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方法文章

神经药理学操控受限制与自由飞行的蜜蜂，Apis mellifera

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DOI：

10.3791/54695

⸱

2016年11月26日

 ,  ,  , 
1Department of Science and Mathematics, Volda University College, 2Department of Biology, Washington University in St. Louis, 3Department of Biological Sciences, Macquarie University, 4Department of Biology, University of Konstanz, 5Research Center on Animal Cognition, CNRS, Universite de Toulouse

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了多种向蜜蜂施用药物的方法，包括适用于自由飞行蜜蜂的简单非侵入性方法，以及适用于固定蜜蜂的更精确局部处理的侵入性方法。

摘要

蜜蜂表现出惊人的学习能力以及高度发达的社会行为和交流方式。此外，蜜蜂的大脑体积小，易于观察和研究。因此，长期以来，蜜蜂一直是神经生物学家和神经行为学家研究社会性与自然行为神经基础的首选模型。然而，重要的是，用于研究蜜蜂的实验技术不应干扰所研究的行为本身。正因如此，有必要开发一系列对蜜蜂进行药理学操控的技术。本文展示了对固定状态或自由飞行的蜜蜂施用多种药理学试剂的方法。这些方法包括非侵入性方式，如口服和外敷处理，也包括更具侵入性的方法，后者可实现系统性或局部性的精确给药。最后，我们讨论了每种方法的优缺点， 并描述了常见的技术难点及其最佳应对策略。文章最后强调，应根据具体的生物学问题来调整实验方法，而不是相反。

引言

自从卡尔·冯·弗里希阐明蜜蜂的舞蹈语言1以来，蜜蜂一直是动物行为学和神经生物学研究人员广泛研究的物种。近年来，这两个领域交叉处涌现出大量新兴学科，同时其他多个学科（例如，分子生物学、基因组学和计算机科学）也相继兴起。这推动了大量新理论和模型的快速发展，以理解行为如何由神经系统内的活动所产生。由于蜜蜂具有独特的生活方式、丰富的行为表现，以及易于进行实验和药理学操控的特点，它们始终处于这一科学变革的前沿。

蜜蜂被用于研究基本的神经生物学问题，例如学习和记忆2,3、决策4、嗅觉5、 或视觉信息处理6等。近年来，蜜蜂甚至被用作研究通常属于医学研究范畴课题的模型，例如成瘾性药物的影响7-11、睡眠12、衰老13，以及麻醉机制14等。

与经典遗传学模式生物（例如， D. melanogaster、C. elegans、M. musculus）不同，目前可用于操控蜜蜂神经功能的遗传工具非常有限，尽管这一状况正在逐步改变15。因此，蜜蜂研究主要依赖药理学手段进行干预。这种方法已取得显著成效；然而，由于蜜蜂研究的多样性，需要多种不同的药理给药方法。蜜蜂研究涉及极为广泛的问题，由来自不同学科和背景的研究人员开展，并采用多种实验方法。许多研究问题要求蜜蜂能够自由飞行， 在蜂群中自由互动，或同时满足这两种条件。这使得追踪个体实验动物变得困难，也使得束缚或插管等操作难以实施。

为了适应蜜蜂研究的多样性，需要多种药物递送方法，以确保在满足特定研究范式对药代动力学和药效学特征、方法侵入性及可靠性的要求的同时，实现稳健且灵活的给药。由于存在这些多样化的需求，大多数研究团队已开发出各自独特的药物给药方法。迄今为止，这一直是蜜蜂研究领域的优势之一； 它推动了多种方法的发展，使得同一种药物可在不同实验条件下进行递送。本文的目标并非建立一种统一标准化的蜜蜂药理学操作方法，而是重点介绍已被证明特别有效的几种方法，以帮助研究人员采纳这些方法。我们将讨论这些方法的工作基本原理及其优缺点。

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方案

1. 束缚蜜蜂的药物施用

  1. 口服治疗
    1. 将257 g蔗糖与500 ml水混合，配制1.5 M蔗糖溶液（在沸水中溶解此量蔗糖更易）。将蔗糖溶液于4 °C保存，待用。
      注意：蔗糖溶液为某些微生物提供了非常适宜的生长环境，因此容易受到污染并对蜜蜂产生不良适口性。大量蔗糖溶液可分装后于 -20 °C 保存，直至使用。
    2. 确定合适的药物剂量（如何确定剂量将在下文讨论部分中阐述），并配制溶液，使所需药物剂量溶解于20 µL蔗糖溶液中例如，以递送20 µg药物，将药物按1 mg/ml的比例稀释。参照Felsenberg等（2011）的方法固定蜜蜂。16此步骤至少在给药前12小时完成，以确保蜜蜂在接触药物溶液时已从束缚中充分恢复，不再处于应激状态。
      注意：为了获得更一致的结果，最好对蜜蜂进行饥饿处理（将束缚好的蜜蜂置于34 °C、70%湿度的培养箱中过夜）。
    3. 使用微量移液器将一滴1.5 M蔗糖水溶液接触束缚蜜蜂的触角。当蜜蜂伸出喙时，将含有药物的20 µl 1.5 M蔗糖溶液直接接触其喙部。确保蜜蜂完全摄入全部溶液。以不含药物的1.5 M蔗糖溶液作为溶剂对照。
      注意：蔗糖溶液的用量可能需要根据实验设计进行调整。若进行趋利性条件训练，训练前喂食蜜蜂会影响蜜蜂的反应性。
    4. 丢弃或移除未完全摄食蔗糖的蜜蜂。
      注意：如果大量蜜蜂未能饮用蔗糖溶液，可能需要调整喂食时间表。
  2. 胸腔注射
    1. 在蜜蜂任氏液中配制药物17如下所示：
      1. 混合并高压灭菌 7.45 g NaCl、0.448 g KCl、0.812 g MgCl2, 0.735 g CaCl2, 54.72 克蔗糖、4.95 克 D-葡萄糖和 2.48 克 HEPES 溶于 1,000 毫升水中。配制林格液时需小心，因其易被污染。分装后于 -20 °C 保存，直至使用。
      2. 将药物溶解于林格氏液中，然后进行稀释，使目标剂量包含于5 µl溶液中。例如，若需以5 µg药物处理蜜蜂，可先将1 g药物溶于1 ml林格氏液，再用林格氏液按1:1,000比例稀释，得到终浓度为1 µg/µl的溶液。
        ​注意：也可使用市售的磷酸盐缓冲盐水（PBS）替代林格氏液。
    2. 使用刀片架将双面剃须刀片的一角折断，制成微型手术刀。将刀片碎片固定在刀片架上，使其形成具有锋利尖端的合适刀刃。
    3. 在体视显微镜下，使用显微手术刀在蜜蜂胸部后翅突附近、盾片正上方精确切割一个2 mm的孔，注意不要切得过深，以免损伤飞行肌，同时小心避开翅关节。理想情况下仅切割三边，使表皮瓣可于后续实验结束后翻回原位，覆盖损伤部位。
    4. 使用微量移液器，将含有药物的5 µL Ringer溶液（或PBS）滴加到胸部的小孔上方。在显微镜下仔细观察，确保整个液滴完全被血淋巴吸收。以Ringer溶液（或PBS）作为空白对照。
    5. 如果可能，将角质层瓣膜移回覆盖住孔洞。5-10小时后，它将重新附着并封闭孔洞。
      注意：作为该技术的替代方法，可使用注射针头（直径：0.6 mm，G：23）在盾片后部横线（即后胸小盾片中脊）中央刺出一个小孔，然后用玻璃注射器直接向胸部注入1 µl液体。该方法无需先用手术刀切开胸部，且注射部位更小，但会导致注射部位暴露。
  3. 显微注射至卵细胞
    ​注意：该方法适用于将分子递送至头壳内部的血淋巴中。
    1. 按照1.2.1步骤配制药物，但调整药物浓度，使所需剂量包含在1 µl的Ringer液或PBS中（与胸部注射相比，复眼小孔可吸收的液体体积更小）。
    2. 按照1.2.2节的方法制备微型手术刀。在体视显微镜下，用石蜡填充束缚蜜蜂颈部的缝隙，将其头部固定。使用低熔点石蜡（例如， 牙科蜡），以避免损伤触角嗅觉受体或其他可能对行为评估至关重要的细胞（例如， 嗅觉学习）。然后将显微手术刀的尖端插入中单眼晶状体下方，小心地将晶状体从头壳上分离并轻轻取下。
      ​注意：也可小心地将石蜡覆盖在触角上以防止其移动。
    3. 小心地将药物滴加到小眼孔中，等待其完全吸入头壳内。移除触角上的牙科蜡，让蜜蜂休息片刻后再继续实验操作。使用林格氏液（或PBS）作为溶剂对照。
  4. 向单眼束内注射
    注意：小眼区神经束包含较粗的纤维，连接至中枢脑的大部分区域18该治疗方法能够将化合物仅作用于脑部，但无法靶向脑内的特定亚区。
    1. 按照1.3.2步骤准备蜜蜂，并参照1.3.3步骤，用显微手术刀的尖端去除中单眼的晶状体。
      ​注意：此步骤可在注射前最多2小时进行。根据我们的经验，喂食过的蜜蜂比饥饿的蜜蜂更能耐受该手术
    2. 使用带有细针头的小型规格10 µl玻璃注射器，注入例如， 33号，直径：210 µm）针头，使用按1.3.1制备的药物溶液
    3. 使用手动显微操作仪，将注射器针尖穿过单眼视网膜插入头囊，深度达 50 µm，注入 250 nl 溶液。
    4. 使用后，用清水冲洗注射器 用蒸馏水洗涤3次，再用75%乙醇洗涤3次。
  5. 特定脑区的显微注射
    ​注意：除了上述系统性处理外，还可对特定脑区进行显微注射。这种方法可实现对一个或多个脑区的药理学操控，同时不影响其他脑区。该方法最适合于从前脑表面易于识别的脑区例如，触角叶、蘑菇体萼部或垂直叶，或视叶），但其他区域也已被作为靶点。请注意，方向（前/后、背/腹）指的是身体轴向，而非神经轴向19.
    1. 以与1.2.1节相同的方式在林格氏液或PBS中配制药物，并加入荧光标记（例如， 0.5 mg/ml 葡聚糖，Alexa 546 或 568 荧光染料）或非荧光染料（例如，1 mM 亚甲蓝。
      注意：添加荧光染料可在实验结束后通过共聚焦显微镜观察脑组织切片来验证注射位点，而非荧光染料则可在实验过程中进行直接监测。
    2. 为制备用于注射的玻璃移液管，将合适直径的玻璃毛细管插入拉针仪的夹持器中（对于材料清单中所述显微注射仪所配的标准夹持器，使用直径1.0 mm的毛细管）。调节拉力和加热参数，以拉制出尖端长度约为0.5 cm的移液管（不同拉针仪的参数设置各不相同，即使使用相同型号的仪器亦如此）。
      注意：理想情况下，从同一根玻璃管拉制的两根移液管应具有相同的长度和形状，以便两者均可使用。
    3. 在体视显微镜下，根据目镜中插入的网格刻度尺进行目测，将尖端折断至外径约为10–15 µm。刻度尺上的刻度由制造商定义，可根据所使用的放大倍数进行校正。
    4. 然后，用待注射的溶液填充玻璃移液管。如果使用带纤维丝的玻璃毛细管，则将移液管后端插入药物溶液中进行填充；否则，使用微载样吸头从尖端填充。
    5. 将装有液体的玻璃移液管插入显微注射仪的毛细管固定器中，该显微注射仪由手动或电子显微操作器控制。
    6. 校准显微注射仪以注入所需体积（0.5–2 nl，具体取决于靶向脑区的大小）。为此，直接将液体注入盛有石蜡油的小型培养皿中，并使用网格测微尺测量液滴直径。调整参数设置，直至达到目标体积。
    7. 用软质牙科蜡固定束缚好的蜜蜂头部，操作方法同1.3.2。随后使用显微手术刀在头部胶囊的前部切开一个开口，进行三处切割：第一处位于中单眼下方（腹侧），第二处位于右眼或左眼边缘，第三处位于触角基部上方（背侧）。用一小块牙科蜡将翻开的组织瓣固定在位。
    8. 用精细镊子小心地将位于脑组织上方的腺体和气管移开，然后在目标脑结构上方的神经膜（脑周围的一层极薄的膜）上制造一个小的破裂口。
      注意：若需同时处理大量蜜蜂，可提前进行此步骤；但需注意不要让蜜蜂处于该状态过久（不超过30分钟），以免其脑组织脱水。
    9. 将尖端插入目标脑区，并垂直于脑表面调整深度（例如， 60 µm，用于蘑菇体萼区）。注射预设体积。对于大脑侧区，进行双侧注射（即 对每个半球进行一次注射。若使用非荧光染料，注射时需在观察下确保注射位置准确；若使用荧光染料，则需在荧光显微镜配备荧光观察系统的体视显微镜下，于荧光照明条件下进行相同操作。
    10. 随后，将翻开的切口重新盖回蜜蜂头部。使用缠绕在微型电烙铁尖端的细金属丝，熔化一颗直径约1毫米的二十烷晶体（熔点为35–37 °C），并用其封闭切口。此步骤可显著降低死亡率。
    11. 将蜜蜂从束缚装置中释放，用于行为分析（但需参见讨论部分），或保持其处于束缚状态以进行限制性蜜蜂的实验—— 例如， Proboscis extension reflex (PER) 测试20.
    12. 如果使用了荧光染料，实验结束后需使用共聚焦激光扫描显微镜确认注射到位目标区域图1).
      注意：当靶向较深的脑区时，此方法尤为有用（因为在注射阶段很难观察非荧光性染料）。

2. 自由飞行蜜蜂的给药方法

  1. 口服治疗
    1. 以与步骤1.1.1–1.1.2相同的方式配制药物。将药物溶液加入饲喂器中，并置于冰箱中保存。
      注意：可使用任意饲养垫材，例如倒置的瓶盖或倒扣在滤纸上的小罐子。
    2. 将装有1 M或0.5 M蔗糖溶液的重力喂食器放置在蜂箱附近，训练蜜蜂前来取食。当蜜蜂开始在喂食器处觅食后，逐渐将喂食器移至较远位置，直至达到便于操作且避免被蜇的安全距离（至少5 m）。
    3. 用颜料标记蜜蜂以追踪每只个体蜜蜂。列出将使用的所有颜色组合。当一只蜜蜂落在饲喂器上时，小心地在其腹部标记两种颜色，并在列表中记录该组合已被使用。
    4. 将重力饲喂器更换为含有药物/蔗糖溶液的饲喂器。记录访问该饲喂器的标记蜜蜂。捕捉任何未标记而访问饲喂器的蜜蜂，因为蜜蜂具有很强的招募能力，访问药物饲喂器的蜜蜂数量可能迅速失控。如果需要连续多天重复同一实验，这种情况尤为不利，因为原本未受过训练的蜜蜂可能不再处于 naïve 状态。
      注意：作为训练单只蜜蜂至饲喂器的替代方法，此前有研究者成功地将添加药物的蔗糖水喂给整个蜂群21-23.
  2. 局部治疗
    ​注意：目的是将目标化合物溶解于能够穿透昆虫蜡质表皮的溶剂中。可使用不同的溶剂，最常用的包括丙酮、二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSO）。
    1. ​评估哪种溶剂最适合当前化合物。如果预期过量会导致强烈表型，例如， 麻痹或死亡），用高剂量（例如， 20 µg 可卡因7) 溶解于不同溶剂中，并仔细监测至出现麻痹或死亡的时间。
    2. 使用1 µL微量毛细管（或可安装在适当重复分配器上的微量注射器）及微量毛细管支架，吸取1 µL药物溶液例如， 将3 µg/µl的可卡因溶液吸入毛细管中。挤出液滴，并小心地将其涂抹在已标记蜜蜂的胸部。应尽可能扩大溶液覆盖面积，避免形成集中的液滴，否则蜜蜂容易通过梳理行为将其清除。注意勿使化合物接触翅基关节，否则溶液可能被引至翅膀表面并沿翅扩散，在未被血淋巴吸收前即蒸发。
      注意：根据研究目的，该方法也可用于向蜜蜂腹部施加药物。然而，将药物施加于胸部时，其到达中枢神经系统的速度更快，且剂量更大。24该方法对束缚状态的蜜蜂和自由飞行的蜜蜂均同样有效。
  3. 挥发处理
    1. 溶解药物（此前该方法已用于向蜜蜂递送可卡因）10) 溶于100%乙醇中。为确保溶解性，应尽量避免使用该药物的盐酸盐或其他盐类形式。配制稀释液时，应使供给一只蜜蜂的药量包含在100 µl溶液中。以纯乙醇作为空白对照。
    2. 要制备丝状结构，采用与McClung和Hirsh相同的方法25.
      1. 简要说明：将镍铬丝紧密缠绕在钉子上，并在镍铬丝两端各连接一根导线。取出钉子后，剩余的镍铬线圈即称为灯丝。
      2. 将两根导线穿过50 ml离心管管盖上仔细钻好的孔，管盖应耐受所选温度。用液态硅胶将导线固定。
        ​注意：这将使试管密封，对于避免实验人员二次暴露并确保蜜蜂接受适当剂量至关重要。
    3. 将连接至灯丝的导线接入电源。使用热电偶测量灯丝温度，尝试不同的电压/电流组合，直至找到适合该药物的合适温度曲线，理想情况下可实现10秒或更短时间的加热。这一点至关重要，请参考相关文献例如， 为了使可卡因挥发，需要将其加热至至少 200 °C；但在超过 350 °C 的温度下，它会分解为次级化合物26).
    4. 小心地将100 µl含乙醇的药物溶液用移液器滴加到纤维丝上。尽可能将液体均匀涂布在纤维丝表面，以提高蒸发效率。将纤维丝在室温下静置暴露，直至所有乙醇完全蒸发。
      ​注意：如果乙醇未充分蒸发，蜜蜂将同时接触到目标药物和乙醇。蜜蜂对乙醇极为敏感，且某些药物与乙醇具有协同作用，这会干扰实验结果。
    5. 待乙醇完全蒸发后（通常可在显微镜下观察到干燥的纤维上出现药物沉淀），用50 ml离心管捕捉一只正在飞行的蜜蜂，小心盖上装有纤维的管盖。
    6. 打开电源10秒，关闭电源并等待50秒（使挥发的化合物冷却并凝结或沉积）。释放蜜蜂。
      注意：虽然该处理方法对自由飞行的蜜蜂效果极佳，但同样适用于束缚状态的蜜蜂。只需将束缚好的蜜蜂置于50 ml离心管内即可。每只蜜蜂处理后，按2.3.4步骤重新装入灯丝。为提高通量，可并行使用多根灯丝。

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结果

展示了上述方法的一系列代表性结果，主要目的是证明这些方法可使药理学试剂进入蜜蜂大脑并影响其行为。

通过胸部注射可轻松获得对脑部过程的特异性作用。

由于通过胸部注射的药理学试剂可能作用于体内的多个靶点，并在到达脑部前被稀释，该技术可能引发特异性方面的担忧。然而，该方法已在文献中被广泛用于干扰认知过程，且无需使用可能产生显著继发效应的高剂量药物。例如，已有研究通过该技术给予转录抑制剂，以鉴定依赖基因表达的记忆阶段。此类分子的胸部注射可使动物存活数天27，这意味着只要浓度选择得当，其对其他靶点的潜在毒性作用可被限制在较低水平。在此条件下，可获得对记忆的选择性且时间依赖性的效应，从而表明对脑组织实现了有效靶向（图 2）。

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讨论

上述方法可对自由飞行或束缚状态的蜜蜂进行简单、有效且可靠的处理。这些方法适用于多种实验范式和生物学问题（表1）。所有用于自由飞行蜜蜂的方法均可轻松应用于束缚蜜蜂。然而反向应用则效果较差，因为暂时性束缚和侵入性处理方法常常会影响蜜蜂的飞行能力。

这些方法是从以大脑为中心的角度进行介绍的。这并非由于技术本身存在固有限制，而是源于作者的个人研究兴趣。这些方法完全可用于研究其他器官，没有任何限制。然而，可能需要进行一些小的调整，以使方法更适用于其他器官系统。例如，若局部给药的目标是大脑，通常将药物施用于胸部；但若目标器官为卵巢，则可能更适宜将药物施用于腹部。类似地，注射也可轻松应用于胸部或头部以外的其他部位例如， 可通过在腹部 sclerite 之间注射来靶向腹部器官。

就可向蜜蜂施用的化合物而言，实际上并无限制。通常，人们施用的药理学化合物包括信号分子21或其拮抗剂32，以及定制合成的多肽28。然而，近年来，越来越多...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目由澳大利亚研究理事会（ARC）资助（资助号：DP0986021）和澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）资助（资助号：585442）。ABB 获澳大利亚研究理事会未来研究员项目（FT140100452）支持。JAP 获得麦考瑞大学颁发的 iMQRES 奖学金以及德国学术交流中心（DAAD）颁发的博士生奖学金支持。JMD 获得法国国家科学研究中心（CNRS）和保罗·萨巴蒂埃大学支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蔗糖Sigma-AldrichS8501任何供应商均可
氯化钠Sigma-AldrichS7653
氯化钾Sigma-AldrichP9333 
六水合氯化镁Sigma-AldrichM2670
二水合氯化钙Sigma-AldrichC8106
一水合右旋糖Sigma-Aldrich49159
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichP4417
保护蜡Dentaurum124-305-00
HEPESSigma-AldrichH3375
二甲基甲酰胺Sigma-AldrichD4551
95% 乙醇Sigma-Aldrich493511
玻璃毛细管WPI1B100F-3
23 G NanoFil 针头WPINF33BV-2
极细镊子Dumont0208-55-PO
电极拉制仪SRI2001
FemtoJet 微注射仪Eppendorf5247 000.01
正二十烷Sigma-Aldrich219274
手动显微操作器Brinkmann InstrumentenbauMM-33
电子显微操作器Luigs & Neumann Feinmechanik + ElektortechnikJunior unit XYZ
体视显微镜LeicaM80
电烙铁WellerWESD51
右旋糖酐，Alexa Fluor 546，10,000 MWThermoFisher ScientificD-22911
右旋糖酐，Alexa Fluor 568，10,000 MWThermoFisher ScientificD-22912
小型培养皿Sigma-AldrichP5481
矿物油Sigma-AldrichM5904
50 ml 离心管ThermoFisher Scientific339652
镊子Australian Entomological Supplies
刀片夹持器与切割器Australian Entomological SuppliesE130
Feather 双刃剃须刀片ThermoFisher Scientific50-949-135
镍铬丝任何供应商均可
电线任何供应商均可
模型漆Tamiya USA取决于颜色
重复加样器Hamilton companyPB-600-1
玻璃注射器WPINANOFIL
荧光观察系统NightseaSFR-GR
测微目镜ProSciTechS8014-24
带夹持器的微毛细管Drummond1-000-0010
液态硅胶任何供应商均可
热电偶DigitechQM-1324
微量移液器Eppendorf

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