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方法文章

利用乙烯释放化合物2-氯乙基膦酸作为研究细菌乙烯反应的工具

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DOI：

10.3791/54682

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2016年11月10日

 ,  , 
1Molecular Microbial Biochemistry Laboratory, Faculty of Science (Applied Bioscience Program), University of Ontario Institute of Technology

本文内容

摘要

本文所述方案通过使用2-氯乙基膦酸（CEPA）便捷地研究细菌对乙烯的响应。乙烯的产生 原位 通过CEPA在水性细菌培养基中的分解，避免了对纯乙烯气体的需求。

摘要

乙烯（C2H4）是一种气态植物激素，参与调控植物发育的多个方面，在衰老和果实成熟过程中起主导作用。在植物早期发育阶段施加外源乙烯会引发“三重反应”表型，表现为下胚轴变短变粗，并伴有明显的顶端弯钩。尽管植物与细菌之间存在密切关系，但外源乙烯对细菌的影响却长期被忽视。部分原因在于实验室中若无专用设备，难以精确控制气态乙烯的浓度。2-氯乙基膦酸（CEPA）是一种可在pH值≥3.5的水溶液中分解为乙烯、氯离子和磷酸盐的化合物，其摩尔比为1:1:1:1。本文介绍了利用CEPA原位生成乙烯的方法，以果生纤维素产生菌Komagataeibacter xylinus为模式生物，研究细菌对乙烯的响应。本文所述实验方案包括：通过拟南芥（Arabidopsis thaliana）三重反应实验验证CEPA释放乙烯的效果，以及外源乙烯对K. xylinus纤维素产量、菌膜特性及菌落形态的影响。这些方案可结合适当的培养基和表型分析方法，推广应用于其他微生物的乙烯效应研究。使用CEPA为研究人员提供了一种简单高效的替代方案，可用于常规检测细菌对乙烯的响应，无需依赖纯乙烯气体。

引言

乙烯（C2H4）作为一种植物激素，最早于1901年被发现。当时观察到，在使用煤气灯照明的实验室中生长的豌豆幼苗表现出异常形态，其茎（下胚轴）比正常豌豆幼苗更短、更粗，并且横向弯曲；这种表型后来被称为“三重反应”1,2。后续研究表明，乙烯是一种重要的植物激素，可调控多种发育过程，如生长、应激反应、果实成熟和衰老3。Arabidopsis thaliana（拟南芥）是植物生物学研究中的模式生物，其对乙烯的响应已被广泛研究。研究人员利用在乙烯存在下暗培养的A. thaliana幼苗所表现出的三重反应表型，分离出了多个乙烯响应突变体1,4,5。植物中乙烯生物合成的前体物质是1-氨基环丙烷羧酸（ACC）6，在三重反应实验中常被用来提高植物内源乙烯的生成，从而诱导出三重反应表型1,4,5。

尽管植物中的乙烯响应已被广泛研究，但外源乙烯对细菌的影响却鲜有报道，尽管细菌与植物关系密切。一项研究报道，某些 假单胞菌 菌株可利用乙烯作为唯一的碳源和能源而存活7然而，仅有两项研究表明细菌会对乙烯产生响应。第一项研究显示，某些菌株 铜绿假单胞菌, P. fluorescens, P. putida，以及 P. syringae 使用琼脂糖凝胶塞实验检测趋化性，其中将熔化的琼脂糖与经纯乙烯气体平衡的趋化缓冲液混合8然而，据我们所知，目前尚无进一步使用纯乙烯气体来表征细菌乙烯响应的报道，这可能是因为在缺乏专用设备的情况下，实验室中处理气体存在困难。第二项关于细菌乙烯响应的研究表明，乙烯能够增加与果实相关的细菌的纤维素产量，并影响其基因表达。 Komagataeibacter （前身为 Gluconacetobacter) xylinus9在此情况下，使用乙烯释放化合物2-氯乙基膦酸（CEPA）来产生乙烯 原位 在细菌培养基中，无需使用纯乙烯气体或专用设备。

CEPA 在 pH 3.5 以上时以 1:1 的摩尔比产生乙烯10,11 通过碱催化的一级反应12-14CEPA的降解与pH值和温度呈正相关。13,14 并产生乙烯、氯化物和磷酸盐。对于研究细菌对乙烯反应的科研人员而言，CEPA 提供了一种便捷的替代气态乙烯的方法。

以下方案的总体目标是提供一种简单高效的方法来研究细菌对乙烯的响应，包括验证在细菌培养基中由CEPA分解产生的生理相关水平的乙烯产量，分析培养物的pH值以确保细菌生长过程中CEPA的分解不受影响，以及评估乙烯对细菌形态和表型的影响。我们以K. xylinus为例演示这些实验方案，但通过使用适当的培养基和表型分析方法，这些方案也可适用于研究其他细菌的乙烯响应。

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方案

1. 化学试剂

  1. 配制500 mM CEPA（144.49 g/mol）溶液，以及含有500 mM NaCl（58.44 g/mol）和500 mM NaH2PO4·H2O（137.99 g/mol）的混合溶液，溶剂为酸化（pH 2.5）超纯水或0.1 N HCl。使用涡旋振荡器混合，直至溶液澄清。
  2. 用相同溶剂对500 mM溶液进行连续10倍稀释，得到5 mM和50 mM的储备液。
  3. 在超纯水中配制10 mM的1-氨基环丙烷羧酸（ACC；101.1 g/mol）溶液。
  4. 将储备液过滤除菌，并分装后于-20 °C保存。
  5. 将纤维素酶过滤除菌，分装后于4 °C保存。

2. 验证2-氯乙基膦酸分解产生乙烯：三重反应检测法

  1. 表面灭菌 拟南芥 使用气相法处理生态型哥伦比亚种子：
    警告：以下步骤会产生有毒氯气。种子灭菌操作应在通风橱中进行。
    1. 取一个可密封的容器，深度足以容纳一个250 ml玻璃烧杯，用于种子灭菌，并将其置于通风橱中。
    2. 添加 A. thaliana 将种子放入微量离心管中，并将管子置于管架上。将装有开口管的管架放入可密封的容器中。
      注意：单个试管中的填充量不得超过一半，以便氯气能够渗透到底层种子。
    3. 将一个含有100 ml商用漂白液的250 ml烧杯放入可密封容器中。小心地向漂白液中加入3 ml浓盐酸，然后立即用盖子密封容器。
      警告：次氯酸钠与盐酸反应会产生有毒的氯气，用于种子表面灭菌。
    4. 在通风橱中将种子置于氯气环境下孵育4小时。
      注意：较长的灭菌时间会降低萌发效率。
    5. 灭菌后，将微离心管置于通风橱中排气至少1小时，然后密封。次氯酸钠与盐酸混合液须在通风橱中放置至少24小时后方可丢弃。
      注意：灭菌后的种子可在室温下保存，供立即使用。
    6. 保持种子在 4 °C 用于长期保存。打开微量离心管前，先将种子恢复至室温，以防止冷凝。将种子避光保存。
  2. 在4区段培养皿（90 × 15 mm）中制备琼脂平板：
    1. 准备 110 ml 培养基 A. thaliana 幼苗：1×Murashige和Skoog（MS）基本培养基15 (4.33 g/L)，含1% (w/v) 蔗糖和0.8% (w/v) 琼脂。用NaOH将MS培养基调至pH 6。
    2. 制备100 ml用于CEPA降解的细菌培养基：Schramm和Hestrin（SH）培养基16 含1.5%（w/v）琼脂。用NaOH将SH培养基调节至pH 7。
    3. 通过高压灭菌对培养基进行灭菌，并在水浴中平衡温度 55 °C 水浴锅
    4. MS琼脂冷却至适宜温度后，取40 ml加入无菌烧瓶中。为制备阳性对照培养基， A. thaliana 幼苗，向40 ml MS琼脂溶液中补充 40 µl 10 mM ACC 加入以获得最终浓度 10 µM ACC
    5. 向分区培养皿的相应区域加入 5 ml 培养基（图1）并让琼脂凝固。所有平板均需制备三个重复。
      注意：CEPA 直到实验方案的后期才添加到生长培养基中。

含CEPA处理下MS和SH培养基条件下植物生长的培养皿示意图与结果。
图1： 使用CEPA进行三重反应测定所用琼脂平板的设置示意图。 图示为分别用于阴性对照（A）、阳性对照（B）和实验组平板（C）的四个象限布局。本图经Augimeri和Strap9修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 对 A. thaliana 种子进行分层处理以确保同步萌发：
    1. 在每个含有 MS 或 MS+ACC 琼脂的象限上分别放置约五十粒 A. thaliana 种子。确保种子均匀分布，以便于后续幼苗的取出与分析。
    2. 将含有种子的培养皿在黑暗条件下于 4 °C 培养 3–4 天。
  2. 在细菌生长培养基（SH）上分解 CEPA 并进行三重反应测定：
    1. 分层处理后，将种子置于荧光灯下照射 2 小时。
    2. 向实验组培养皿中含 SH 琼脂（pH 7；图 1）的各个象限分别铺加 10 µl 的 500 mM CEPA 储存液，使最终 CEPA 浓度达到 1 mM。
    3. 用实验室封口膜密封培养皿，并用铝箔包裹以创造黑暗环境。
    4. 将培养皿倒置（琼脂面朝下），在黑暗条件下于 23 °C 培养 3 天以促进种子萌发。
      注意：培养皿可堆叠放置，但由于乙烯比空气轻，阴性对照组应置于最底部。
  3. 分析三重反应测定数据：
    1. 使用经火焰灭菌的镊子，从对应各处理组的培养皿中取出单株幼苗，在解剖镜或数字 USB 显微镜下观察。确保幼苗根部对齐后拍照记录。
    2. 从每个象限中取出 30 株幼苗（每生物学重复 60 株，每处理组共 180 株），在黑色背景表面上对齐排列，并与标尺一同拍照。
    3. 使用 ImageJ 软件17测量重复幼苗的下胚轴长度（mm）。通过点击并拖动“直线”工具选择 10 mm 长度，然后在“分析”选项卡下选择“设置标尺”，将已知距离设为 10。使用“分段”工具点击并拖动以选择下胚轴长度，按 M 键测量距离。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验对生物学重复的均值进行比较。当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。

3. 细菌生长过程中 pH 的分析

  1. 三重培养并定量 Komagataeibacter xylinus 起始菌液：
    1. 将单个 K. xylinus 菌落接种至 5 ml 添加了 0.2% (v/v) 过滤除菌纤维素酶的 SH 培养基（pH 5）中。在 30 °C、150 rpm 振荡条件下培养，直至 OD600 达到 0.3 至 0.4（约 72 小时）。
    2. 通过离心（2,000 x g；4 °C；10 分钟）收集起始菌液。用 5 ml 无菌的 0.85% (w/v) NaCl 溶液洗涤细胞两次，并重悬菌体沉淀。将细胞置于冰上保存。
    3. 使用 Petroff-Hausser 计数室对细胞进行定量。
  2. 接种用于 pH 分析的培养物：
    1. 在十二个带铝箔封口的 500 ml 三角瓶中，各加入 150 ml 添加了 0.2% (v/v) 过滤除菌纤维素酶的 SH 液体培养基（pH 7）。以 105 个细胞/ml 的浓度将 K. xylinus 起始菌液接种至各瓶中。利用三个起始菌液，每种处理设置三个生物学重复。
    2. 向培养物中分别添加 300 µl 的 5、50 或 500 mM CEPA 储存液，使最终 CEPA 浓度分别为 0.01、0.1 和 1.0 mM。向未处理的对照组培养物中加入 300 µl 溶解 CEPA 所用的溶剂。
    3. 用胶带将铝箔封口紧密封住三角瓶，并在 30 °C、150 rpm 振荡条件下培养 14 天。
  3. 每天从每个三角瓶中无菌取出 5 ml 样品，通过离心（2,000 x g；4 °C；10 分钟）收集菌体沉淀。将上清液转移至洁净离心管中，并使用 pH 计测定每个生物学重复的 pH 值。
  4. 通过绘制生物学重复的平均 pH 值随时间变化曲线来分析时间序列数据。
    注意：培养液 pH 不应低于 3.5；当培养液 pH 为 5 时，CEPA 释放乙烯的效率显著降低，而 pH 低于 3.5 时则完全抑制乙烯的释放。
  5. 为控制氯离子和磷酸盐浓度的影响，使用 5、50 和 500 mM 的 NaCl-NaH2PO4 储存液分别配制 0.01、0.1 和 1.0 mM 的溶液，进行相同的实验。

4. 菌落形态

  1. 以三组平行样培养K. xylinus起始菌液：
    1. 将单个K. xylinus菌落接种至5 ml SH培养基（pH 5）中，培养基中添加0.2%（v/v）经滤膜除菌的纤维素酶。在30 °C、150 rpm振荡条件下培养，直至OD600达到0.3至0.4（约72小时）。
    2. 通过离心（2,000 × g；4 °C；10分钟）收集起始菌液，用5 ml无菌生理盐水洗涤菌体，并重悬菌体沉淀。将菌悬液置于冰上保存。
  2. 制备24个琼脂平板，每板含25 ml SH（pH 7）培养基，其中添加1.5%（w/v）琼脂。
  3. 待琼脂凝固后，分别在平板上均匀涂布50 µl的5、50和500 mM CEPA储备液，使CEPA终浓度分别为0.01、0.1和1.0 mM。设置未处理对照组和溶剂对照组，前者不添加任何物质，后者涂布50 µl用于溶解待测化合物的溶剂。
  4. 用接种环蘸取一环（约5 μl）K. xylinus起始菌液，在平板上划线分离单菌落，并用封口膜密封平板。所有处理均设置三组重复。于30 °C培养5天。
  5. 使用数字USB显微镜在20倍放大下拍摄菌落图像，并对固体培养基上菌落的形态特征及纤维素产生情况进行定性评估。
    注意：纤维素在菌落边缘呈现为模糊状物质。
  6. 为控制氯离子和磷酸盐浓度的影响，使用NaCl-NaH2PO4溶液进行相同实验，分别以5、50和500 mM储备液配制终浓度为0.01、0.1和1.0 mM的处理组。

5. 菌膜分析

  1. 以三组平行样培养并定量 K. xylinus 起始菌液：
    1. 取单菌落 K. xylinus，分别接种至 5 ml 添加了 0.2% (v/v) 过滤除菌纤维素酶的 SH 培养基（pH 5）中，共设三组平行样。于 30 °C、150 rpm 振荡培养约 72 小时，直至 OD600 达到 0.3 至 0.4。
    2. 将起始菌液以 2,000 × g、4 °C 离心 10 分钟收集菌体。用 5 ml 无菌生理盐水洗涤菌体两次，并重悬菌体沉淀。将菌悬液置于冰上保存。
    3. 使用 Petroff-Hausser 计数板对菌体进行定量。
  2. 制备接种用母液并分装至 24 孔板：
    1. 向 60 ml SH 培养基（pH 7）中分别加入 120 µl 的 5、50 和 500 mM CEPA 储液，使最终 CEPA 浓度分别为 0.01、0.1 和 1.0 mM。另取 60 ml SH 培养基（pH 7）加入 120 µl 溶解 CEPA 所用的溶剂作为对照。涡旋混匀。
    2. 将每种含 CEPA 的 60 ml 培养基均分为四份，每份 14 ml。其中三份分别接种起始菌液的三个生物学重复，使菌体终浓度为 105 个细胞/ml。将含菌的试管置于冰上，以抑制纤维素的生成。
      注：剩余的一份 14 ml 培养基用于设置无菌对照孔。
  3. 接种 24 孔板：
    1. 每种处理单独使用一块 24 孔板，每板包含三行生物学重复孔和一行无菌对照孔（图 2）。

微生物培养实验示意图；方法：接种细胞、培养、分析菌膜。
图 2：菌膜检测与分析所用方案的流程图。 将补充了CEPA的pH 7 SH培养基原液（60 ml）分装为三份独立的生物学重复接种样本和一份无菌对照样本（每份14 ml）。随后将这些培养物分装至24孔板中，每份设六个技术重复（每孔2 ml），并用石蜡膜密封。在30 °C下培养7天后，收集菌膜并通过测定湿重、厚度、干重以及傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析结晶度对其进行表征。请点击此处查看该图的放大版本

  1. 使用14 ml主混合液，向无菌24孔板的每六个孔中各加入2 ml。对三个生物学重复和无菌对照组进行相同操作（图2）。每种处理均需重复此步骤。
  2. 用石蜡膜密封培养板，在30 °C下静置培养7天。
  1. 收集并测定菌膜湿重、厚度、干重（纤维素产量）及结晶度（图2）：
    1. 按压菌膜一侧，使对侧边缘翘起，用镊子取出单个菌膜。在夹持状态下，将其置于洁净的纸巾上3秒，以去除多余培养基，随后称重以测定湿重。
    2. 将菌膜紧靠直尺摆放，并使用高分辨率数码相机从侧面拍摄照片。
    3. 利用ImageJ软件17，测量每个菌膜左侧肩部、右侧肩部及中心位置的厚度。对每个生物学重复的技术重复测量值取平均。
    4. 将菌膜分别转移至6孔板的孔中，每孔加入12 ml 0.1 N NaOH，于80 °C处理20分钟以裂解细胞。
    5. 移除NaOH溶液，用超纯水振荡洗涤菌膜24小时以中和残留碱液，每6小时更换一次水。
      注意：洗涤完成后，菌膜应呈白色。
    6. 将菌膜置于硅胶垫上，在50 °C下干燥48小时至恒重。干燥后从垫上取下，用分析天平称重，以确定细菌纤维素产量。
    7. 采用傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）分析菌膜结晶度，扫描32次，分辨率设为4 cm-1，波数范围为4,000至650 cm-1。根据先前描述的方法18，通过A1437/A895计算结晶度指数CI(IR)，即“结晶带”与“非晶带”吸光度比值。
  2. 为控制氯离子和磷酸盐浓度，分别使用5 mM、50 mM和500 mM的NaCl-NaH2PO4储备液配制0.01、0.1和1.0 mM的工作液，进行相同的实验。
  3. 分析菌膜数据：
    1. 通过计算菌膜湿重与干重之差，确定其含水量。
    2. 对所有技术重复的数值取平均，为每个生物学重复获得单一数值用于统计分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验进行组间比较。当p <0.05时，认为差异具有统计学意义。
    3. 将数据标准化为未处理对照组的百分比，并绘制生物学重复的均值图。

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结果

在SH培养基（pH 7）中通过三重反应测定法验证CEPA释放乙烯的示意图板设置如图所示 图1A-C显示浮膜培养实验流程的流程图如图所示。 图2. 暗处培养的 A. thaliana 幼苗在含有ACC或通过CEPA在SH培养基（pH 7）中分解产生乙烯的条件下表现出三重反应表型（下胚轴更短更粗，顶端弯钩加剧），但在未处理条件下不表现该表型 (图3A)9ACC 和 CEPA 处理产生的乙烯对下胚轴长度的影响 A. thaliana 种子显著地（p < 0.0001）短于未经处理的对照组（图3B)9，证实乙烯在SH培养基（pH 7）上以生理相关浓度从CEPA释放。未处理组与CEPA处理组的pH值 K. xylinus 培养物的值保持在5以上...

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讨论

本文所述方法概述了 原位 利用模式生物研究细菌乙烯响应时由CEPA产生乙烯的方法 K. xylinus该方法非常有用，因为只要水相介质的pH值大于3.5，即可通过添加物质产生乙烯。10,11 CEPA 的使用避免了对纯乙烯气体或专用实验室设备的需求。该方法不仅限于研究 CEPA 衍生乙烯对细菌的影响，还可经适当调整用于研究真核生物对乙烯的响应。必须同时开展磷酸盐和氯化物的平行对照实验，因为这些化合物也会在 CEPA 分解过程中产生。 原位另一个必要的对照是确定CEPA本身是否对所研究的微生物培养物产生直接作用。当产生生理学上无关的乙烯浓度时 K. xylinus 培养物在pH 5的SH培养基中培养，因此可作为CEPA效应的对照9然而，该方法仅适用于耐酸生物。

在水性生长培养基中使用CEPA衍生的乙烯进行生物学研究时，需要验证系统内确实产生了乙烯。本文所述方法利用拟南芥（A. thaliana）三重反应检测法，该方法基于暗培养幼苗在乙烯存在下表现出的三...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Dario Bonetta 博士提供了拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子，并在三重反应实验方面提供了技术支持，同时感谢 Simone Quaranta 在傅里叶变换红外光谱（FT-IR）方面的帮助。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（NSERC-DG）对 JLS 的资助，安大略省研究生奖学金（OGS）对 RVA 的资助，以及伊丽莎白二世科学与技术研究生奖学金（QEII-GSST）对 AJV 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-氨基环丙烷羧酸（ACC）SigmaA3903植物中乙烯的生物合成前体
四分区培养皿Phoenix BiomedicalCA73370-022用于三重反应测试
琼脂BioShopAGR001.1用于固化培养基
佳能 Rebel T1i 数码单反相机Canon3818B004用于拍摄菌膜图像
来自里氏木霉 ATCC 26921 的纤维素酶 SigmaC2730水溶液
柠檬酸BioShopCIT002.500用于 SH 培养基
市售漂白剂Life Brand57800861874用于种子灭菌
浓盐酸BioShopHCL666.500用于调节 pH
数字 USB 显微镜PlugableN/A用于拍摄菌落图像
乙烯利（≥96%；2-氯乙基膦酸）SigmaC0143释放乙烯的化合物
葡萄糖BioBasicGB0219用于 SH 培养基
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582ATCC53582产细菌纤维素的α-变形菌
微量离心管LifeGeneLMCT1.7B1.7 ml 微量离心管
Murashige 和 Skoog（MS）基础培养基 SigmaM5519拟南芥生长培养基
Na2HPO4·7H2O BioShopSPD579.500七水合磷酸氢二钠，用于 SH 培养基
NaClBioBasicSOD001.1氯化钠，用于生理盐水和对照溶液
NaH2PO4·H2O BioShopSPM306.500一水合磷酸二氢钠，用于对照溶液
NaOHBioShopSHY700.500氢氧化钠，用于调节 pH
石蜡膜ParafilmPM996用于密封培养皿和烧瓶
蛋白胨（细菌学用）BioShopPEP403.1用于 SH 培养基
Petroff-Hausser 计数室Hausser Scientific3900细菌细胞计数室
聚醚砜灭菌滤膜，0.2 µmVWR28145-501用于纤维素酶的灭菌过滤
蔗糖BioShopSUC600.1用于 MS 培养基的蔗糖
酵母提取物BioBasicG0961用于 SH 培养基

参考文献

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