可视化Stromule频率与荧光显微镜

Summary

描述了研究叶绿体基质动力学的方案，叶绿体基质是从叶绿体表面延伸

出来的充满基质的小管。

Abstract

Stromules，或"充满基质的小管"，是从叶绿体表面延伸而来的狭窄的管状延伸物，在植物细胞中普遍观察到，但其功能仍然很神秘。随着人们对叶绿体在协调植物对压力的反应中的作用的日益关注，近年来对基质及其与叶绿体信号动力学的关系的兴趣有所增加，这得益于荧光显微镜和蛋白质荧光团的进步，可以快速、准确地可视化基质动力学。在这里，我们提供了详细的方案来测定 Nicotiana benthamiana 表皮叶绿体中的基质频率，这是研究叶绿体基质生物学的优秀模型系统。我们还提供了通过从叶中提取叶绿体在体外可视化叶绿体基质的方法。最后，我们概述了采样策略和统计方法，以分析响应刺激（如环境压力、化学处理或基因沉默）的 stromule 频率的差异。研究人员可以使用这些方案作为起点，为创新实验开发新方法，以探索叶绿体如何以及为什么制造基质。

Introduction

叶绿体是植物细胞中负责光合作用和许多其他代谢过程的动态细胞器。来自叶绿体的信号通路也对植物的生理学和发育产生重大影响，协调植物对环境胁迫、病原体甚至叶形^1-6 的反应。最近，生物学家对叶绿体结构的一个鲜为人知的方面产生了兴趣：基质，即从叶绿体表面延伸出来的非常薄的充满基质的小管⁷。

尽管已知基质频率会随着环境刺激而变化^7-9，并且基质可能能够在细胞器之间传递信号分子⁶，但基质的生物学功能仍然未知。 所有类型的质体（不仅是绿色的光合叶绿体，还有透明的白质体、淀粉填充的淀粉质体和着色的显色质体，仅举几种类型的质体）都构成基质，而基质存在于迄今为止检查过的所有陆地植物物种中。Stromules 可以动态地伸展和缩回，在几秒钟内出现或消失，或者它们可以长时间保持相对静止。基质生物学家面临的主要障碍之一是，基质通常使用截然不同的方法、组织和物种进行研究，这使得跨基质生物学文献的比较变得困难。展望未来，用于研究基质的标准实践和实验系统的全面描述对于发现叶绿体形态的这些普遍特征的功能至关重要。

在这里，我们描述了可视化本氏烟草叶子表皮叶绿体中基质形成的方法。在叶肉中，叶绿体密集地堆积成大型三维细胞，这使得共聚焦显微镜难以准确和快速地观察基质。 相比之下，表皮细胞相对平坦，含有较少的叶绿体，并且位于叶子表面，可以轻松快速地观察基质。....

Protocol

注意：对于该协议，我们专注于测定本氏烟草叶子表皮中的基质频率。已经产生了几种可用于此目的的稳定转基因品系，包括 35S_PRO：FNRtp：EGFP¹³ 和 NRIP1：Cerulean⁶。这两个品系都显示了在各种条件下生长的叶片叶绿体基质中荧光团的强烈表达。或者，叶绿体靶向荧光团可以使用农杆菌转化在本氏烟草中瞬时表达¹³。这不如转基因品系理想，因为农杆菌的渗透在本氏烟草中诱导了一些基础防御反应，并且与农杆菌的相互作用可以改变叶片¹⁴ 中的基质频率，从而可能使结果的解释复杂化。最后，为了在体外可视化基质形成，可以使用基因编码的荧光团或荧光染料从任何植物物种中提取叶绿体，如下文第 5 节所述。^9,15

注意：植物栽培的详细方法已经描述过了。¹⁶ 简而言之，在 4 英寸的花盆中种植本氏烟草植物，里面装满了任何可提供良好排水的专业土壤混合物。在最初的 10-14 天用透明的塑料圆顶覆盖幼苗，为发芽提供潮湿的环境。按照制造商的说明将任何标准肥料混合物添加到 14 天龄的植物中。在白光下生长植物，使用 ~100 μmol 光子 m ^-2 ....

Results

该协议用于可视化本氏幼苗子叶中白天和晚上的基质频率。来自 z 堆栈的切片合并为单个图像（图 1A）。出于视觉目的，然后将该图像去饱和并反转，使基质显示为黑色（图 1B）。叶绿体被标记为没有基质（绿色星号）或至少有一个基质（洋红色星号）。在观察到的 87 个表皮叶绿体中，有 33 个有基质。因此，该叶子中的stromule频率为37.9%。

使用此分析，白天对另外 21 株植物（每株植物一片叶子）重复该方案，晚上对总共 24 株植物重复该方案。白天，平均 stromule 频率为 20.8 ± 1.8%;夜间，平均 stromule 频率为 12.8 ± 0.9%（图 2）。根据 Welch's t 检验确定，白天 Stromule 频率显着升高 （n ≥ 22，p < 0.0005 ）。请注意，尽管观察到超过 23,000 个叶绿体和数百个细胞，但样本量 n

Discussion

在研究基质时，必须始终考虑三个重要因素：（i）必须将植物组织的作保持在绝对最低限度，（ii）实验系统必须保持一致，以及（iii）必须仔细规划采样策略，以确保分析可靠、可重复的数据。

基质非常动态：它们可以在显微镜下的观察者眼前快速伸展和缩回。此外，基质频率因各种处理而显着变化，包括为了可视化基质而无法避免的刺激（例如叶子伤）。这个问题的主要解决方案是进行控制良好的实验，保持所有变量的一致性。例如，这包括在将每个样品带到显微镜之前立即准备每个样品进行可视化;植物在可视化之前不应受到损害。这个问题的第二个解决方案是尽量减少协议的复杂性：理想情况下，任何处理都应直接应用于植物，而不会去除叶子或造成任何损害。

已经在一系列令人眼花缭乱的物种和细胞类型中研究了基质，包括小麦根毛、番茄果实和黄化烟草幼苗^8,19。这些开创性研究促进了对植物发育过程中基质动力学的理解，并探索了基质活动的范围。然而，从这些不同的实验系统中进行比较可能会导致误解，因为不同类型的质体参与了截然不同的生物过程。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
山梨糖醇	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
激光扫描共聚焦显微镜	Carl Zeiss Inc	：LSM710
羧基荧光素二乙酸酯（CFDA）	Sigma-Aldrich	21879
二甲基亚砜 （DMSO）	EMD	MX1458-6
Waring 搅拌机	Waring	型号：31BL92
Fiji	fiji.sc		用于分析生物图像的开源软件