平行测量人原代细胞培养物中的昼夜节律钟基因表达与激素分泌

摘要

在此，我们描述了用于并行监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及分泌活性的实验设置。为此，我们采用慢病毒载体递送荧光素酶核心钟基因报告系统，随后 体外 通过连续细胞灌流同步化并收集流出液

摘要

昼夜节律钟存在于所有感光生物中，通过预测外界环境的每日变化，使生物体能够适应外部世界。在过去十年中，人们对昼夜节律钟与生理学大多数方面之间紧密联系的理解取得了显著进展。然而，揭示人类昼夜节律振荡器功能的分子基础仍面临极高的技术挑战。本文详细描述了一种用于培养中的人原代细胞进行长期（2-5天）生物发光记录及流出液培养基收集的实验方法。为此，我们利用慢病毒载体将一种受核心时钟基因启动子调控的荧光素酶报告系统转导至原代细胞中，从而实现激素分泌与昼夜节律性生物发光的同步检测。此外，我们还描述了通过转染靶向CLOCK基因的siRNA来干扰人原代细胞中昼夜节律钟功能的实验条件。本文展示了该方法在人胰岛细胞胰岛素分泌节律调控以及人骨骼肌细胞肌因子分泌节律研究中的应用实例。该实验体系可用于研究人类外周时钟的分子组成，并分析其在生理或病理生理条件下对原代细胞功能的影响。

引言

昼夜节律系统（源自拉丁文 拉丁文 "Circa diem"）作为一种适应地球自转的机制，已在所有感光生物中演化形成。在哺乳动物中，该系统呈层级化组织，包括位于下丘脑腹侧视交叉上核的中枢时钟，以及分布于不同器官中的外周（或称从属）振荡器。此外，这些细胞自主的、可自我维持的振荡器几乎在机体所有细胞中均具有功能¹。光信号是视交叉上核神经元主要的同步化刺激（Zeitgeber），而从中枢时钟发出的神经和体液信号则可重置外周时钟。此外，由休息-活动节律所驱动的摄食-禁食周期，也是外周时钟的进一步同步化因素²。根据目前的认识，核心时钟的分子构成基于转录与翻译的负反馈环路，这些机制在不同生物间具有保守性。该系统包括转录激活因子BMAL1和CLOCK，二者共同激活负向核心时钟基因PER和CRY的转录。当PER和CRY蛋白水平升高时，会通过抑制BMAL1/CLOCK复合物而抑制自身的转录。另一个辅助环路由核受体REV-ERBs和RORs组成，它们也调控BMAL1和CLOCK的转录。此外，核心时钟蛋白的翻译后修饰事件，包括磷酸化、SUMO化、乙酰化、O-GlcNAc糖基化、降解以及核转位，构成了建立24小时振荡周期的另一重要调控层次³。

越来越多的证据来自啮齿类动物模型的研究，强调了昼夜节律系统在协调代谢和内....

方案

伦理声明：本方案中所包含的操作已获得瑞士日内瓦大学医院伦理委员会以及SUD EST IV伦理委员会（协议编号12/111）的批准¹⁹。人胰岛是从脑死亡的多器官捐献者的胰腺中分离获得，分离工作在瑞士日内瓦大学医院胰岛移植中心完成，具体方法见我们之前发表的文献^16,18；部分人胰岛则购自商业来源。

1. 原代细胞培养的制备

1. 人胰岛的分离、解离与培养
   注意：为防止胰岛或胰岛细胞黏附于塑料表面而导致细胞材料大量损失，需使用康诺特医学研究实验室（Connaught Medical Research Laboratories, CMRL）培养基对所有试管、塑料枪头或移液器进行预包被。
   1. 在胰岛细胞解离前一天，向每个3.5 cm培养皿中加入1 ml富含层粘连蛋白-5的细胞外基质（来源于804G细胞，方法见参考文献²⁹）。接种细胞前，吸除基质，并用无菌双蒸水洗涤培养皿3次。将培养皿置于超净工作台中晾干5分钟。
   2. 在超净工作台内，将获得的胰岛用CMRL培养基转移至15 ml离心管中。以272 × g离心5分钟。
   3. 吸除上清液，将沉淀重悬于1 ml预热至37 °C的无钙镁杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）中。以272 × g离心5分钟。
   4. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml DPBS中。
   5. 为....

结果

利用平行灌流人胰岛细胞的昼夜生物发光记录评估胰岛激素分泌

在首次对人类胰岛细胞中运作的生物钟进行分子表征之后 ¹⁶我们旨在研究生物钟紊乱对胰岛功能和转录的影响 ¹⁸我们建立了一个高效的 siClock 分散的人类胰岛细胞转染方案（参见 实验方案 （详情见下文），导致敲低效率超过80% CLOCK mRNA，以及通过昼夜节律生物发光分析测定的高效时钟基因消融 ¹⁸葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）分析显示，生物钟紊乱后基础和刺激状态下的胰岛素分泌均显著降低（未展示）。为评估人胰岛细胞全天候的激素分泌情况，将连续灌流系统连接至发光检测仪（如图所示） 图1B）。人胰岛细胞具有功能性（siControl）或功能障碍的（siClock振荡器被转导了 B.......

讨论

本文所述实验设置包括将昼夜节律生物发光报告基因通过慢病毒递送至培养的人原代细胞，随后进行体外同步化处理，并对同一细胞连续数天进行生物发光信号的持续记录，同时平行分析这些细胞的激素分泌情况。该方法为研究人原代细胞中昼夜节律钟的分子机制与功能特性提供了一种高效途径。

供体材料的质量是制备可存活原代组织培养物的重要因素。每次实验开始前都应评估人胰岛的质量。不建议将纯度或/和存活率估计低于70%的胰岛用于此类实验。在解离培养过程中，胰岛细胞倾向于重新建立细胞间连接，这对它们的存活和功能具有重要作用。由于胰岛细胞在培养中不增殖，因此必须以高密度接种，以使细胞能够与邻近细胞形成接触。这可通过将细胞接种于小体积液滴中实现。值得注意的是，低密度胰岛细胞培养中的细胞死亡率更高。请注意，更换培养基时应迅速进行，以避免细胞干燥。

成肌细胞最好在60%融合度时进行传代，因为密度过高可能诱导成肌细胞分化。消化后，应小心重悬并充分分散成肌细胞，以避免形成细胞团块。

在开始灌流实验之.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25300-054	用于肌肉活检消化
不含钙不含镁的DPBS	Invitrogen	14190-094
HAM F-10	Invitrogen	41550-021	成肌细胞培养
FBS	Invitrogen	10270	培养基补充剂
青霉素-链霉素	Sigma	P0781-100	培养基补充剂
庆大霉素	轴突	A1492.0001	培养基补充剂
Fungizone	Invitrogen	15290-026	两性霉素B，培养基添加剂
DMEM 1 g/L 葡萄糖 + 丙酮酸钠 + GlutaMAX	Invitrogen	21885-025	用于成肌细胞培养
DMEM 1 g/L 葡萄糖 - Na丙酮酸盐 - 谷氨酰胺替代物	Invitrogen	11880-028	LumiCycle 记录培养基
Glutamax	Invitrogen	35050-028	L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽，培养基添加物
Accutase	创新细胞技术	AT-104	用于胰岛细胞解离的细胞解离液
CMRL	Gibco	21530-027	胰岛细胞培养基
丙酮酸钠	Gibco	11360-039	培养基补充剂
15 ml 高透明度聚丙烯锥形管	Falcon	352096
F75 培养瓶	BD Falcon	353136
3.5 cm 培养皿	BD Falcon	353001
Foskolin	Sigma	F6886	腺苷酸环化酶激活剂，用于同步化
荧光素	Prolume LTD	260150	记录培养基的补充剂
OptiMEM	Invitrogen	51985-026	用于人胰岛细胞转染的无血清最低限度必需培养基（MEM）
Lipofectamine RNAiMAX 试剂	Invitrogen	13778-150	转染试剂
HiPerFect 试剂	Qiagen	301705	转染试剂
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool	Dharmacon	L-008212-00
ON-TARGETplus 非靶向 siRNA #1（siControl）	Dharmacon	D-001810-01
DNeasy 血液 & 组织试剂盒	Qiagen	69504	用于肌管的DNA提取
RNeasy Plus Mini 试剂盒	Qiagen	74104	用于成肌细胞融合成管状结构的RNA提取
QIAshredder	Qiagen	79654	用于成肌管的RNA提取
2 ml 收集管	Axygen	311-10-051	收集灌流液
6孔组织培养板	BD Falcon	353046	收集灌流液
RNeasy Plus Micro 试剂盒	Qiagen	74034	用于胰岛RNA提取
人IL-6即用型ELISA试剂盒	eBioscience	88-7066-22
人胰岛素试剂盒 Mercodia	Mercodia	10-1113-01
盐酸，最小含量37%，p.a.	Acros Organics	124630010	用于裂解缓冲液的配制（375 ml 乙醇 + 7.5% HCl + 117.5% H2O
乙醇（>99.8%)	Fluka 分析	02860-1L	用于裂解缓冲液的制备（375 ml 乙醇 + 7.5% HCl + 117.5% H2O
用于研究的人类胰岛	Prodo Laboratories
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>设备：
离心	Heraeus	Megafuge 1.0R
水浴锅	VWR	1112A	37℃ °C
组织培养罩	更快	SafeFastElite
组织培养箱	Heraeus	HeraCell 150	5% CO2 37℃ °C，由于LumiCycle安装导致无水
组织培养箱	Heraeus	HeraCell 150	5% CO₂2 37℃ °C，由于安装了LumiCycle，无水
组织培养箱	赛默飞世尔科技	Hera Cell 150i	5% CO2 37℃ °C
摇床	Heidolph Instruments	Unimax 1010	用于siRNA混合物的振荡
LumiCycle	Actimetrics
LumiCycle 软件	Actimetrics
CosinorJ 软件	洛桑联邦理工学院		自由获取地址：http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX	ERC GmbH		控制自动化开关时序的控制软件