可视化Stromule频率与荧光显微镜

Summary

描述了研究叶绿体基质动力学的方案，叶绿体基质是从叶绿体表面延伸

出来的充满基质的小管。

Abstract

Stromules，或"充满基质的小管"，是从叶绿体表面延伸而来的狭窄的管状延伸物，在植物细胞中普遍观察到，但其功能仍然很神秘。随着人们对叶绿体在协调植物对压力的反应中的作用的日益关注，近年来对基质及其与叶绿体信号动力学的关系的兴趣有所增加，这得益于荧光显微镜和蛋白质荧光团的进步，可以快速、准确地可视化基质动力学。在这里，我们提供了详细的方案来测定 Nicotiana benthamiana 表皮叶绿体中的基质频率，这是研究叶绿体基质生物学的优秀模型系统。我们还提供了通过从叶中提取叶绿体在体外可视化叶绿体基质的方法。最后，我们概述了采样策略和统计方法，以分析响应刺激（如环境压力、化学处理或基因沉默）的 stromule 频率的差异。研究人员可以使用这些方案作为起点，为创新实验开发新方法，以探索叶绿体如何以及为什么制造基质。

Introduction

叶绿体是植物细胞中负责光合作用和许多其他代谢过程的动态细胞器。来自叶绿体的信号通路也对植物的生理学和发育产生重大影响，协调植物对环境胁迫、病原体甚至叶形^1-6 的反应。最近，生物学家对叶绿体结构的一个鲜为人知的方面产生了兴趣：基质，即从叶绿体表面延伸出来的非常薄的充满基质的小管⁷。

尽管已知基质频率会随着环境刺激而变化^7-9，并且基质可能能够在细胞器之间传递信号分子⁶，但基质的生物学功能仍然未知。 所有类型的质体（不仅是绿色的光合叶绿体，还有透明的白质体、淀粉填充的淀粉质体和着色的显色质体，仅举几种类型的质体）都构成基质，而基质存在于迄今为止检查过的所有陆地植物物种中。Stromules 可以动态地伸展和缩回，在几秒钟内出现或消失，或者它们可以长时间保持相对静止。基质生物学家面临的主要障碍之一是，基质通常使用截然不同的方法、组织和物种进行研究，这使得跨基质生物学文献的比较变得困难。展望未来，用于研究基质的标准实践和实验系统的全面描述对于发现叶绿体形态的这些普遍特征的功能至关重要。

在这里，我们描述了可视化本氏烟草叶子表皮叶绿体中基质形成的方法。在叶肉中，叶绿体密集地堆积成大型三维细胞，这使得共聚焦显微镜难以准确和快速地观察基质。 相比之下，表皮细胞相对平坦，含有较少的叶绿体，并且位于叶子表面，可以轻松快速地观察基质。N. benthamiana 是这些实验的理想模型系统，因为与许多植物物种不同，N. benthamiana 表皮中的所有细胞都会产生叶绿体¹⁰。 在大多数植物的表皮中，包括拟南芥，只有气孔保卫细胞有叶绿体，而其他表皮细胞有"白质体"，即透明、相对无定形且非光合作用的质体^9,11,12。 因此，虽然拟南芥表皮的单个视野可能只显示一对保卫细胞中的少量叶绿体，但本氏烟草表皮的视野将包括数十甚至数百个叶绿体。然而，这里描述的所有方法都可以修改以研究基质生物学中的其他问题;例如，我们使用相同的方法来研究 A. thaliana⁹ 的白质体基质。

Protocol

注意：对于该协议，我们专注于测定本氏烟草叶子表皮中的基质频率。已经产生了几种可用于此目的的稳定转基因品系，包括 35S_PRO：FNRtp：EGFP¹³ 和 NRIP1：Cerulean⁶。这两个品系都显示了在各种条件下生长的叶片叶绿体基质中荧光团的强烈表达。或者，叶绿体靶向荧光团可以使用农杆菌转化在本氏烟草中瞬时表达¹³。这不如转基因品系理想，因为农杆菌的渗透在本氏烟草中诱导了一些基础防御反应，并且与农杆菌的相互作用可以改变叶片¹⁴ 中的基质频率，从而可能使结果的解释复杂化。最后，为了在体外可视化基质形成，可以使用基因编码的荧光团或荧光染料从任何植物物种中提取叶绿体，如下文第 5 节所述。^9,15

注意：植物栽培的详细方法已经描述过了。¹⁶ 简而言之，在 4 英寸的花盆中种植本氏烟草植物，里面装满了任何可提供良好排水的专业土壤混合物。在最初的 10-14 天用透明的塑料圆顶覆盖幼苗，为发芽提供潮湿的环境。按照制造商的说明将任何标准肥料混合物添加到 14 天龄的植物中。在白光下生长植物，使用 ~100 μmol 光子 m ^{-2 sec-1} 光强度。定期给植物浇水。

1. 准备用于可视化的叶子样本

注意：基质动力学受损伤⁸ 的影响，因此应在通过共聚焦荧光显微镜观察基质之前立即进行组织制备。理想情况下，样品应在从植物中取出后 15 分钟进行可视化。

1. 使用非常锋利的剃须刀片切下一小段叶子。始终使用叶子的相同区域以保持一致性，并确保在所有实验中可视化相同的表面（近轴或背轴）。
2. 切割叶切片后，立即将叶切片浸入装满水的 5 ml 无针注射器中，除去注射器中的空气，然后用手指盖住注射器孔口并拉动柱塞进行真空。
   1. 轻轻松开柱塞，以免损坏叶片截面。重复此作两到三次，或直到大部分空气被去除，叶子呈深绿色。
      注意：此步骤会去除叶子中可能干扰基质准确可视化的空气。
3. 在载玻片上加入一滴水，然后将叶子部分放在这滴水上。然后，在叶子的顶部再滴一滴水，并在叶子上放一个盖玻片。如果有任何气泡，请轻轻敲击盖玻片，直到它们被去除。载玻片现在已准备好进行显微镜检查，应立即观察。

2. 使用共聚焦荧光显微镜可视化频闪

1. 使用透射光，聚焦在叶子切片中心附近的视野上（远离被剃须刀片损坏的细胞）。使用 20X 物镜，以便可以同时可视化许多叶绿体。保存包含透射光的图像，以便以后根据需要区分细胞类型。
2. 将照明源切换到具有适合所用荧光团的激发和发射滤光片的激光器。例如，用 488 nm 激光激发 GFP 并收集 500 nm 和 525 nm 之间的发射。
   1. 使用显微镜的软件，选择 GFP 通道并单击以将针孔孔径调整到 1 个艾里单位。选择激光扫描，开始可视化样品，然后单击 GFP 通道以调整激光强度和检测器增益，以最小化激光功率，同时仍能清晰地可视化频闪。确定这些设置后，请在所有实验中尽可能保持一致。
3. 准备一个 z 堆栈实验，该实验将通过视野中的叶子表皮收集一系列图像。
   1. 对于 z 堆栈，将所有表皮叶绿体包括在视野中以避免偏差（例如，如果叶表面附近的叶绿体在测试条件下具有更多的基质）。
   2. 以尽可能大的间隔拍摄图像，该间隔将包括所有 stromules，但要最小化 z 堆栈所需的时间。例如，如果 1 个 Airy 单位相当于 2 μm 深的聚焦共聚焦切片，则每 2 μm 拍摄一次图像可能是理想的><。 注意：叶表皮是一个不平整的表面，因此 z 堆栈的总深度会因样品而异;大多数 Z 堆栈需要 10-20 个图像，但可能包含更多图像。
   3. 根据需要调整扫描速度和图像分辨率，以确保快速收集 z 堆栈（如果可能，通常在 5-10 分钟内）。保存 z 堆栈以供以后分析。

3. 图像处理

1. 使用任何图像分析软件确定 stromule 频率。对于此协议，我们建议使用美国国立卫生研究院 （http://imagej.nih.gov/ij/） 公开提供的 ImageJ，或斐济 ImageJ （http://fiji.sc/Fiji） 的流行升级版。
2. 使用软件中的最大强度投影将 z 堆栈合并为单个图像。
3. 识别并手动计数图像中的所有叶绿体。
4. 对于每个叶绿体，目视确定在合并的 z 堆栈图像中是否看到一个或多个从叶绿体延伸的频闪。有关示例，请参见图 1.
   注意：由于基质的生物学功能尚不清楚，因此任何来自叶绿体的薄的、充满基质的管状延伸都可以被认为是"基质"，无论长度如何。作为一般规则，如果叶绿体中充满基质的延伸部分在其大部分长度上的直径小于约 1 μm，则它是基质⁷。确保一个人分析所有图像，以控制确定叶绿体是否具有基质的主观差异。第二名研究人员应独立验证 stromule 频率，以进一步减少主观偏差。

4. 实验设计和抽样

注意：叶子之间的基质频率变化很大，但一些报告表明，单个叶片内的基质频率变化很小^9,17。

1. 从一片叶子的单个视野计算叶子 stromule 频率。丢弃叶子，并将其视为独立样本。不要将来自一个叶片的单独视野视为独立的样品。
   注意：关于如何最好地测量 stromule 活动的变化没有强烈的共识，在更明确地定义 stromules 的功能之前，研究人员应该继续创造性地量化 stromule 动力学。然而，为了比较文献，除了更具创造性的方法外，还应使用通用的报告标准。至少，始终报告具有一个或多个基质的叶绿体的频率。
2. 确定在视场中具有基质的叶绿体的频率。使用 ImageJ 识别视野中的所有叶绿体。然后，对于每个叶绿体，确定叶绿体是否至少形成了一个基质。将 stromule 频率报告为具有 stromule 的叶绿体的百分比。
   注意：一些研究人员在报告选磁频率之前转换百分比，例如使用反正弦变换;虽然这是统计分析的一个选项，但 stromule 频率的反正弦并不是一个直观的值，不需要在研究的正文或图表中报告。
   1. 作为替代方法，计算基质的总数，并将其除以叶绿体的总数。
      注意：在大多数情况下，这将产生与方法 4.2 类似的结果;然而，如果单个叶绿体形成了许多基质，则它可能会高估基质频率。例如，在代表性结果下显示的示例中，几个叶绿体具有两个或多个基质，将每个叶绿体的基质数量增加到 40/87（而基质频率为 33/87）。
   2. 或者，确定 stromule length 而不是 stromule frequency。可以通过使用手绘线条工具跟踪叠层在 ImageJ 中测量长度。
      注意：由于基质的生物学作用仍然未知，因此尚不清楚基质长度会影响它们的功能。如果观察到 stromule 长度的显著差异，则报告 stromule 长度的显著差异，但也要报告 stromule 频率（如 4.2 中所述><）。 注意：在相同的生长条件下，不同叶子之间的 Stromule 频率可以高度变化。因此，尽管确定 stromule 频率可能很耗时，但应仔细设计实验以包括大样本量。使用我们实验室的数据集，我们确定每个处理至少 16 株植物的样本量通常足以确定两种条件之间是否存在至少 1.5 倍的基质频率变化的统计学显着差异（标准α = 0.05 和 β = 0.80）。
3. 结果的统计分析。
   1. 要比较两种处理的平均 stromule 频率，请使用 Welch 的 t 检验（也称为异方差 t 检验或假设不等方差的 t 检验）。
      注：该检验不如传统的 Student t 检验有效，但 Welch 的 t 检验是有利的，因为它不假设处理之间基质频率分布的方差相似><。 注意：由于选磁频率是一个"比例"，因此其采样分布被预测为二项式而不是正态分布，如果样本量非常低或选磁频率非常低（接近 0%）或非常高（接近 100%），理论上可能会扭曲统计分析。一些报表在统计分析之前使用了反正弦变换，旨在将二项分布转换为正态分布，从而满足学生 t 检验或方差分析的标准要求。但是，在实践中，反正弦变换对统计分析的影响很小或没有影响，因此不建议使用。相反，重复实验以增加样本量，这将增加统计功效并减少数据解释中的错误。
   2. 无论使用哪种统计方法，请务必仔细报告每个实验的抽样策略、样本量、统计检验和 p 值。
      注意：与其他生物学领域一样，小于 0.05 的 p 值可能被视为"具有统计学意义"，尽管研究人员当然应该报告获得的精确 p 值。如果 p 略高于 0.05，则通过两个或三个实验增加样本量可能有助于阐明观察到的差异是否可重现且具有统计学意义。

5. 提取完整的叶绿体以可视化基质动力学

注意：已经使用了几种方法从叶子中分离叶绿体，包括最近一项关于体外基质形成的研究中略有不同的方案 ¹⁵。下面详述的方案使用一种相对简单的方法，该方法不产生生化纯叶绿体样品，而是分离出大量完整、健康的叶绿体^9,18。

1. 制备冷提取缓冲液：50 mM Hepes NaOH、330 mM 山梨糖醇、2 mM EDTA、1.0 mM MgCl₂ 和 1.0 mM MnCl₂。用 NaOH 和 HCl 将 pH 值调节至 6.9，并在使用前冷藏><。 注意：虽然不是必需的，但使用冷缓冲液并尽可能将样品保存在冰上将产生更高比例的完整叶绿体。
2. 准备分离缓冲液：50 mM Hepes NaOH、330 mM 山梨糖醇、2 mM EDTA、1.0 mM MnCl₂、1.0 mM MgCl₂、10 mM KCl 和 1.0 mM NaCl。用 NaOH 和 HCl 将 pH 值调节至 7.6，并在使用前冷藏。
3. 如果叶子不表达遗传编码的基质荧光团，则制备羧基荧光素二乙酸酯 （CFDA） 溶液：50 mM CFDA 储备液在二甲基亚砜 （DMSO） 中（每 1.0 ml DMSO 2.3 mg CFDA><）。 注意：确切的浓度并不重要。始终将 CFDA 库存置于黑暗中。将 50 mM CFDA 的小等分试样储存在 -20 °C 下。
4. 要分离叶绿体，请从几株植物中取出 ~5-10 克叶子，然后用冷水短暂冲洗。立即转移至 50 ml 冷提取缓冲液中。使用搅拌机以几个短脉冲研磨叶子。过滤两层或三层粗棉布以去除叶碎屑，将提取的叶绿体分成两个 50 ml 离心管，并以 750 x g 离心 1 分钟。
5. 弃去上清液，将绿色叶绿体重悬于 10 ml 分离缓冲液中。再次以 750 x g 离心 1 分钟，弃去上清液，并在分离缓冲液中重悬叶绿体，使最终体积达到 5 ml。
6. 将 20 μl 叶绿体转移到载玻片上，用盖玻片盖住，然后开始显微镜检查><。 注：来自表达质体靶向荧光蛋白的转基因植物的叶绿体现在可以通过共聚焦荧光显微镜进行可视化。
对
7. 不表达质体靶向荧光蛋白的植物的叶绿体进行染色，以可视化基质。
   1. 将 5 μl 50 mM CFDA 原液加入 5 ml 叶绿体中 - 悬浮在分离缓冲液中。使终浓度达到 50 μM。
   2. 让叶绿体孵育 5 分钟，然后将小等分试样 （~50 μl） 转移到载玻片上，用盖玻片盖住，然后开始显微镜检查。
   3. 使用 FITC 或 GFP 过滤器组。使用 20 倍物镜同时观察多个叶绿体，或使用更高的物镜观察单个分离的叶绿体><。 注意：CFDA 会在完整叶绿体的基质内发出荧光。
   4. 如果有强烈的背景荧光，则在与 CFDA 孵育 5 分钟后，在 10 ml 分离缓冲液中再次洗涤叶绿体，以 750 x g 离心 1 分钟，弃去上清液，并重悬于 5 ml 分离缓冲液中。

Results

该协议用于可视化本氏幼苗子叶中白天和晚上的基质频率。来自 z 堆栈的切片合并为单个图像（图 1A）。出于视觉目的，然后将该图像去饱和并反转，使基质显示为黑色（图 1B）。叶绿体被标记为没有基质（绿色星号）或至少有一个基质（洋红色星号）。在观察到的 87 个表皮叶绿体中，有 33 个有基质。因此，该叶子中的stromule频率为37.9%。

使用此分析，白天对另外 21 株植物（每株植物一片叶子）重复该方案，晚上对总共 24 株植物重复该方案。白天，平均 stromule 频率为 20.8 ± 1.8%;夜间，平均 stromule 频率为 12.8 ± 0.9%（图 2）。根据 Welch's t 检验确定，白天 Stromule 频率显着升高 （n ≥ 22，p < 0.0005 ）。请注意，尽管观察到超过 23,000 个叶绿体和数百个细胞，但样本量 n

Discussion

在研究基质时，必须始终考虑三个重要因素：（i）必须将植物组织的作保持在绝对最低限度，（ii）实验系统必须保持一致，以及（iii）必须仔细规划采样策略，以确保分析可靠、可重复的数据。

基质非常动态：它们可以在显微镜下的观察者眼前快速伸展和缩回。此外，基质频率因各种处理而显着变化，包括为了可视化基质而无法避免的刺激（例如叶子伤）。这个问题的主要解决方案是进行控制良好的实验，保持所有变量的一致性。例如，这包括在将每个样品带到显微镜之前立即准备每个样品进行可视化;植物在可视化之前不应受到损害。这个问题的第二个解决方案是尽量减少协议的复杂性：理想情况下，任何处理都应直接应用于植物，而不会去除叶子或造成任何损害。

已经在一系列令人眼花缭乱的物种和细胞类型中研究了基质，包括小麦根毛、番茄果实和黄化烟草幼苗^8,19。这些开创性研究促进了对植物发育过程中基质动力学的理解，并探索了基质活动的范围。然而，从这些不同的实验系统中进行比较可能会导致误解，因为不同类型的质体参与了截然不同的生物过程。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
山梨糖醇	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
激光扫描共聚焦显微镜	Carl Zeiss Inc	：LSM710
羧基荧光素二乙酸酯（CFDA）	Sigma-Aldrich	21879
二甲基亚砜 （DMSO）	EMD	MX1458-6
Waring 搅拌机	Waring	型号：31BL92
Fiji	fiji.sc		用于分析生物图像的开源软件