神经药理学操控受限制与自由飞行的蜜蜂，Apis mellifera

摘要

本文描述了多种向蜜蜂施用药物的方法，包括适用于自由飞行蜜蜂的简单非侵入性方法，以及适用于固定蜜蜂的更精确局部处理的侵入性方法。

摘要

蜜蜂表现出惊人的学习能力以及高度发达的社会行为和交流方式。此外，蜜蜂的大脑体积小，易于观察和研究。因此，长期以来，蜜蜂一直是神经生物学家和神经行为学家研究社会性与自然行为神经基础的首选模型。然而，重要的是，用于研究蜜蜂的实验技术不应干扰所研究的行为本身。正因如此，有必要开发一系列对蜜蜂进行药理学操控的技术。本文展示了对固定状态或自由飞行的蜜蜂施用多种药理学试剂的方法。这些方法包括非侵入性方式，如口服和外敷处理，也包括更具侵入性的方法，后者可实现系统性或局部性的精确给药。最后，我们讨论了每种方法的优缺点， 并描述了常见的技术难点及其最佳应对策略。文章最后强调，应根据具体的生物学问题来调整实验方法，而不是相反。

引言

自从卡尔·冯·弗里希阐明蜜蜂的舞蹈语言¹以来，蜜蜂一直是动物行为学和神经生物学研究人员广泛研究的物种。近年来，这两个领域交叉处涌现出大量新兴学科，同时其他多个学科（例如，分子生物学、基因组学和计算机科学）也相继兴起。这推动了大量新理论和模型的快速发展，以理解行为如何由神经系统内的活动所产生。由于蜜蜂具有独特的生活方式、丰富的行为表现，以及易于进行实验和药理学操控的特点，它们始终处于这一科学变革的前沿。

蜜蜂被用于研究基本的神经生物学问题，例如学习和记忆^2,3、决策⁴、嗅觉⁵、 或视觉信息处理⁶等。近年来，蜜蜂甚至被用作研究通常属于医学研究范畴课题的模型，例如成瘾性药物的影响^7-11、睡眠¹²、衰老¹³，以及麻醉机制¹⁴等。

与经典遗传学模式生物（例如， D. melanogaster、C. elegans、M. musculus）不同，目前可用于操控蜜蜂神经功能的遗传工具非常有限，尽管这一状况正在逐步改变¹⁵。因此，蜜蜂研究主要依赖药理学手段进行干预。这....

方案

1. 束缚蜜蜂的药物施用

1. 口服治疗
   1. 将257 g蔗糖与500 ml水混合，配制1.5 M蔗糖溶液（在沸水中溶解此量蔗糖更易）。将蔗糖溶液于4 °C保存，待用。
      注意：蔗糖溶液为某些微生物提供了非常适宜的生长环境，因此容易受到污染并对蜜蜂产生不良适口性。大量蔗糖溶液可分装后于 -20 °C 保存，直至使用。
   2. 确定合适的药物剂量（如何确定剂量将在下文讨论部分中阐述），并配制溶液，使所需药物剂量溶解于20 µL蔗糖溶液中例如，以递送20 µg药物，将药物按1 mg/ml的比例稀释。参照Felsenberg等（2011）的方法固定蜜蜂。¹⁶此步骤至少在给药前12小时完成，以确保蜜蜂在接触药物溶液时已从束缚中充分恢复，不再处于应激状态。
      注意：为了获得更一致的结果，最好对蜜蜂进行饥饿处理（将束缚好的蜜蜂置于34 °C、70%湿度的培养箱中过夜）。
   3. 使用微量移液器将一滴1.5 M蔗糖水溶液接触束缚蜜蜂的触角。当蜜蜂伸出喙时，将含有药物的20 µl 1.5 M蔗糖溶液直接接触其喙部。确保蜜蜂完全摄入全部溶液。以不含药物的1.5 M蔗糖溶液作为溶剂对照。
      注意：蔗糖溶液的用量可能需要根据实验设计进行调整。若进行趋利性条件训练，训练前喂食蜜蜂会影响蜜蜂的反应性。
   4. 丢弃或移除未完全摄食蔗糖的蜜蜂。
      注意....

结果

展示了上述方法的一系列代表性结果，主要目的是证明这些方法能够使药理学试剂进入蜜蜂大脑并影响其行为。

通过胸部注射可轻松获得对脑部过程的特异性效应。

由于通过胸部注射的药理学试剂可能作用于体内的多个靶点，并在到达脑部前被稀释，该技术可能引发特异性方面的担忧。然而，该方法已在文献中被广泛用于干扰认知过程，且无需使用可能产生显著继发效应的高剂量药物。例如，已有研究通过该技术给予转录抑制剂，以鉴定依赖基因表达的记忆阶段。此类分子的胸部注射可使动物存活数天²⁷，这意味着只要浓度选择得当，其对其他靶点的潜在毒性作用可被限制在较低水平。在此条件下，可获得对记忆的选择性且时间依赖性的效应，从而表明该方法能有效靶向脑组织（图 2）。

讨论

上述方法可对自由飞行或束缚状态的蜜蜂进行简单、有效且可靠的处理。这些方法适用于多种实验范式和生物学问题（表1）。所有用于自由飞行蜜蜂的方法均可轻松应用于束缚蜜蜂。然而反向应用则效果较差，因为暂时性束缚和侵入性处理方法常常会影响蜜蜂的飞行能力。

这些方法是从以大脑为中心的角度进行介绍的。这并非由于技术本身存在固有限制，而是源于作者的个人研究兴趣。这些方法完全可用于研究其他器官，没有任何限制。然而，可能需要进行一些小的调整，以使方法更适用于其他器官系统。例如，若局部给药的目标是大脑，通常将药物施用于胸部；但若目标器官为卵巢，则可能更适宜将药物施用于腹部。类似地，注射也可轻松应用于胸部或头部以外的其他部位例如， 可通过在腹部 sclerite 之间注射来靶向腹部器官。

就可向蜜蜂施用的化合物而言，实际上并无限制。通常，人们施用的药理学化合物包括信号分子²¹或其拮抗剂³²，以及定制合成的多肽²⁸。然而，近年来，越来越多.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蔗糖	Sigma-Aldrich	S8501	任何供应商均可
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	M2670
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C8106
一水合右旋糖	Sigma-Aldrich	49159
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	P4417
保护蜡	Dentaurum	124-305-00
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
二甲基甲酰胺	Sigma-Aldrich	D4551
95% 乙醇	Sigma-Aldrich	493511
玻璃毛细管	WPI	1B100F-3
23 G NanoFil 针头	WPI	NF33BV-2
极细镊子	Dumont	0208-55-PO
电极拉制仪	SRI	2001
FemtoJet 微注射仪	Eppendorf	5247 000.01
正二十烷	Sigma-Aldrich	219274
手动显微操作器	Brinkmann Instrumentenbau	MM-33
电子显微操作器	Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik	Junior unit XYZ
体视显微镜	Leica	M80
电烙铁	Weller	WESD51
右旋糖酐，Alexa Fluor 546，10,000 MW	ThermoFisher Scientific	D-22911
右旋糖酐，Alexa Fluor 568，10,000 MW	ThermoFisher Scientific	D-22912
小型培养皿	Sigma-Aldrich	P5481
矿物油	Sigma-Aldrich	M5904
50 ml 离心管	ThermoFisher Scientific	339652
镊子	Australian Entomological Supplies
刀片夹持器与切割器	Australian Entomological Supplies	E130
Feather 双刃剃须刀片	ThermoFisher Scientific	50-949-135
镍铬丝			任何供应商均可
电线			任何供应商均可
模型漆	Tamiya USA	取决于颜色
重复加样器	Hamilton company	PB-600-1
玻璃注射器	WPI	NANOFIL
荧光观察系统	Nightsea	SFR-GR
测微目镜	ProSciTech	S8014-24
带夹持器的微毛细管	Drummond	1-000-0010
液态硅胶			任何供应商均可
热电偶	Digitech	QM-1324
微量移液器	Eppendorf