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方法文章

生成中 从头合成 通过逆转录病毒转导中心半链获得抗原特异性人T细胞受体

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DOI：

10.3791/54697

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2016年10月25日

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1Department of Immunology, University of Toronto, 2Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种通过将具有目标抗原特异性的现有T细胞受体（TCR）的TCRα或TCRβ链，与外周T细胞受体库中的互补半链配对，从而生成抗原特异性T细胞受体（TCR）的新方法。de novo生成的TCR保留了抗原特异性，但亲和力有所不同。

摘要

T细胞受体（TCRs）在临床上被用于引导T细胞特异性靶向肿瘤，是一种具有前景的免疫治疗方式。因此，克隆针对多种肿瘤相关抗原的TCR已成为众多研究的目标。为了引发有效的T细胞应答，TCR必须以适当的亲和力识别靶抗原。然而，克隆具有此类特性的TCR一直存在挑战，许多现有的TCR对其同源抗原的亲和力未达最佳。在本方案中，我们描述了一种克隆方法 从头合成 利用现有TCR通过半链中心性策略获得高亲和力抗原特异性TCR。已知在某些TCR中，TCRα或TCRβ半链在抗原识别中的贡献并不均等，其中起主导作用的半链被称为中心半链。我们已证实，将中心半链与不同于原始配对链的反向链进行组合，可在保持抗原特异性的同时，调节其与同源抗原相互作用的强度。因此，通过优化中心半链与反向半链之间的配对，可提升特定TCR的治疗潜力。

引言

T细胞受体（TCRs）是由T淋巴细胞表达的异源二聚体适应性免疫受体，由TCRα和TCRβ链组成。它们通过V(D)J基因片段的体细胞重排生成，从而产生高度多样化的受体库，能够识别几乎无限种类的HLA/肽复合物。在临床上，经基因工程改造以表达针对肿瘤相关抗原的克隆型TCR的T细胞，已在多种癌症治疗中显示出疗效1。然而，许多为此目的而克隆的TCR对目标抗原的亲和力不足，限制了其治疗应用。

本文介绍了一种通过利用链中心性（chain-centricity）来克服现有TCR局限性的方法。已有研究报道，一个TCR半分子链在识别靶抗原过程中可能起主导作用2，此处称之为“中心链”（centricity）。晶体结构分析表明，TCR中的一个中心半分子链可构成其在MHC/肽复合物上结合界面的大部分区域3,4。基于这一概念，我们先前已证明，SIG35α TCRα链能够与多种不同的TCRβ链配对，并保持对HLA-A2呈递的MART127-35肽段的反应活性5。在TAK1 TCR中也获得了类似结果，其中具有中心作用的TCRβ链与多种TCRα链配对后，仍能维持对HLA-A24呈递的WT1235-243肽段的反应性6。MART1和WT1均为肿瘤相关抗原。链中心性原理还被应用于研究CD1d限制性不变的自然杀伤T（iNKT）细胞TCR的抗原识别，方法是将人iNKT TCR中不变的Vα24-Jα18（Vα24i）TCRα链与不同的Vβ11 TCRβ链进行配对7。

在所有情况下，我们均能够生成一个 从头合成 通过将中心TCR半链转导至外周血T细胞，使其与内源性TCRα或TCRβ互补链配对，从而构建TCR多样性库。本质上，该中心半链作为“诱饵”，可用于筛选能够与之配对并形成具有目标抗原特异性的TCR的互补链，所形成的TCR在保持特异性的同时具有不同的亲和力。基于这些新型TCR库，我们成功分离出相较于已知TCR对目标抗原具有更强相互作用强度的克隆型TCR。因此，我们认为该方法将加速临床应用中最优TCR的筛选进程。

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方案

1. 准备受体病毒构建体以编码目标TCR半链

  1. 线性化pMX载体，以便在后续步骤中插入TCR基因。使用EcoRI和NotI限制性内切酶在37 °C下消化质粒DNA，反应3小时。表1)8.
  2. 在1.2%琼脂糖凝胶上对消化后的质粒进行电泳。切下约4,500个碱基对（bps）的条带，使用市售凝胶回收试剂盒将其洗脱于30 μl无菌水中9.
  3. 设计针对目标TCR基因的5'和3'引物，使其分别包含15-20个碱基与pMX载体的EcoRI和NotI酶切位点重叠8.
  4. 使用引物扩增TCR基因。对PCR产物进行电泳，并按照步骤1.2所述，回收约1,000 bp的条带。
  5. 将每个线性片段与市售质粒组装预混试剂混合，于50 °C孵育1小时，将TCR基因克隆至经消化的载体中。
    注意：各组分的相对体积请参考生产商提供的说明书。该组装方法基于 Gibson 最初描述的技术。 等10.
  6. （可选）通过人神经生长因子受体截短形式（ΔNGFR，氨基酸1-277）标记TCR基因，以标记转导细胞11 由弗林蛋白酶切割位点、丝氨酸-甘氨酸连接子和2A序列分隔12,13设计引物以编码与片段末端重叠的序列，并按照步骤1.3-1.5所述方法组装质粒。
    注意：这些序列可在参考文献中找到11-13.
  7. 转化感受态细胞 E. coli 按照制造商的说明，使用已构建的质粒14将转化后的细菌接种于琼脂平板（含20 mg/ml 胶体培养基（LB）、15 mg/ml 琼脂和1 μg/ml 氨苄青霉素）上，37 °C 培养18小时。
  8. 在37 °C、200转/分钟的摇床培养箱中，将单个细菌菌落接种于50 ml LB培养基（含20 mg/ml LB和1 μg/ml氨苄青霉素）中培养16小时。
  9. 使用市售的中量质粒提取试剂盒，按照制造商提供的方案纯化质粒。将质粒稀释至浓度约为 1 μg/μl。
    注意：质粒纯化方案基于碱裂解法15.

2. 生成稳定包装细胞系

注意：293GPG 和 PG13 细胞均为贴壁细胞。使用添加 10% 胎牛血清（FCS）和 50 μg/ml 庆大霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养细胞。转染前，将 293GPG 细胞在含 1 μg/ml 四环素的培养基中培养。所有操作步骤间，将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育。

  1. 转染293GPG包装细胞16 在T75培养瓶中培养，使用商品化转染试剂，按照生产商说明书，将第1.9步获得的编码半链的载体导入细胞17注意：在293GPG细胞融合度为50-60%时进行转染。
  2. 吸除293GPG细胞的培养基，转染后1天加入10 ml新鲜DMEM培养基。
  3. 在步骤2.2后的第2天，将转染的293GPG细胞的培养基转移至注射器中，通过0.45 μm滤器过滤，收集瞬时产生的病毒。
    注意：病毒可立即使用，或于 -80 °C 保存以备后续使用。
  4. 培养 1 × 105 T25 培养瓶中的 PG13 细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。24 小时后，吸除培养基，加入 1.5 ml 来自步骤 2.3 的 293GPG 来源病毒和 1.5 ml DMEM 培养基，并加入终浓度为 8 μg/ml 的 polybrene。
  5. 按照步骤2.4所述，每天更换一次培养基，持续4天，以建立稳定表达编码目标TCR半链的逆转录病毒的PG13包装细胞系。
  6. 吸弃培养基，于末次感染后24小时为PG13细胞系更换新鲜DMEM培养基以继续培养。
    注意：使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞后进行冻存或传代培养。
  7. 为从转导的PG13细胞系中产生病毒，培养2 x 10⁶6 T75 培养瓶中加入 10 ml DMEM 培养基培养细胞，接种后第三天按步骤 2.3 所述方法收集病毒。
    注意：病毒最好立即使用，但可在 -80 °C 保存长达两个月。

3. 人T细胞的激活与转导

注意：人体样本的获取和使用均遵循经机构伦理委员会批准的方案。使用添加了10%人血清（替代FCS）和50 μg/ml庆大霉素的罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）培养基培养原代人源细胞。所有步骤之间，将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育。

  1. 按照制造商的说明书，通过密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）18。
  2. 激活T细胞以诱导逆转录病毒感染所需的增殖。在6孔板中，每孔接种2 × 107个新鲜或解冻的PBMC，加入5 ml RPMI培养基，并添加100 IU/ml重组人白细胞介素-2（rhIL-2）和50 ng/ml抗CD3单克隆抗体（克隆号OKT3），进行培养。
  3. 刺激后第3天，用移液器收集T细胞，以350 × g离心4分钟。弃去上清液，将0.5–1 × 106个T细胞接种至24孔板中，每孔加入1 ml来自步骤2.7的PG13病毒和1 ml补充有200 IU/ml rhIL-2的RPMI培养基。将培养板在1,000 × g、32 °C条件下离心1小时。
  4. 24小时后，用移液器收集T细胞，以350 × g离心4分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 ml来自步骤2.7的PG13病毒和1 ml补充有200 IU/ml rhIL-2的RPMI培养基中。重复此步骤，共进行6次感染。
    注意：感染次数应根据包装细胞系产生的病毒滴度进行优化。如有必要，可通过每天移除20–30%的细胞来传代培养T细胞，以防止过度生长。
  5. 最后一次感染后24小时，用移液器收集T细胞，以350 × g离心4分钟。弃去上清液，将细胞重悬于含100 IU/ml rhIL-2的RPMI培养基中继续培养。
  6. 在步骤3.5后的2–3天，于4 °C下用HLA多聚体染色T细胞30分钟，随后在4 °C下用抗人CD3及共受体单克隆抗体（mAbs）染色15分钟。通过流式细胞术进行分析。使用无关多聚体和/或未转导的细胞作为阴性对照（图1–3）19。
  7. 若导入的中心半链为TCRα链，可使用市售的Vβ特异性抗体组合，通过流式细胞术分析从头产生的多聚体阳性细胞的Vβ使用情况20。

4. 克隆 从头合成 TCR 反向半链

  1. 排序 从头合成 通过流式辅助细胞分选法检测第3.6步中的多聚体阳性细胞群。
  2. 使用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法从分选的T细胞中分离RNA21,22.
    注意：RNA 可在 -80 °C 保存，但应尽快用于合成 cDNA。
  3. 使用市售逆转录-PCR试剂盒，按照制造商说明书从提取的RNA合成cDNA文库23,24.
  4. 若克隆TCRβ反向链，根据步骤3.7设计Vβ基因与TCRβ恒定区特异性引物，并按照步骤1.3–1.9所述方法克隆全长TCRβ基因。若反向链为TCRα，请参见步骤4.5；否则继续至步骤5.1。
  5. 市售的Vα特异性抗体有限，因此无法通过流式细胞术确定Vα基因的使用情况。通过5'-cDNA末端快速扩增（RACE）克隆TCRα反向链25，使用市售的5' RACE试剂盒6.
    1. 按照制造商说明书，从第4.2步提取的RNA中合成适用于5' RACE的cDNA。
    2. 执行 1st 如所述进行PCR扩增 表 2.
    3. 对PCR产物进行电泳，并切下约1,100 bp的条带，具体操作如步骤1.2所述。
    4. 执行 2nd 如所述进行PCR扩增 表3，使用1st 以扩增产物为模板进行下一轮PCR。
      注意：下方显示的引物序列 表3 设计用于克隆至经 EcoRI 和 NotI 消化处理的 pMX 载体中。
    5. 对PCR产物进行电泳，并按照步骤1.2所述，回收约1,000 bp的条带。
    6. 将TCRα基因克隆至经EcoRI和NotI酶切的pMX载体中，并按照步骤1.5-1.9所述方法纯化质粒。

5. 重建新型抗原特异性TCR克隆

注意：在添加了10% FCS和50 μg/ml庆大霉素的RPMI培养基中培养Jurkat 76细胞及后续细胞系。所有步骤之间，将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育。

  1. 使用第2.3步制备的293GPG病毒，将中心TCR半链转导至Jurkat 76细胞26（或等效的TCR-/-人T细胞系）。对于Jurkat 76细胞，每孔接种5 × 104个细胞至24孔板中，加入1 ml病毒液和1 ml RPMI培养基。在1,000 × g、32 °C条件下离心1小时。
  2. 感染24小时后，用移液器收集转导了半链的Jurkat 76细胞，在350 × g条件下离心4分钟。弃去上清液，将细胞重悬于新鲜RPMI培养基中继续培养。
  3. 若半链带有分子标签，则在第5.2步后2-3天通过荧光标记的抗-NGFR单克隆抗体染色，随后进行流式辅助或磁珠辅助细胞分选，以纯化转导细胞（可选）27。
  4. 按照步骤2.1至2.3，制备编码TCR对侧链的293GPG病毒，该对侧链克隆自步骤4.4或4.5。
  5. 为完全重建TCR，使用第5.4步所得病毒，对在步骤5.1–5.3中稳定表达中心TCR半链的T细胞系进行转导。转导操作参照步骤5.1–5.2所述进行。
  6. 在第5.5步后2-3天，按照制造商说明书，使用抗-CD3磁珠辅助细胞分选法纯化CD3+转染细胞27。
  7. 为验证抗原特异性，在CD3纯化后3-5天，对表达由中心TCR半链与不同对侧链配对组成的克隆型TCR的转染细胞进行染色，包括抗-CD3和/或共受体单克隆抗体以及HLA多聚体，随后通过流式细胞术分析细胞（图4–5）19。

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结果

在不了解哪条半链为链中心性的情况下，应将TCRα和TCRβ链分别克隆并转导至外周血T细胞，HLA-A24/WT1反应性TAK1 TCR即采用此方法图1）。TAK1β的转导显著提高了抗原特异性T细胞的频率。相反，非中心半链的转导则不会产生 从头合成 多聚体阳性T细胞，如TAK1α链所示（图1）。分析时，对NGFR设门+ 如果TCR基因被标记以特异性分析转导细胞（图1-2）。另一方面，如果已知单个中心半链具有显性作用，则可对其进行转导，例如 SIG35α 以及恒定的 Vα24 TCRα 链（图2 和 3). 转导中心型 TCRα 半链后，针对相应同源抗原的 T 细胞频率增加。图2-3这些数据共同表明，将中心型TCRα或TCRβ半链引入外周血T细胞可产生 从头合成...

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讨论

成功应用该方法的首要条件是实现目的半链在原代T细胞中足够的转导效率。根据我们的经验，使用PG13作为包装细胞系，并以pMX作为逆转录病毒载体，可在人原代T细胞中实现导入基因的稳定且高效的表达。PG13包装细胞可通过单细胞克隆筛选出高滴度的包装细胞，以提高转导效率。此外，T细胞的增殖也是实现逆转录病毒高效转导所必需的。在本方案中，使用可溶性抗CD3单克隆抗体OKT3刺激，并联合高浓度重组人IL-2（rhIL-2），可提供诱导细胞分裂所需的活化信号。可溶性OKT3的刺激能力依赖于单核细胞，可能通过其Fc受体结合实现。因此，该特定刺激方案需要使用未分离纯化的外周血单个核细胞（PBMC），而非纯化的T细胞。为获得最佳实验结果，T细胞应培养于添加人血清的RPMI培养基中。本文所述其他所有细胞均可在含胎牛血清的培养基中培养。

第二， 从头合成 表达抗原特异性TCR的细胞必须可被检测。对于某些TCR半链，如TAK1β， 从头合成 表达TCR的细胞仅在经抗原脉冲的抗原呈递细胞（APCs）刺激后方可被检测到。因此，若在转导中心半链后未立即检测到抗原特异性TCR，则...

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披露

大学健康网络已就该方法提交了专利申请，N.H.、M.N. 和 T.O. 被列为发明人。其他作者不存在经济利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 CA148673（NH）；安大略癌症研究所临床研究员奖IA-039（NH）；BioCanRX催化剂资助（NH）；玛格丽特公主癌症基金会（MOB, NH）；加拿大卫生研究院加拿大研究生奖学金（TG）；加拿大自然科学与工程研究理事会研究生奖学金（TG）；安大略省政府（TG, MA）；以及Guglietti研究员奖（TO）支持。HLA和CD1d单体由NIH四聚体核心实验室慷慨提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTAWisent Bioproducts325-043-CL
293GPG 细胞Ory et al.（参考文献 8）构建
琼脂Wisent Bioproducts800-010-CG
琼脂糖Wisent Bioproducts800-015-CG
氨苄青霉素钠盐Wisent Bioproducts400-110-IG
氯仿BioShopCCL402
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物New England BiolabsN0447L
DMEM，高糖，含丙酮酸Life Technologies11995065
EcoRINew England BiolabsR0101S
EZ-10 旋转柱 DNA 凝胶回收试剂盒BS353
胎牛血清Life Technologies12483020
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02
滤膜Corning4312200.45 mm 孔径 SFCA 膜
FITC 标记的抗人 CD271（NGFR）单克隆抗体Biolegend345104克隆号 ME20.4
FITC 标记的抗人 CD3 单克隆抗体Biolegend300440克隆号 UCHT1
庆大霉素Life Technologies15750078
Gibson 组装主混合液New England BiolabsE2611L用于多片段 DNA 组装
HLA-A2 五聚体Proimmune取决于抗原肽本实验所用 HLA-A2/MART1 多聚体购自 Proimmune
HLA/CD1d 单体NIH 四聚体核心设施根据 NIH 四聚体核心设施提供的方案将单体多聚化
人 AB 血清Valley BiomedicalHP1022
人 CD3 磁珠Miltenyi Biotec130-050-101
IOTest Beta Mark TCR Vβ 抗体库检测试剂盒Beckman CoulterIM3497
Jurkat 76 细胞Heemskerk et al.（参考文献 10）构建
LB 肉汤Wisent Bioproducts800-060-LG
LS MACS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
NEB 5-alpha 感受态 E. coliNew England BiolabsC2987I
NEBuffer 3.1New England BiolabsB7203S用于 EcoRI 和 NotI 消化
NotINew England BiolabsR0189S
NucleoBond Xtra Midi 试剂盒Macherey-Nagel740410用于质粒纯化
PC5 标记的抗人 CD8 单克隆抗体Beckman CoulterB21205克隆号 B9.11
PG13 细胞ATCCCRL-10686
Phusion HF 缓冲液套装New England BiolabsB0518S
Phusion 高保真 DNA 聚合酶New England BiolabsM0530L
pMX 逆转录病毒载体Cell BiolabsRTV-010
聚凝胺Sigma-AldrichH-9268
Proleukin（重组人白细胞介素-2）Novartis凭处方销售可从 Sigma-Aldrich 购买等效产品
纯化的抗人 CD3 抗体Biolegend317301克隆号 OKT3，用于 T 细胞刺激
RPMI 1640Life Technologies11875119
SA-PELife TechnologiesS866用于将 NIH 四聚体核心设施提供的单体多聚化
SMARTer RACE 5'/3'  试剂盒Clontech634858
无菌水Wisent Bioproducts809-115-LL
SuperScript III 第一链合成系统Invitrogen18080051用于 cDNA 合成
注射器BD30160410 ml，滑动接头
盐酸四环素Sigma-AldrichT7660
TransIT-293Mirus BioMIR 2700用于转染 293GPG 细胞
TRIzol 试剂Life Technologies15596026

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