本文所述方案通过使用2-氯乙基膦酸（CEPA）便捷地研究细菌对乙烯的响应。乙烯的产生 原位 通过CEPA在水性细菌培养基中的分解，避免了对纯乙烯气体的需求。
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本文内容
摘要
摘要
乙烯（C2H4）是一种气态植物激素，参与调控植物发育的多个方面，在衰老和果实成熟过程中起主导作用。在植物早期发育阶段施加外源乙烯会引发“三重反应”表型，表现为下胚轴变短变粗，并伴有明显的顶端弯钩。尽管植物与细菌之间存在密切关系，但外源乙烯对细菌的影响却长期被忽视。部分原因在于实验室中若无专用设备，难以精确控制气态乙烯的浓度。2-氯乙基膦酸（CEPA）是一种可在pH值≥3.5的水溶液中分解为乙烯、氯离子和磷酸盐的化合物，其摩尔比为1:1:1:1。本文介绍了利用CEPA原位生成乙烯的方法，以果生纤维素产生菌Komagataeibacter xylinus为模式生物，研究细菌对乙烯的响应。本文所述实验方案包括：通过拟南芥（Arabidopsis thaliana）三重反应实验验证CEPA释放乙烯的效果，以及外源乙烯对K. xylinus纤维素产量、菌膜特性及菌落形态的影响。这些方案可结合适当的培养基和表型分析方法，推广应用于其他微生物的乙烯效应研究。使用CEPA为研究人员提供了一种简单高效的替代方案，可用于常规检测细菌对乙烯的响应，无需依赖纯乙烯气体。
引言
乙烯（C2H4）作为一种植物激素，最早于1901年被发现。当时观察到，在使用煤气灯照明的实验室中生长的豌豆幼苗表现出异常形态，其茎（下胚轴）比正常豌豆幼苗更短、更粗，并且横向弯曲；这种表型后来被称为“三重反应”1,2。后续研究表明，乙烯是一种重要的植物激素，可调控多种发育过程，如生长、应激反应、果实成熟和衰老3。Arabidopsis thaliana（拟南芥）是植物生物学研究中的模式生物，其对乙烯的响应已被广泛研究。研究人员利用在乙烯存在下暗培养的A. thaliana幼苗所表现出的三重反应表型，分离出了多个乙烯响应突变体1,4,5。植物中乙烯生物合成的前体物质是1-氨基环丙烷羧酸（ACC）6，在三重反应实验中常被用来提高植物内源乙烯的生成，从而诱导出三重反应表型1,4,5。
尽管植物中的乙烯响应已被广泛研究，但外源乙烯对细菌的影响却鲜有报道，尽管细菌与植物关系密切。一项研究报道，某些 假单胞菌 菌株可利用乙烯作为唯一的碳源和能源而存活7然而，仅有两项研究表明细菌会对乙烯产生响应。第一项研究显示，某些菌株 铜绿假单胞菌, P. fluorescens, P. putida，以及 P. s....
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方案
1. 化学试剂
- 配制500 mM CEPA（144.49 g/mol）溶液，以及含有500 mM NaCl（58.44 g/mol）和500 mM NaH2PO4·H2O（137.99 g/mol）的混合溶液，溶剂为酸化（pH 2.5）超纯水或0.1 N HCl。使用涡旋振荡器混合，直至溶液澄清。
- 用相同溶剂对500 mM溶液进行连续10倍稀释，得到5 mM和50 mM的储备液。
- 在超纯水中配制10 mM的1-氨基环丙烷羧酸（ACC；101.1 g/mol）溶液。
- 将储备液过滤除菌，并分装后于-20 °C保存。
- 将纤维素酶过滤除菌，分装后于4 °C保存。
2. 验证2-氯乙基膦酸分解产生乙烯：三重反应检测法
- 表面灭菌 拟南芥 使用气相法处理生态型哥伦比亚种子：
警告：以下步骤会产生有毒氯气。种子灭菌操作应在通风橱中进行。- 取一个可密封的容器，深度足以容纳一个250 ml玻璃烧杯，用于种子灭菌，并将其置于通风橱中。
- 添加 A. thaliana 将种子放入微量离心管中，并将管子置于管架上。将装有开口管的管架放入可密封的容器中。
注意：单个试管中的填充量不得超过一半，以便氯....
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结果
在SH培养基（pH 7）中通过三重反应测定法验证CEPA释放乙烯的示意图板设置如图所示 图1A-C显示浮膜培养实验流程的流程图如图所示。 图2. 暗处培养的 A. thaliana 幼苗在含有ACC或通过CEPA在SH培养基（pH 7）中分解产生乙烯的条件下表现出三重反应表型（下胚轴更短更粗，顶端弯钩加剧），但在未处理条件下不表现该表型 (图3A)9ACC 和 CEPA 处理产生的乙烯对下胚轴长度的影响 A. thaliana 种子显著地（p < 0.0001）短于未经处理的对照组（图3B)9，证实乙烯在SH培养基（pH 7）上以生理相关浓度从CEPA释放。未处理组与CEPA处理组的pH值 K. xylinus 培养物的值保持在5以上.......
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讨论
本文所述方法概述了 原位 利用模式生物研究细菌乙烯响应时由CEPA产生乙烯的方法 K. xylinus该方法非常有用，因为只要水相介质的pH值大于3.5，即可通过添加物质产生乙烯。10,11 CEPA 的使用避免了对纯乙烯气体或专用实验室设备的需求。该方法不仅限于研究 CEPA 衍生乙烯对细菌的影响，还可经适当调整用于研究真核生物对乙烯的响应。必须同时开展磷酸盐和氯化物的平行对照实验，因为这些化合物也会在 CEPA 分解过程中产生。 原位另一个必要的对照是确定CEPA本身是否对所研究的微生物培养物产生直接作用。当产生生理学上无关的乙烯浓度时 K. xylinus 培养物在pH 5的SH培养基中培养，因此可作为CEPA效应的对照9然而，该方法仅适用于耐酸生物。
在水性生长培养基中使用CEPA衍生的乙烯进行生物学研究时，需要验证系统内确实产生了乙烯。本文所述方法利用拟南芥（A. thaliana）三重反应检测法，该方法基于暗培养幼苗在乙烯存在下表现出的三.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Dario Bonetta 博士提供了拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子，并在三重反应实验方面提供了技术支持，同时感谢 Simone Quaranta 在傅里叶变换红外光谱（FT-IR）方面的帮助。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（NSERC-DG）对 JLS 的资助，安大略省研究生奖学金（OGS）对 RVA 的资助，以及伊丽莎白二世科学与技术研究生奖学金（QEII-GSST）对 AJV 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-氨基环丙烷羧酸（ACC） | Sigma | A3903 | 植物中乙烯的生物合成前体 |
| 四分区培养皿 | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | 用于三重反应测试 |
| 琼脂 | BioShop | AGR001.1 | 用于固化培养基 |
| 佳能 Rebel T1i 数码单反相机 | Canon | 3818B004 | 用于拍摄菌膜图像 |
| 来自里氏木霉 ATCC 26921 的纤维素酶 | Sigma | C2730 | 水溶液 |
| 柠檬酸 | BioShop | CIT002.500 | 用于 SH 培养基 |
| 市售漂白剂 | Life Brand | 57800861874 | 用于种子灭菌 |
| 浓盐酸 | BioShop | HCL666.500 | 用于调节 pH |
| 数字 USB 显微镜 | Plugable | N/A | 用于拍摄菌落图像 |
| 乙烯利（≥96%；2-氯乙基膦酸） | Sigma | C0143 | 释放乙烯的化合物 |
| 葡萄糖 | BioBasic | GB0219 | 用于 SH 培养基 |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | 产细菌纤维素的α-变形菌 |
| 微量离心管 | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 ml 微量离心管 |
| Murashige 和 Skoog（MS）基础培养基 | Sigma | M5519 | 拟南芥生长培养基 |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | 七水合磷酸氢二钠，用于 SH 培养基 |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | 氯化钠，用于生理盐水和对照溶液 |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | 一水合磷酸二氢钠，用于对照溶液 |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | 氢氧化钠，用于调节 pH |
| 石蜡膜 | Parafilm | PM996 | 用于密封培养皿和烧瓶 |
| 蛋白胨（细菌学用） | BioShop | PEP403.1 | 用于 SH 培养基 |
| Petroff-Hausser 计数室 | Hausser Scientific | 3900 | 细菌细胞计数室 |
| 聚醚砜灭菌滤膜，0.2 µm | VWR | 28145-501 | 用于纤维素酶的灭菌过滤 |
| 蔗糖 | BioShop | SUC600.1 | 用于 MS 培养基的蔗糖 |
| 酵母提取物 | BioBasic | G0961 | 用于 SH 培养基 |
参考文献
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul....
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重印与许可
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