟。
    7. 加入增强型化学发光底物（每平方厘米0.125 mL）2 膜的）
    8. 根据制造商说明，使用数字成像仪的最佳设置捕获化学发光信号26.
  3. m6一种定量方法
    1. 测量相对 m6使用 ImageJ 软件检测化学发光强度。
      1. 在 ImageJ 软件菜单下，选择 "文件" 打开相关文件的选项。
      2. 选择 "矩形" 使用 ImageJ 的工具在信号周围绘制一个框。
      3. 如果核糖体RNA不是实验的研究重点，应避免针对18S和28S核糖体RNA6用于计算的条带
      4. 点击 "指令" 和 "1" 确认选定的泳道。
      5. 按压 "指令" 和 "3" 以显示选定的图表。
      6. 点击 "直的" 工具并绘制线条以分割已划分的区域。
      7. 点击 "魔棒" 用于记录测量数据的工具。
      8. 导出数据。
      9. 标准化 m 的水平6A 与溴化乙锭染色的18S核糖体RNA条带。

结果

在正常明暗昼夜节律条件下饲养14天后，将野生型小鼠置于持续黑暗环境中。每隔4小时采集一次肝脏组织RNA样本，并采用改良的Northern印迹法进行分析。结果显示，rRNA、mRNA和小RNA的甲基化修饰均被清晰检测到（图2）。通过18S rRNA作为标准，可对不同昼夜时间点（CT）之间的修饰水平进行精确比较。rRNA、mRNA和小RNA中的m6A修饰水平均呈现出显著的昼夜节律性振荡。

为避免rRNA的干扰，可对带有polyadenylated结构的RNA进行纯化，具体操作见步骤1.2.2。纯化后，rRNA可被大量去除，从而更清晰地观察其他RNA（图3）。

显示DNA转移装置的Southern印迹示意图，包括膜、凝胶和10X SSC缓冲液。
图1：组装印迹转移装置。 图示为将RNA转移至膜上的毛细管转移装置。请点击此处查看该图的放大版本。

RNA电泳图；m6A修饰分析，昼夜时间过程，28S/18S rRNA。
图2：C57BL/6J小鼠中m6A水平的昼夜节律。 本图显示了在正常光暗周期14天后，转入全黑暗阶段第一天每隔4小时处死的野生型小鼠肝脏总RNA的m6A印迹结果。定量分析基于18S与28S rRNA之间m6A图像密度的差异进行。m6A丰度通过底部甲醛凝胶中18S rRNA条带进行归一化处理。请点击此处查看该图的放大版本。

RNA甲基化分析；电泳结果；总RNA与polyA尾RNA；28S、18S条带
图3：含有或不含rRNA的m6A印迹结果。 展示了来自野生型小鼠肝脏的总RNA和polyA尾RNA的代表性m6A印迹结果。请点击此处查看该图的放大版本。

110x MOPS 缓冲液（pH 7.0，避光保存）
MOPS41.85g0.2 M
醋酸钠4.1g0.05 M
EDTA 二钠盐3.7g0.01 M
DEPC 水
定容至1L
室温搅拌溶解
220x SSC 缓冲液（pH 7.0）
氯化钠175.3g3 M
柠檬酸三钠88.3g0.3 M
DEPC 水
定容至1L
室温搅拌溶解，随后高压灭菌
3示踪染料
10x MOPS 缓冲液500μL1x
Ficoll 4000.75g15%
溴酚蓝0.01g0.2%
二甲苯青0.01g0.2%
DEPC 水
定容至5mL
-20 °C 保存
4DEPC 水
将 DEPC 按 1:1,000 比例稀释于 ddH2O 中
室温搅拌过夜，随后高压灭菌
5上样缓冲液（避光保存）
10x MOPS 缓冲液200μL
37% 甲醛270μL
甲酰胺660μL
-20 °C 保存

表1：缓冲液与溶液。

讨论

RNA 修饰在细胞功能和生理学中具有重要作用。目前对这些修饰的调控、功能及稳态机制的理解仍在不断探索和扩展中8。因此，亟需一种精确且具有金标准水平的方法来评估 RNA 修饰。改良的 Northern 印迹法可实现对 RNA 修饰的精确定量，并清晰地区分多种 RNA 中的修饰状态。尽管该方法至少需要 3 天时间，但其可实现标准化，并适用于多种实验设计。此外，通过使用不同的抗体，该方法能够检测不同的 RNA 修饰27。

在分析RNA修饰时，分离不同类型的RNA非常重要。核糖体RNA（rRNA）占总RNA的很大比例28,29。若仅对总RNA进行修饰分析，所得结果主要反映的是rRNA的修饰变化。rRNA的甲基化及其他类似修饰可能会掩盖其他RNA的修饰变化。通过凝胶分离步骤，可更准确地分析mRNA及其他小RNA的修饰情况。

通过m6A免疫沉淀结合测序技术对转录组范围内的修饰进行作图，可深入揭示各类RNA的修饰情况22。该方法能够提供特定RNA的信息，分辨率为约80–120 bp。尽管m6A-Seq可用于比较不同实验条件下的修饰差异，但此类实验中合适标准与对照的选择较为困难18。免疫沉淀实验重复性较差，多次重复之间常出现显著变异。此外，m6A-Seq在免疫沉淀和测序前需对RNA样本进行片段化处理30。该片段化过程可能对原始RNA修饰产生非预期的影响。若实验无需特定基因的信息，而需在不同条件下进行比较，则当前方法可为多种实验设计提供更佳的可视化效果与实验控制。

RNA 修饰是调控转录控制的重要步骤31。然而，不同生理条件下各种 RNA 修饰的稳态及其调控机制仍不明确。利用本改良的 Northern 印迹法，可对不同的 RNA 修饰进行定量和比较。此外，还能更深入地研究 RNA 修饰的变化及其调控规律。未来，还有可能将经典 Northern 印迹法与改良 Northern 印迹法的实验数据相结合，从而更深入地揭示 RNA 生物学的机制。

决定改良型Northern印迹实验成败的最重要因素是RNA样本的完整性。即使存在一定程度降解的RNA可能仍能获得良好的传统Northern印迹结果，但这可能会对改良型Northern印迹的结果产生显著影响。不同组织或细胞系中RNA的修饰情况也可能存在显著差异。在开展最终实验之前，有必要针对不同组织测试合适的RNA上样量。

由于印迹技术传统上以桑瑟恩博士的名字以及不同的地理方位命名，我们建议将本技术命名为“northeastern印迹法”。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

C.Y.W. 获得了国家卫生研究院（NHRI-EX101-9925SC）、国家科学委员会（101-2314-B-182-100-MY3、101-2314-B-182A-009）以及长庚纪念医院（CMRPG3B1643、CMRPG3D1002、CMRPG3D0581、CMRPG380091 和 CMRPG3C1763）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RNaseZap 溶液AmbionAM9782方案 1.1
TRI Reagent 溶液AmbionAM9738方案 1.2.1.1
1-溴-3-氯丙烷（BCP）SigmaB9673方案 1.2.1.3
乙醇JTbaker8006方案 1.2.1.3
异丙醇SigmaI9516方案 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep 试剂盒SigmaMRN70方案 1.2.2.1
糖原AmbionAM9510方案 1.2.2.2
乙酸钠Fluka71183方案 1.2.2.2
无核酸酶水AmbionAM9930方案 1.2.2.6
DEPCSigmaD5758方案 2.1.1
琼脂糖JT BakerA426方案 2.1.2
MOPSSigmaM1254方案 2.1.3
37% 甲醛溶液SigmaF8775方案 2.1.3
EDTA 二钠盐JT Baker8993方案 2.1.3 10x MOPS 缓冲液
甲酰胺SigmaF7503方案 2.2.1
RNA Millennium MarkerAmbionAM7150方案 2.2.2
溴化乙锭AmrescoX328方案 2.2.5
Ficoll PM400GE Healthcare17-0300-10方案 2.2.5 示踪染料
溴酚蓝Sigma114391方案 2.2.5 示踪染料
二甲苯青 FFSigmaX4126方案 2.2.5 示踪染料
二水合氯化钠JT Baker3624方案 2.4.2 20x SSC 缓冲液
柠檬酸三钠SigmaS1804方案 2.4.2 20x SSC 缓冲液
Hybond 印迹纸GE HealthcareRPN6101M方案 2.4.4
GE Hybond-N+ 膜GE HealthcareRPN303B方案 2.4.6
Stratalinker UV 交联仪 2400Stratagene400075方案 3.1.2
Gel Catcher 1500ANT TechnologyGel Catcher 1500方案 3.1.5
抗-m6A（N6-甲基腺苷）Synaptic Systems202003方案 3.2.3
Amersham ECL 抗兔 IgG，HRP 标记的全抗体GE HealthcareNA934方案 3.2.5
ChemiDoc MP 系统BIO-RAD1708280方案 3.2.8

参考文献

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RNA Northern RNA m6A
一种用于检测细胞和组织中RNA N6-甲基腺苷修饰的方法
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