平行测量人原代细胞培养物中的昼夜节律钟基因表达与激素分泌

摘要

在此，我们描述了用于并行监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及分泌活性的实验设置。为此，我们采用慢病毒载体递送荧光素酶核心钟基因报告系统，随后 体外 通过连续细胞灌流同步化并收集流出液

摘要

昼夜节律钟存在于所有感光生物中，通过预测外界环境的每日变化，使生物体能够适应外部世界。在过去十年中，人们对昼夜节律钟与生理学大多数方面之间紧密联系的理解取得了显著进展。然而，揭示人类昼夜节律振荡器功能的分子基础仍面临极高的技术挑战。本文详细描述了一种用于培养中的人原代细胞进行长期（2-5天）生物发光记录及流出液培养基收集的实验方法。为此，我们利用慢病毒载体将一种受核心时钟基因启动子调控的荧光素酶报告系统转导至原代细胞中，从而实现激素分泌与昼夜节律性生物发光的同步检测。此外，我们还描述了通过转染靶向CLOCK基因的siRNA来干扰人原代细胞中昼夜节律钟功能的实验条件。本文展示了该方法在人胰岛细胞胰岛素分泌节律调控以及人骨骼肌细胞肌因子分泌节律研究中的应用实例。该实验体系可用于研究人类外周时钟的分子组成，并分析其在生理或病理生理条件下对原代细胞功能的影响。

引言

昼夜节律系统（源自拉丁文 拉丁文 "Circa diem"）作为一种适应地球自转的机制，已在所有感光生物中演化形成。在哺乳动物中，该系统呈层级化组织，包括位于下丘脑腹侧视交叉上核的中枢时钟，以及分布于不同器官中的外周（或称从属）振荡器。此外，这些细胞自主的、可自我维持的振荡器几乎在机体所有细胞中均具有功能¹。光信号是视交叉上核神经元主要的同步化刺激（Zeitgeber），而从中枢时钟发出的神经和体液信号则可重置外周时钟。此外，由休息-活动节律所驱动的摄食-禁食周期，也是外周时钟的进一步同步化因素²。根据目前的认识，核心时钟的分子构成基于转录与翻译的负反馈环路，这些机制在不同生物间具有保守性。该系统包括转录激活因子BMAL1和CLOCK，二者共同激活负向核心时钟基因PER和CRY的转录。当PER和CRY蛋白水平升高时，会通过抑制BMAL1/CLOCK复合物而抑制自身的转录。另一个辅助环路由核受体REV-ERBs和RORs组成，它们也调控BMAL1和CLOCK的转录。此外，核心时钟蛋白的翻译后修饰事件，包括磷酸化、SUMO化、乙酰化、O-GlcNAc糖基化、降解以及核转位，构成了建立24小时振荡周期的另一重要调控层次³。

越来越多的证据来自啮齿类动物模型的研究，强调了昼夜节律系统在协调代谢和内分泌功能中的关键作用^4-5。多项大规模转录组分析表明，进食–禁食周期在周围振荡器的同步化过程中起着核心作用^6-8。与这些研究一致，对啮齿类动物和人类进行的代谢组学和脂质组学分析揭示，大量代谢物在组织、血浆和唾液中均以昼夜节律方式振荡^9-11。重要的是，大多数激素在血液中表现出昼夜节律^5,12-13。此外，相应激素产生组织的外周生物钟可能在局部调控激素的分泌。已在啮齿类动物和人类胰岛细胞中发现细胞自主性的昼夜振荡器^14-16。这些振荡器在调控胰岛转录组及其功能方面发挥着重要作用^15,17-18。此外，最近研究证实，人骨骼肌管状细胞分泌的肌因子也呈现昼夜节律模式，该节律由这些细胞内运作的细胞自主性振荡器所调控¹⁹。

研究人类昼夜节律的多种方法 体内 已被广泛使用。例如，血浆褪黑素或皮质醇水平以及胸部皮肤表面温度（详见参考文献） ^3,20) 已被用于评估内源性生物钟。尽管这些方法能够用于研究全身性的昼夜节律振荡 体内，它们远不能提供对不同器官和组织中自由运行的自主昼夜节律的可靠评估。然而，脱离系统性调控的此类研究方法对于理解细胞内分子钟对这些细胞功能的特异性影响而言，将是不可或缺的工具。因此，研究人员已投入大量努力，致力于开发可靠的方法，用于研究在永生化细胞或经同步化的原代培养细胞中的人体生物钟 体外重要的是，已有研究表明，在培养的原代皮肤成纤维细胞中测得的生物钟特征能够很好地反映整个机体的个体化生物钟特性 ²¹荧光和生物发光昼夜节律报告系统的开发极大地推动了这一方法的发展 ^22-27此外，研究来源于不同外周器官的原代细胞钟，有助于探究人类组织特异性生物钟的分子特性。 ^{3,5,16,19-20,28}因此，昼夜节律钟的评估在 体外 利用生物发光报告系统对同步化原代外植体或细胞进行研究，是探索人体外周生物钟的分子构成及其对器官功能影响的极为有效的方法。

本文将介绍评估经同步化处理的人原代胰岛细胞和骨骼肌细胞中昼夜节律基因表达的详细实验方案 体外 以及自主性细胞生物钟紊乱对这些细胞分泌功能的影响。

方案

伦理声明：本方案中所包含的操作已获得瑞士日内瓦大学医院伦理委员会以及SUD EST IV伦理委员会（协议编号12/111）的批准¹⁹。人胰岛是从脑死亡的多器官捐献者的胰腺中分离获得，分离工作在瑞士日内瓦大学医院胰岛移植中心完成，具体方法见我们之前发表的文献^16,18；部分人胰岛则购自商业来源。

1. 原代细胞培养的制备

1. 人胰岛的分离、解离与培养
   注意：为防止胰岛或胰岛细胞黏附于塑料表面而导致细胞材料大量损失，需使用康诺特医学研究实验室（Connaught Medical Research Laboratories, CMRL）培养基对所有试管、塑料枪头或移液器进行预包被。
   1. 在胰岛细胞解离前一天，向每个3.5 cm培养皿中加入1 ml富含层粘连蛋白-5的细胞外基质（来源于804G细胞，方法见参考文献²⁹）。接种细胞前，吸除基质，并用无菌双蒸水洗涤培养皿3次。将培养皿置于超净工作台中晾干5分钟。
   2. 在超净工作台内，将获得的胰岛用CMRL培养基转移至15 ml离心管中。以272 × g离心5分钟。
   3. 吸除上清液，将沉淀重悬于1 ml预热至37 °C的无钙镁杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）中。以272 × g离心5分钟。
   4. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml DPBS中。
   5. 为计数胰岛总数，从1 ml胰岛悬液中吸取10 µl加入新的3.5 cm培养皿中。在显微镜下计数10 µl液滴中的胰岛数量，并据此推算1 ml悬液中的总胰岛数。加入14 ml DPBS，再次以272 × g离心5分钟。
   6. 进行胰岛细胞解离时，吸除上清液，加入1 ml细胞解离液，适用于最多1,000个胰岛当量（IEQ）。将离心管置于37 °C水浴中，每分钟轻柔吹打数次，持续6–10分钟。
      注意：为评估消化效果，取2 µl悬液滴于载玻片上，在显微镜下观察，确认所有细胞均已充分分离，无双联细胞或细胞团块残留。
   7. 加入14 ml含补充剂的冷CMRL培养基（含10%胎牛血清（FBS）、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽、1%青霉素-链霉素（P/S）、1%庆大霉素、1%丙酮酸钠）终止反应。以425 × g离心5分钟。吸除上清液，向细胞沉淀中加入15 ml CMRL培养基。
   8. 用少量含补充剂的CMRL培养基重悬沉淀。使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞数量，并调整CMRL体积，使细胞浓度达到约650,000个细胞/ml。
   9. 从步骤1.1.8获得的分散细胞悬液中，吸取3个100 µl的液滴，分别滴加至预先包被层粘连蛋白的3.5 cm培养皿中。
      注意：细胞约在24小时内贴附于培养皿表面。
   10. 将细胞（图1A）置于37 °C、湿润环境的组织培养孵箱中孵育。每隔2–3天更换一次液滴中的培养基，方法为从每个液滴中吸出100 µl，补充等体积的新鲜培养基。
2. 人原代成肌细胞培养及其向肌管细胞的分化
   1. 组织活检、卫星细胞分离与成肌细胞培养
      注意：肌肉活检样本来自法国里昂（Lyon, France）法国国家健康与医学研究院（INSERM）Etienne Lefai研究组¹⁹。
      1. 按照先前描述的方法³⁰纯化原代骨骼肌成肌细胞。
   2. 人原代成肌细胞向肌管细胞的分化
      1. 取一管保存于液氮中的人成肌细胞（1 × 10⁶个细胞），在37 °C水浴中轻轻振荡30秒至1分钟，快速解冻。
      2. 将细胞（1 ml）加入24 ml生长培养基中，该培养基由HAM F-10培养基组成，添加20% FBS、1% P/S、0.5%庆大霉素和0.2%两性霉素B。
      3. 以150 × g离心5分钟。
      4. 弃去上清液，按每2.5 × 10⁵个细胞加入15 ml新鲜生长培养基重悬细胞。
      5. 将至少2.5 × 10⁵个细胞接种至F75贴壁培养瓶中。将成肌细胞置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。
      6. 当细胞融合度达到60–80%时，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化1–2分钟，将细胞接种至含2 ml生长培养基的3.5 cm贴壁培养皿中。
      7. 待细胞达到完全融合后，移除生长培养基。
      8. 开始人成肌细胞向肌管细胞的分化程序：将细胞置于含2 ml分化培养基的培养箱中，培养基为含1 g/L葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并添加2% FBS、1% P/S、0.5%庆大霉素和0.2%两性霉素B（分化培养基），在37 °C、5% CO₂条件下培养。每隔2至3天更换一次培养基。
         注意：肌管细胞通常在7–10天内形成。
      9. 在显微镜下观察成肌细胞融合形成多核肌管细胞的过程，以评估肌肉细胞的分化情况（图2A）¹⁹。

2. 小干扰RNA（siRNA）转染

1. 人胰岛细胞的siRNA转染
   注意：转染程序在细胞解离后的第二天以100 µl液滴形式进行（步骤1.1.1–1.1.10）。
   1. 转染前2小时，用移液器吸出每个液滴中的100 µl CMRL培养基，并替换为等体积的无血清最低必需培养基（MEM）。
   2. 根据制造商说明书，配制含有转染试剂和50 nM靶向siRNA（siClock）或50 nM非靶向siControl的MEM基础混合液。
      1. 对于含3个液滴的一块培养皿，准备两个1.5 ml离心管，每管加入200 µl MEM。
      2. 向其中一个管中加入4 µl转染试剂。
      3. 向另一个管中加入1 µl适当浓度的siRNA储备液（20 µM）。
      4. 将这两个管在摇床上缓慢振荡5分钟，然后将两管内容物混合，再继续振荡20分钟。
   3. 用移液器吸出每个液滴中的100 µl MEM，并替换为上一步所得的等体积转染混合液。
   4. 在37 °C孵育4小时后，将转染液替换为CMRL培养基。次日重复步骤2.1.1–2.1.3，以实现细胞再转染。
2. 人成肌细胞的siRNA转染
   1. 转染前，将每3.5 cm培养皿中的培养基（见步骤1.2.2.8）更换为2 ml新鲜分化培养基。
   2. 在无菌1.5 ml离心管中，配制含20 nM siRNA（siControl或siClock）的混合液，相当于2.4 µl的20 µM siRNA溶液，加入12 µl转染试剂，并用100 µl分化培养基稀释。室温下轻柔振荡孵育15分钟。
   3. 每3.5 cm培养皿加入114.4 µl siRNA混合液进行转染，将细胞置于37 °C、5% CO₂的组织培养孵箱中孵育24小时。

3. 在活体人类原代细胞中并行进行激素分泌评估的持续长期昼夜节律生物发光记录

1. 通过慢病毒转导将昼夜节律生物发光报告系统导入人原代细胞
   注意：所有涉及慢病毒颗粒的操作必须在生物安全二级设施中进行，以对可能对人员和环境造成中等潜在危害的病原体采取额外防护措施。
   1. 通过共转染目的载体 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST/Bmal1-luc 或 pLV156-Per2-dLuc（称为 Bmal1-luc 和 Per2-luc质粒 ³¹ 使用聚乙烯亚胺法将慢病毒载体 pMD2G 和 psPAX 共转染至 293T 细胞中（详细步骤参见参考文献） ¹⁶).
   2. 滴定所获得的慢病毒颗粒（滴定详情可参见 http://lentilab.unige.ch/）。后续实验应使用滴度在 10 范围内的慢病毒⁴ 至 10⁵ 转导单位 [TU/µl]
   3. 将人胰岛细胞或人成肌细胞（细胞融合度为30-50%）的培养皿置于超净工作台内，分别更换为2 ml新鲜的添加物补充CMRL培养基（见步骤1.1.7）或生长培养基（见步骤1.2.2.2）。
   4. 计算感染复数（MOI）即 感染性颗粒（转导单位）/细胞数量
   5. 通过移液将慢病毒溶液加入培养皿中，转导原代细胞培养物，以获得 MOI = 3（例如，对于 65,000 个贴壁细胞，加入 3 µl 滴度为 6.5 x 10 的病毒溶液）⁴ 至100 µl培养基液滴中
   6. 在组织培养箱中孵育过夜。次日更换培养基。
      注意：为了在生物发光记录前实现报告基因构建体的充分表达，需至少提前4天转导人胰岛细胞。成肌细胞在扩增阶段进行转导，随后培养至融合，并进一步分化为肌管。
2. 体外 人原代细胞的同步化
   1. 向每个含有在步骤3.1.5中已进行转导的原代细胞的3.5 cm培养皿中的2 ml培养基中加入10 µM的腺苷酸环化酶激活剂。
   2. 在37 °C细胞培养箱中孵育60分钟。
   3. 更换含有腺苷酸环化酶激活剂的培养基，加入2.5 ml含有100 µM 荧光素的记录培养基。
      注意：人胰岛细胞使用添加10% FBS、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、1% P/S、1%庆大霉素的CMRL培养基；人肌管细胞使用含1 g/L葡萄糖的无酚红DMEM，补充2% FBS、2% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、1% P/S、0.5%庆大霉素和0.2%两性霉素B。

4. 同步化人分泌型原代细胞中昼夜节律生物发光记录与激素分泌谱的平行评估

1. 建立用于人原代细胞的长期恒定灌流与生物发光记录。
   注意：在超净工作台外操作时，需清洁所有接触表面，并尽量减少培养物或培养基暴露于空气中的时间，以避免污染。
   1. 配制灌流培养基时，向培养基中加入 100 µM 荧光素。
      注意：人胰岛细胞使用添加了 10% FBS、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、1% P/S、1% 庆大霉素的 CMRL 培养基；人肌管细胞使用含 1 g/L 葡萄糖的无酚红 DMEM，补充 2% FBS、2% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、1% P/S、0.5% 庆大霉素和 0.2% 两性霉素 B。
   2. 在超净工作台内，打开含有上述经转导、转染并同步化的原代细胞培养物（胰岛细胞或肌管细胞）的 3.5 cm 培养皿。将自制的无菌金属帽（图 1B2）插入配备有硅胶进液/出液连接管的 3.5 cm 培养皿中（图 1B1/B5）。
   3. 将培养皿放置于 37 °C 黑暗培养箱内的测量平台上。使用可旋紧的适配器将培养皿固定在平台上（图 1B3）。将灌流系统的进液/出液管插入金属帽对应的硅胶管中（图 1B1/B5），并将泵速设置为约每小时 0.5 ml 培养基的流速。
   4. 打开自行开发的 Drip-biolumicorder 软件，用于记录光电倍增管（PMT）检测器的信号。选择数据存储目录，点击 "开始" 图标，开始对每个培养皿进行连续的生物发光记录。
      注意：除 Drip-biolumicorder 软件外，也可使用其他程序（例如 LumiCycle）记录 PMT 检测器的信号。
   5. 将无菌的 6 孔细胞培养板置于冰上的收集盒中。
   6. 打开控制自动切换收集孔时间的控制软件。设定培养基收集的时间窗口（秒）。点击 "运行" 图标，每 4 小时（14,400 秒；每次约 2 ml）开始收集流出的培养基。
   7. 用移液器将每个收集孔中的流出培养基转移至无菌的 2 ml 离心管中并进行测量。在进行下一步操作前，将离心管保存于 -20 °C 冰箱中。每 24 小时重复步骤 4.1.5–4.1.6。
   8. 点击相应软件中的 "停止" 图标，终止生物发光记录和培养基流动。取下金属帽，并吸除培养皿中残留的培养基。
   9. 为归一化不同实验中获得的分泌蛋白数值，可选择提取 DNA（以基因组 DNA 含量归一化肌管细胞数据¹⁹），或向培养皿中加入 1 ml 裂解用酸-乙醇缓冲液（以总激素含量归一化胰岛细胞数据¹⁸）。

5. 通过连续灌流人原代内分泌细胞获取流出液，测定其中胰岛激素和肌因子水平

1. 胰岛素
   1. 根据制造商说明书，使用人胰岛素酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒对收集的时间点流出液中的基础胰岛素水平进行定量。
   2. 将数据归一化为每个孔中收集的培养基的绝对体积，并归一化为实验结束时（步骤4.1.9）经酸-乙醇处理细胞提取的总胰岛素含量。 ¹⁸.
2. 白细胞介素-6（IL-6）
   1. 量化  使用人 IL-6 ELISA 试剂盒，按照制造商说明书检测收集的时间点流出液中基础 IL-6 水平。
   2. 将数据归一化为每个孔中收集的培养基的绝对体积，并归一化为实验结束时（步骤4.1.9）的基因组DNA含量。

6. 生物发光与激素分泌谱的昼夜节律数据集分析

1. 生物发光分析
   1. 使用提供的软件分析生物发光谱¹⁹。
2. JTK-cycle 分析
   1. 使用 JTK_CYCLE 算法分析激素分泌谱和生物发光记录结果³²。
   2. 将昼夜节律周期宽度设置为 20-24 小时。
      注意：若实验条件为平行记录，可进行配对统计分析以比较实验结果。
3. CosinorJ 分析
   1. alternatively，使用 CosinorJ 软件分析激素分泌和昼夜节律生物发光谱²⁸。

结果

利用平行生物发光记录评估灌流人胰岛细胞的胰岛激素分泌

在首次提供人类胰岛细胞中运作的生物钟的分子特征描述后 ¹⁶我们旨在研究生物钟紊乱对胰岛功能和转录的影响 ¹⁸我们建立了一个高效的 siClock 分散的人类胰岛细胞转染方案（参见 实验方案 （详见方法），导致基因敲低超过80% CLOCK mRNA，以及通过昼夜节律生物发光分析测定的高效时钟基因消融 ¹⁸葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）分析显示，生物钟紊乱导致基础和刺激状态下的胰岛素分泌显著降低（未展示）。为评估人胰岛细胞在全天候条件下的激素分泌情况，将连续灌流系统连接至发光检测仪（如图所示） 图1B）。人胰岛细胞具有功能性（siControl）或功能障碍的（siClock振荡器被转导了

讨论

本文所述实验设置包括将昼夜节律生物发光报告基因通过慢病毒递送至培养的人原代细胞，随后进行体外同步化处理，并对同一细胞连续数天进行生物发光信号的持续记录，同时平行分析这些细胞的激素分泌情况。该方法为研究人原代细胞中昼夜节律钟的分子机制与功能特性提供了一种高效途径。

供体材料的质量是制备可存活原代组织培养物的重要因素。每次实验开始前都应评估人胰岛的质量。不建议将纯度或/和存活率估计低于70%的胰岛用于此类实验。在解离培养过程中，胰岛细胞倾向于重新建立细胞间连接，这对它们的存活和功能具有重要作用。由于胰岛细胞在培养中不增殖，因此必须以高密度接种，以使细胞能够与邻近细胞形成接触。这可通过将细胞接种于小体积液滴中实现。值得注意的是，低密度胰岛细胞培养中的细胞死亡率更高。请注意，更换培养基时应迅速进行，以避免细胞干燥。

成肌细胞最好在60%融合度时进行传代，因为密度过高可能诱导成肌细胞分化。消化后，应小心重悬并充分分散成肌细胞，以避免形成细胞团块。

在开始灌流实验之...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25300-054	用于肌肉活检消化
不含钙不含镁的DPBS	Invitrogen	14190-094
HAM F-10	Invitrogen	41550-021	成肌细胞培养
FBS	Invitrogen	10270	培养基补充剂
青霉素-链霉素	Sigma	P0781-100	培养基补充剂
庆大霉素	轴突	A1492.0001	培养基补充剂
Fungizone	Invitrogen	15290-026	两性霉素B，培养基添加剂
DMEM 1 g/L 葡萄糖 + 丙酮酸钠 + GlutaMAX	Invitrogen	21885-025	用于成肌细胞培养
DMEM 1 g/L 葡萄糖 - Na丙酮酸盐 - 谷氨酰胺替代物	Invitrogen	11880-028	LumiCycle 记录培养基
Glutamax	Invitrogen	35050-028	L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽，培养基添加物
Accutase	创新细胞技术	AT-104	用于胰岛细胞解离的细胞解离液
CMRL	Gibco	21530-027	胰岛细胞培养基
丙酮酸钠	Gibco	11360-039	培养基补充剂
15 ml 高透明度聚丙烯锥形管	Falcon	352096
F75 培养瓶	BD Falcon	353136
3.5 cm 培养皿	BD Falcon	353001
Foskolin	Sigma	F6886	腺苷酸环化酶激活剂，用于同步化
荧光素	Prolume LTD	260150	记录培养基的补充剂
OptiMEM	Invitrogen	51985-026	用于人胰岛细胞转染的无血清最低限度必需培养基（MEM）
Lipofectamine RNAiMAX 试剂	Invitrogen	13778-150	转染试剂
HiPerFect 试剂	Qiagen	301705	转染试剂
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool	Dharmacon	L-008212-00
ON-TARGETplus 非靶向 siRNA #1（siControl）	Dharmacon	D-001810-01
DNeasy 血液 & 组织试剂盒	Qiagen	69504	用于肌管的DNA提取
RNeasy Plus Mini 试剂盒	Qiagen	74104	用于成肌细胞融合成管状结构的RNA提取
QIAshredder	Qiagen	79654	用于成肌管的RNA提取
2 ml 收集管	Axygen	311-10-051	收集灌流液
6孔组织培养板	BD Falcon	353046	收集灌流液
RNeasy Plus Micro 试剂盒	Qiagen	74034	用于胰岛RNA提取
人IL-6即用型ELISA试剂盒	eBioscience	88-7066-22
人胰岛素试剂盒 Mercodia	Mercodia	10-1113-01
盐酸，最小含量37%，p.a.	Acros Organics	124630010	用于裂解缓冲液的配制（375 ml 乙醇 + 7.5% HCl + 117.5% H2O
乙醇（>99.8%)	Fluka 分析	02860-1L	用于裂解缓冲液的制备（375 ml 乙醇 + 7.5% HCl + 117.5% H2O
用于研究的人类胰岛	Prodo Laboratories
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>设备：
离心	Heraeus	Megafuge 1.0R
水浴锅	VWR	1112A	37℃ °C
组织培养罩	更快	SafeFastElite
组织培养箱	Heraeus	HeraCell 150	5% CO2 37℃ °C，由于LumiCycle安装导致无水
组织培养箱	Heraeus	HeraCell 150	5% CO₂2 37℃ °C，由于安装了LumiCycle，无水
组织培养箱	赛默飞世尔科技	Hera Cell 150i	5% CO2 37℃ °C
摇床	Heidolph Instruments	Unimax 1010	用于siRNA混合物的振荡
LumiCycle	Actimetrics
LumiCycle 软件	Actimetrics
CosinorJ 软件	洛桑联邦理工学院		自由获取地址：http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX	ERC GmbH		控制自动化开关时序的控制软件