利用荧光显微镜观察链管频率

摘要

本文描述了研究叶绿体基质管（stromules）动态的实验方案，基质管是自叶绿体表面延伸出的充满基质的管状结构。

摘要

质体管（stromules），即“充满基质的管状结构”，是叶绿体表面延伸出的细长管状突起，在植物细胞中普遍存在，但其功能至今仍不明确。随着人们对叶绿体在调控植物应激反应中作用的关注日益增加，近年来对质体管及其与叶绿体信号动态关系的研究兴趣也不断上升，这得益于荧光显微镜技术和蛋白质荧光标记物的进步，使得质体管动态能够被快速、准确地可视化。本文提供了详细的实验方案，用于检测模式植物Nicotiana benthamiana表皮细胞中叶绿体的质体管出现频率，该体系是研究叶绿体质体管生物学的理想模型。我们还提供了通过从叶片中分离叶绿体以在体外（in vitro）观察质体管的方法。最后，我们概述了取样策略及统计分析方法，用于分析在环境胁迫、化学处理或基因沉默等刺激条件下质体管频率的变化。研究人员可利用这些方案作为起点，开发新的方法，开展创新性实验，以深入探索叶绿体形成质体管的机制及其生物学意义。

引言

叶绿体是植物细胞中负责光合作用及其他多种代谢过程的动态细胞器。来自叶绿体的信号通路还显著影响植物的生理和发育，协调植物对环境胁迫、病原体甚至叶片形态的响应^1-6。最近，生物学家开始关注叶绿体结构中一个尚未被充分理解的方面：基质管（stromules），即从叶绿体表面延伸出的极细的、充满基质的管状结构⁷。

尽管已知基质管（stromule）的出现频率会响应环境刺激而变化^7-9，并且基质管可能具有在细胞器之间传递信号分子的能力⁶，但其生物学功能仍不清楚。所有类型的质体（不仅包括绿色的光合作用型叶绿体，还包括无色的白色体、富含淀粉的淀粉体以及有色的有色体等）均可形成基质管，且迄今为止所研究的所有陆生植物物种中均观察到了基质管的存在。基质管能够动态地伸长和回缩，可在数秒内出现或消失，也可长时间保持相对静止状态。基质管研究领域面临的主要难题之一在于，目前常使用截然不同的方法、组织和物种进行研究，导致跨文献之间的比较十分困难。未来，建立标准化的研究方法，并对用于研究基质管的实验系统进行详尽描述，对于揭示这些普遍存在的叶绿体形态特征的功能至关重要。

本文描述了在Nicotiana benthamiana叶片表皮叶绿体中观察基质管（stromule）形成的实验方法。在叶肉组织中，叶绿体密集地分布在体积较大、呈三维结构的细胞内，这使得....

方案

注意：本实验方案重点关注表皮细胞中基质小管的频率检测 N. benthamiana 叶片。已获得多个可用于此目的的稳定转基因株系，包括 35S_PRO:FNRtp:EGFP¹³ 和 NRIP1:Cerulean⁶这两种品系在多种生长条件下，叶片叶绿体基质中均表现出强烈的荧光蛋白表达。或者，可将叶绿体靶向的荧光蛋白瞬时表达于 N. benthamiana 使用 农杆菌 转化¹³这不如转基因品系理想，因为 农杆菌 浸润会诱导一些基础防御反应 N. benthamiana 以及与……的相互作用 农杆菌 可改变叶片中基质小管的频率¹⁴，可能会使结果的解释复杂化。最后，为了观察基质管（stromule）的形成 体外叶绿体可以从任何植物物种中提取，可使用基因编码的荧光蛋白或荧光染料，具体方法如第5节所述。^9,15

注意：植物培养的详细方法此前已有描述¹⁶。简而言之，将N. benthamiana植物种植于装有具有良好排水性的专业土壤混合物的4"花盆中。在播种后的前10–14天内，用透明塑料罩覆盖幼苗，以提供利于萌发的湿润环境。按照生产商说明，向14天大的....

结果

本实验方案用于观察幼嫩N. benthamiana子叶中白天和夜间基质管（stromule）的出现频率。将z-轴层扫图像的各切片合并为单张图像（图1A）。为便于观察，对该图像进行去饱和并反相处理，使基质呈现黑色（图1B）。叶绿体被标记为无基质管（绿色星号）或至少具有一条基质管（洋红色星号）。在所观察的87个表皮细胞叶绿体中，有33个具有基质管，因此该叶片的基质管频率为37.9%。

通过该分析，白天对另外21株植物（每株植物一片叶）重复进行了该实验方案，夜间共检测了24株植物。白天的平均基质管频率为20.8 ± 1.8%；夜间的平均基质管频率为12.8 ± 0.9%（图2）。根据Welch's t 检验，白天的基质管频率显著高于夜间（n ≥ 22，p < 0........

讨论

在研究基质管（stromules）时，必须始终考虑三个重要因素：（i）对植物组织的操作必须尽可能减少；（ii）实验体系必须保持一致；（iii）取样策略必须经过周密规划，以确保所分析的数据具有可靠性和可重复性。

质体管（stromules）具有显著的动态性：在显微镜下，观察者可以亲眼看到它们迅速伸长和回缩。此外，质体管的出现频率在多种处理条件下会发生显著变化，包括那些为观察质体管本身而不可避免的刺激因素（例如叶片损伤）。解决这一问题的主要方法是开展设计严谨的对照实验，保持所有变量的一致性，本方案中所描述的实验流程即针对此目的。例如，每个用于观察的样品都应在放置到显微镜前立即制备；植物应在观察前的最短时间内才进行损伤操作。解决该问题的第二个方法是尽量简化实验流程：理想情况下，所有处理应直接施加于整株植物，无需摘除叶片或造成任何损伤。

质体管已在多种物种和细胞类型中得到研究，包括小麦根毛、番茄果实以及黄化烟草幼苗^8,19。这些开创性研究推动了人们对质体管在植物发育过程中动态变化的理解，并探索了质体管活动的多种表.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
山梨醇	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
激光扫描共聚焦显微镜	Carl Zeiss Inc	型号：LSM710
羧基荧光素二乙酸酯（CFDA）	Sigma-Aldrich	21879
二甲基亚砜（DMSO）	EMD	MX1458-6
Waring 匀浆器	Waring	型号：31BL92
Fiji	fiji.sc		用于分析生物图像的开源软件