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方法文章

利用荧光显微镜观察链管频率

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DOI：

10.3791/54692

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2016年11月23日

 ,  , 
1Plant Gene Expression Center, Agricultural Research Service, USDA, 2Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

本文内容

摘要

本文描述了研究叶绿体基质管（stromules）动态的实验方案，基质管是自叶绿体表面延伸出的充满基质的管状结构。

摘要

质体管（stromules），即“充满基质的管状结构”，是叶绿体表面延伸出的细长管状突起，在植物细胞中普遍存在，但其功能至今仍不明确。随着人们对叶绿体在调控植物应激反应中作用的关注日益增加，近年来对质体管及其与叶绿体信号动态关系的研究兴趣也不断上升，这得益于荧光显微镜技术和蛋白质荧光标记物的进步，使得质体管动态能够被快速、准确地可视化。本文提供了详细的实验方案，用于检测模式植物Nicotiana benthamiana表皮细胞中叶绿体的质体管出现频率，该体系是研究叶绿体质体管生物学的理想模型。我们还提供了通过从叶片中分离叶绿体以在体外（in vitro）观察质体管的方法。最后，我们概述了取样策略及统计分析方法，用于分析在环境胁迫、化学处理或基因沉默等刺激条件下质体管频率的变化。研究人员可利用这些方案作为起点，开发新的方法，开展创新性实验，以深入探索叶绿体形成质体管的机制及其生物学意义。

引言

叶绿体是植物细胞中负责光合作用及其他多种代谢过程的动态细胞器。来自叶绿体的信号通路还显著影响植物的生理和发育，协调植物对环境胁迫、病原体甚至叶片形态的响应1-6。最近，生物学家开始关注叶绿体结构中一个尚未被充分理解的方面：基质管（stromules），即从叶绿体表面延伸出的极细的、充满基质的管状结构7。

尽管已知基质管（stromule）的出现频率会响应环境刺激而变化7-9，并且基质管可能具有在细胞器之间传递信号分子的能力6，但其生物学功能仍不清楚。所有类型的质体（不仅包括绿色的光合作用型叶绿体，还包括无色的白色体、富含淀粉的淀粉体以及有色的有色体等）均可形成基质管，且迄今为止所研究的所有陆生植物物种中均观察到了基质管的存在。基质管能够动态地伸长和回缩，可在数秒内出现或消失，也可长时间保持相对静止状态。基质管研究领域面临的主要难题之一在于，目前常使用截然不同的方法、组织和物种进行研究，导致跨文献之间的比较十分困难。未来，建立标准化的研究方法，并对用于研究基质管的实验系统进行详尽描述，对于揭示这些普遍存在的叶绿体形态特征的功能至关重要。

本文描述了在Nicotiana benthamiana叶片表皮叶绿体中观察基质管（stromule）形成的实验方法。在叶肉组织中，叶绿体密集地分布在体积较大、呈三维结构的细胞内，这使得通过共聚焦显微镜难以快速而准确地观察基质管。相比之下，表皮细胞较为扁平，所含叶绿体数量较少，且位于叶片表面，因此便于对基质管进行快速、清晰的观察。N. benthamiana是此类实验的理想模式系统，因为与其他多数植物不同，N. benthamiana表皮中的所有细胞均能形成叶绿体10。而在包括Arabidopsis thaliana在内的大多数植物表皮中，仅有气孔保卫细胞含有叶绿体，其他表皮细胞则含有“白色体”（leucoplasts），即无色、形态不规则且不具备光合作用能力的质体9,11,12。因此，在A. thaliana表皮的一个视野中，可能仅能观察到一对保卫细胞中的少量叶绿体；而在N. benthamiana表皮的同一视野中，则可观察到数十甚至数百个叶绿体。然而，本文所描述的所有方法均可根据需要进行调整，以用于研究基质管生物学中的其他问题；例如，我们已采用相同方法研究了A. thaliana白色体中的基质管9。

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方案

注意：本实验方案重点关注表皮细胞中基质小管的频率检测 N. benthamiana 叶片。已获得多个可用于此目的的稳定转基因株系，包括 35SPRO:FNRtp:EGFP13 和 NRIP1:Cerulean6这两种品系在多种生长条件下，叶片叶绿体基质中均表现出强烈的荧光蛋白表达。或者，可将叶绿体靶向的荧光蛋白瞬时表达于 N. benthamiana 使用 农杆菌 转化13这不如转基因品系理想，因为 农杆菌 浸润会诱导一些基础防御反应 N. benthamiana 以及与……的相互作用 农杆菌 可改变叶片中基质小管的频率14，可能会使结果的解释复杂化。最后，为了观察基质管（stromule）的形成 体外叶绿体可以从任何植物物种中提取，可使用基因编码的荧光蛋白或荧光染料，具体方法如第5节所述。9,15

注意：植物培养的详细方法此前已有描述16。简而言之，将N. benthamiana植物种植于装有具有良好排水性的专业土壤混合物的4"花盆中。在播种后的前10–14天内，用透明塑料罩覆盖幼苗，以提供利于萌发的湿润环境。按照生产商说明，向14天大的幼苗施加标准肥料混合物。将植物置于白光下培养，光照强度约为100 µmol photons m-2 sec-1。定期浇水。

1. 准备用于观察的叶片样品

注意：质体管（stromule）的动态会受到损伤的影响8，因此应在共聚焦荧光显微镜观察前立即进行组织制备。理想情况下，样品从植物上取下后应在15分钟内完成观察。

  1. 使用非常锋利的剃须刀片切割叶片的一小部分。为保持一致性，应始终取用叶片的相同区域，并确保在所有实验中观察的表面相同（近轴面或远轴面）。
  2. 切割叶片后，立即将叶片片段浸入装有5 ml水的无针头注射器中，排出注射器中的空气，然后用手指堵住注射器开口并拉动活塞以施加真空。
    1. 缓慢释放活塞，以避免损伤叶片片段。重复此操作两到三次，或直至大部分空气被去除，叶片呈现深绿色。
      注意：此步骤可去除叶片中的空气，以免干扰对基质管（stromules）的准确观察。
  3. 在载玻片上滴加一滴水，将叶片片段置于水滴上。然后在叶片上方再加一滴水，盖上盖玻片。如有气泡，轻轻敲击盖玻片直至气泡排出。此时载玻片已准备好用于显微观察，应立即进行观察。

2. 利用共聚焦荧光显微镜观察链管

  1. 在透射光下，将视野聚焦于叶片切片中心附近区域（避开剃刀片损伤的细胞）。使用20倍物镜，以便同时观察到多个叶绿体。保存透射光图像，以便在必要时后续区分细胞类型。
  2. 将照明光源切换至适用于所用荧光染料的激光，并配备相应的激发和发射滤光片。例如，使用488 nm激光激发GFP，并在500 nm至525 nm范围内收集发射光信号。
    1. 通过显微镜软件，选择GFP通道，点击调整针孔孔径至1艾里单位（Airy unit）。选择激光扫描模式以开始观察样品，然后点击GFP通道，调节激光强度和探测器增益，在确保清晰观察到基质管（stromules）的前提下尽量降低激光功率。一旦确定这些参数，在所有实验中应尽可能保持一致。
  3. 设置一个z轴层扫实验，用于在当前视野内沿叶片表皮进行一系列图像采集。
    1. 在z轴层扫中，应包含视野内所有表皮细胞中的叶绿体，以避免产生偏差（例如，在测试条件下，靠近叶片表面的叶绿体可能具有更多的基质管）。
    2. 以尽可能大的间隔进行成像，既要确保涵盖所有基质管，又要尽量减少z轴层扫所需时间。例如，若1艾里单位对应的共聚焦焦深为2 µm，则每2 µm采集一张图像可能是理想选择。
      注意：叶片表皮表面不平整，因此z轴层扫的总深度会因样品而异；大多数z轴层扫需要采集10–20张图像，但也可能更多。
    3. 根据需要调整扫描速度和图像分辨率，确保z轴层扫快速完成（通常尽可能在5–10分钟内完成）。保存z轴层扫图像以供后续分析。

3. 图像处理

  1. 使用任意图像分析软件测定基质管（stromule）出现频率。本实验方案推荐使用美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）公开提供的 ImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/），或 ImageJ 的流行升级版本 Fiji（http://fiji.sc/Fiji）。
  2. 在软件中使用最大强度投影法将 z-层叠图像合并为单幅图像。
  3. 在图像中识别并手动计数所有叶绿体。
  4. 针对每个叶绿体，通过目视判断在合并后的 z-层叠图像中是否有一个或多个从叶绿体延伸出的基质管。示例见图1。
    注意：由于基质管的生物学功能尚不明确，任何从叶绿体延伸出的细长、充满基质的管状结构均可视为"基质管"，无论其长度如何。一般而言，若该结构在其大部分长度上的直径小于约 1 µm，则可认定为叶绿体的基质管7。为控制不同观察者在判断叶绿体是否具有基质管时的主观差异，应由同一人完成所有图像的分析。另需由第二位研究人员独立验证基质管的出现频率，以进一步减少主观偏差。

4. 实验设计与取样

注意：叶绿体延伸结构（stromule）的出现频率在不同叶片之间差异较大，但已有若干研究报告指出，在单个叶片内部，叶绿体延伸结构的频率变化很小9,17。

  1. 从一片叶子的一个视野中计算叶绿体基质管（stromule）频率。丢弃该叶片，并将其视为一个独立样本。不要将同一叶片的不同视野视为独立样本。
    注意：目前对于如何最佳测量基质管活性的变化尚无明确共识，在基质管功能尚未被更清晰定义之前，研究人员应继续创造性地量化基质管动态。然而，为了便于文献间的比较，除采用更具创造性的方法外，还应使用报告的通用标准。至少应始终报告具有一个或多个基质管的叶绿体所占的比例。
  2. 确定在一个视野中具有基质管的叶绿体频率。使用 ImageJ 识别一个视野中的所有叶绿体。然后，针对每个叶绿体，判断其是否至少形成了一条基质管。以具有基质管的叶绿体所占百分比形式报告基质管频率。
    注意：部分研究人员在报告基质管频率前会对百分比数据进行转换，例如采用反正弦转换；虽然这在统计分析中是一种可选方法，但基质管频率的反正弦值并不直观，无需在研究的主要正文或图示中报告。
    1. 作为替代方法，可统计基质管的总数，并除以叶绿体的总数。
      注意：在大多数情况下，该方法所得结果与方法 4.2 相似；然而，若单个叶绿体形成了多条基质管，则可能高估基质管频率。例如，在代表性结果所示示例中，多个叶绿体具有两条或更多基质管，导致每叶绿体的基质管数量为 40/87（而基质管频率为 33/87）。
    2. 或者，可测定基质管长度而非基质管频率。可在 ImageJ 中使用自由手绘线工具沿基质管轨迹测量其长度。
      注意：由于基质管的生物学功能仍不明确，尚不清楚基质管长度是否影响其功能。若观察到基质管长度存在显著差异，应予以报告，但同时也应报告基质管频率（如 4.2 所述）。
      注意：在相同生长条件下，不同叶片间的基质管频率可能具有高度变异性。因此，尽管测定基质管频率可能耗时较长，实验设计时仍应谨慎确保足够大的样本量。根据本实验室的数据集分析，我们确定每种处理至少需要 16 株植物的样本量，通常即可具备足够的统计效能，以检测两种条件下基质管频率是否存在至少 1.5 倍的统计学显著差异（标准 α = 0.05，β = 0.80）。
  3. 结果的统计分析。
    1. 比较两种处理的平均基质管频率时，应使用 Welch's t 检验（也称为异方差 t 检验或假设方差不等的 t 检验）。
      注意：该检验的统计效能不如传统的 Student's t 检验，但 Welch's t 检验的优势在于不要求不同处理组间基质管频率分布的方差相等。
      注意：由于基质管频率属于"比例"，其抽样分布理论上应为二项分布而非正态分布，这在样本量极低或基质管频率极低（接近 0%）或极高（接近 100%）时，可能对统计分析造成偏倚。一些文献在统计分析前使用了反正弦转换，旨在将二项分布转换为正态分布，从而满足 Student's t 检验或方差分析（ANOVA）的标准假设。然而在实际应用中，反正弦转换对统计分析结果影响甚微或无影响，因此不推荐使用。建议通过重复实验增加样本量，以提高统计效能并减少数据分析中的解释误差。
    2. 无论采用何种统计方法，均应仔细报告每项实验的抽样策略、样本量、统计检验方法及 p 值。
      注意：与其他生物学领域一样，p 值小于 0.05 可视为"统计学显著"，但研究人员应明确报告所获得的精确 p 值。若 p 值略高于 0.05，增加两到三次实验以扩大样本量，可能有助于明确所观察到的差异是否可重复且具有统计学显著性。

5. 提取完整叶绿体以观察基质管动态

注意：已有多种方法用于从叶片中分离叶绿体，包括最近一项关于体外基质管形成研究中采用的略有不同的方案in vitro15。下文详述的方案采用了一种相对简单的方法，虽不能获得生化纯度的叶绿体样品，但可分离出大量完整且健康的叶绿体9,18。

  1. 配制冷提取缓冲液：50 mM Hepes NaOH、330 mM 山梨醇、2 mM EDTA、1.0 mM MgCl2 和 1.0 mM MnCl2。用 NaOH 和 HCl 将 pH 调至 6.9，使用前冷藏。
    注意：尽管非必需，但使用冷缓冲液并在可能时将样品置于冰上，可获得更高比例的完整叶绿体。
  2. 配制分离缓冲液：50 mM Hepes NaOH、330 mM 山梨醇、2 mM EDTA、1.0 mM MnCl2、1.0 mM MgCl2、10 mM KCl 和 1.0 mM NaCl。用 NaOH 和 HCl 将 pH 调至 7.6，使用前冷藏。
  3. 若叶片未表达基因编码的基质荧光蛋白，请配制羧基荧光素二乙酸盐（CFDA）溶液：将 CFDA 溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 50 mM 储存液（每 1.0 ml DMSO 中加入 2.3 mg CFDA）。
    注意：确切浓度并非关键。CFDA 储存液应始终避光保存。将 50 mM CFDA 分装成小份，于 -20 °C 保存。
  4. 为分离叶绿体，从多株植物上取约 5–10 g 叶片，用冷水短暂冲洗。立即转移至 50 ml 冷提取缓冲液中。使用搅拌器以数次短脉冲进行研磨。用两到三层纱布过滤以去除叶片碎片，将提取的叶绿体分装至两个 50 ml 离心管中，于 750 × g 离心 1 分钟。
  5. 弃去上清液，将绿色叶绿体沉淀重悬于 10 ml 分离缓冲液中。再次于 750 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，将叶绿体重悬于分离缓冲液中，最终体积调至 5 ml。
  6. 取 20 µl 叶绿体悬液滴加至载玻片上，加盖盖玻片，开始显微观察。
    注意：表达质体靶向荧光蛋白的转基因植物来源的叶绿体现在已可用于共聚焦荧光显微镜观察。
  7. 对未表达质体靶向荧光蛋白的植物来源叶绿体进行染色，以观察基质管（stromules）。
    1. 向 5 ml 用分离缓冲液悬浮的叶绿体中加入 5 µl 50 mM CFDA 储存液，使终浓度达到 50 µM。
    2. 让叶绿体孵育 5 分钟，然后取少量等分试样（约 50 µl）滴加至载玻片上，加盖盖玻片，开始显微观察。
    3. 使用 FITC 或 GFP 滤光片组。使用 20X 物镜可同时观察多个叶绿体，或使用更高倍物镜观察单个分离的叶绿体。
      注意：CFDA 会在完整叶绿体的基质内产生荧光。
    4. 若背景荧光较强，可在 CFDA 孵育 5 分钟后，用 10 ml 分离缓冲液再次洗涤叶绿体，于 750 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，将叶绿体重悬于 5 ml 分离缓冲液中。

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结果

本实验方案用于观察幼嫩N. benthamiana子叶中白天和夜间基质管（stromule）的出现频率。将z-轴层扫图像的各切片合并为单张图像（图1A）。为便于观察，对该图像进行去饱和并反相处理，使基质呈现黑色（图1B）。叶绿体被标记为无基质管（绿色星号）或至少具有一条基质管（洋红色星号）。在所观察的87个表皮细胞叶绿体中，有33个具有基质管，因此该叶片的基质管频率为37.9%。

通过该分析，白天对另外21株植物（每株植物一片叶）重复进行了该实验方案，夜间共检测了24株植物。白天的平均基质管频率为20.8 ± 1.8%；夜间的平均基质管频率为12.8 ± 0.9%（图2）。根据Welch's t 检验，白天的基质管频率显著高于夜间（n ≥ 22，p < 0....

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讨论

在研究基质管（stromules）时，必须始终考虑三个重要因素：（i）对植物组织的操作必须尽可能减少；（ii）实验体系必须保持一致；（iii）取样策略必须经过周密规划，以确保所分析的数据具有可靠性和可重复性。

质体管（stromules）具有显著的动态性：在显微镜下，观察者可以亲眼看到它们迅速伸长和回缩。此外，质体管的出现频率在多种处理条件下会发生显著变化，包括那些为观察质体管本身而不可避免的刺激因素（例如叶片损伤）。解决这一问题的主要方法是开展设计严谨的对照实验，保持所有变量的一致性，本方案中所描述的实验流程即针对此目的。例如，每个用于观察的样品都应在放置到显微镜前立即制备；植物应在观察前的最短时间内才进行损伤操作。解决该问题的第二个方法是尽量简化实验流程：理想情况下，所有处理应直接施加于整株植物，无需摘除叶片或造成任何损伤。

质体管已在多种物种和细胞类型中得到研究，包括小麦根毛、番茄果实以及黄化烟草幼苗8,19。这些开创性研究推动了人们对质体管在植物发育过程中动态变化的理解，并探索了质体管活动的多种表...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

J.O.B. 和 A.M.R. 获得了美国国家科学基金会的博士前奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HEPESSigma-AldrichH3375
NaOHFischer-ScientificS320-1
山梨醇Sigma-AldrichS1876
EDTAFischer-BiotechBP121
MnCl2Sigma-Aldrich221279
MgCl2Sigma-AldrichM0250
KClSigma-AldrichP3911
NaClSigma-AldrichS9625
激光扫描共聚焦显微镜 Carl Zeiss Inc型号：LSM710
羧基荧光素二乙酸酯（CFDA）Sigma-Aldrich21879 
二甲基亚砜（DMSO）EMDMX1458-6
Waring 匀浆器Waring 型号：31BL92
Fijifiji.sc用于分析生物图像的开源软件

参考文献

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