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逆转录病毒感染辅助性T细胞作为一种研究调控其分化与功能机制的遗传学方法

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DOI：

10.3791/54698

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2016年11月4日

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1Department of Comparative Biomedical Sciences, The Royal Veterinary College, 2Institute of Physiology I, Cardiology & Vascular Medicine, Eberhard Karls University of Tuebingen, 3Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College

本文内容

摘要

为了理解调控T细胞发育及其在免疫应答中功能的机制，人们已采用多种实验系统。本文介绍一种使用逆转录病毒转导的遗传学方法，该方法经济、高效，且最重要的是，能够高度有效地识别调控通路。

摘要

辅助性T细胞的发育与功能必须受到严格调控，以诱导适当的免疫应答来清除特定病原体，同时防止自身免疫的发生。为了理解调控辅助性T细胞发育与功能的机制，已采用多种涉及不同模式生物的研究方法。然而，小鼠模型的研究被证明具有高度的信息价值，这得益于其在遗传学、细胞生物学和生物化学系统方面的可操作性。许多实验室在小鼠中使用的一种遗传学方法是逆转录病毒介导的原代辅助性T细胞转导。该方法操作相对简便，几乎任何具备分子生物学和免疫学基本技能的实验室均可开展，因此是一种强有力的手段。通过该方法，可快速检测野生型或突变型的多个基因在辅助性T细胞中的功能，从而阐明其重要性及作用机制。我们已对该方法进行了优化，本文详细描述了高滴度逆转录病毒的制备、原代小鼠辅助性T细胞的分离、逆转录病毒转导及其向不同辅助性T细胞亚群的分化过程。最后，本文还阐述了该方法在揭示微小RNA（miRNA）调控辅助性T细胞发育与功能相关通路机制中的应用。

引言

免疫反应必须受到高度调控，以清除感染，同时防止对自身组织的攻击，从而避免自身免疫的发生。辅助性T细胞在调节免疫反应中发挥着关键作用，研究人员已投入大量精力来深入理解其发育与功能（近期多篇综述对此进行了阐述） 1-3）。然而，仍有许多问题尚未解决，研究人员已采用多种方法来研究调控辅助性T细胞发育和功能的机制。这些方法包括从利用 体外 从细胞培养系统到整体动物模型。细胞培养系统，尤其是使用细胞系的系统，具有操作简便以及能够产生大量材料用于复杂生化分析的优点。然而，其局限性在于难以真实再现免疫应答中的实际条件。相比之下，整体动物实验具有更高的生理相关性优势，但也存在操作困难、难以实施精确对照的问题，且成本高昂并涉及伦理考量。尽管如此，目前绝大多数辅助性T细胞的研究仍需依赖包含原代T细胞的整体动物实验，因为细胞系无法复制整体动物中发生的精确生物学过程。因此，采用成本效益高且信息量丰富的研究方法至关重要。

遗传学是研究辅助性T细胞发育与功能的有力工具，然而涉及基因敲除或转基因的传统方法耗时较长且成本高昂，往往使小型实验室难以开展。相比之下，逆转录病毒转导提供了一种强大、快速且经济有效的遗传学手段，可用于研究特定基因产物的作用机制。因此，该方法在研究辅助性T细胞发育与功能的论文中被广泛采用。

我们优化了一种用于辅助性T细胞逆转录病毒转导的实验流程。该方法采用pMIG（小鼠干细胞病毒-内部核糖体进入位点-绿色荧光蛋白）逆转录病毒表达载体，目的基因可克隆至该载体中，并由逆转录病毒长末端重复序列（LTR）启动表达4。此外，在插入的目的基因下游含有一段内部核糖体进入序列（IRES），其后连接绿色荧光蛋白（GFP）基因，因此可通过GFP的表达情况方便地追踪转导后的细胞。该载体最初源自小鼠干细胞病毒（MSCV）载体，其LTR中含有阻遏蛋白结合位点的突变，使其不易被沉默，从而在包括辅助性T细胞在内的多种细胞类型中实现高效表达5,6。高滴度逆转录病毒的制备需要将MIG载体与一种表达逆转录病毒GAG、Pol和Env基因的辅助病毒载体共同瞬时转染人胚胎肾（HEK）293T细胞。其中，pCL-Eco辅助病毒载体7在产生高滴度、无复制能力的逆转录病毒方面效果良好。

本文描述了逆转录病毒的制备及其对原代小鼠T细胞转导的实验方案，并介绍了我们利用该方法研究miRNA调控基因表达从而控制辅助性T细胞分化的部分研究成果。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的小分子RNA，可通过靶向蛋白编码信使RNA中的同源序列，在转录后水平调控基因表达，抑制翻译并诱导mRNA降解8,9。miRNA在发育过程中的基因调控中发挥关键作用，在发育早期阶段尤为必需，无法产生miRNA的胚胎会在非常早期的阶段死亡10。此外，miRNA在多种组织后续发育过程中也具有重要作用，被认为通过精细调控发育程序所需基因的表达水平来实现其功能1。在辅助性T细胞中，miRNA具有多种功能，并且对调节性T细胞（Treg）的发育至关重要11-14。我们采用逆转录病毒介导的转导方法，以解析miRNA调控Treg细胞分化的分子机制15。通过此类研究，利用逆转录病毒介导的miRNA过表达，鉴定出若干关键的单个miRNA分子；随后进一步鉴定出这些miRNA所调控的相关靶基因，以阐明miRNA在辅助性T细胞分化过程中所调控的分子通路。

方案

本方案中所有涉及小鼠的操作均依据英国《动物科学程序法》及动物项目许可证 70/6965 进行。

1. 逆转录病毒的制备

在开始之前，请获得生产转基因生物及在哺乳动物细胞中使用逆转录病毒所需的全部批准。

  1. HEK 293T 细胞的培养
    1. 在 10 cm 组织培养皿中使用 HEK 293T 培养基（含 10% 胎牛血清（FBS）、100 单位/毫升青霉素、0.1 毫克/毫升链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM））培养 HEK 293T 细胞。常规传代时，当细胞达到汇合状态时，以 1:10 比例传代，弃去培养基，并用新鲜 HEK 293T 培养基吹打使细胞脱离培养皿。
      注：细胞通常在 2–3 天内达到汇合状态。293T HEK 细胞与培养皿结合较松，因此无需胰酶消化。
    2. 转染前 24 小时，将一盘汇合的细胞以 1:10 比例传代至一个 10 cm 培养皿（每项转染使用一个培养皿），使次日细胞汇合度约为 50%。
  2. 磷酸钙沉淀法转染
    1. 转染前约 1 小时，吸去细胞培养基，并小心加入 9 毫升新鲜 HEK 293T 培养基，以防止细胞从培养皿上脱落。
    2. 按 表 1 所述配制 2 倍浓度 HEPES 缓冲盐溶液（2x HBS）和新鲜的 2.5 M CaCl2 溶液。将 DNA 储存液解冻。为获得最高效的转染效果，应使用质粒纯化质量的 DNA。
    3. 在 6 毫升圆底管或 15 毫升锥形管中加入 5 µg 逆转录病毒 DNA（pMIG）4、5 µg 辅助病毒 DNA（pCL-Eco）7，再加入 H2O 至 420 µl。然后加入 80 µl 2.5 M CaCl2，使最终体积为 500 µl。
      注：此步骤及下一步（加入 2x HBS）可在普通实验台上操作，只要遵循基本的无菌操作技术即可。
    4. 在持续轻柔涡旋振荡的同时，逐滴缓慢加入 500 µl 2x HBS 至上述 DNA 混合物中，使溶液持续混合，并形成大小均匀的 CaPO4 沉淀晶体。
    5. 转移至组织培养超净台，将 CaPO4 DNA 混合物（1 ml）逐滴缓慢加入覆盖细胞的 9 ml 培养基中，同时持续轻柔旋转培养皿。操作时需注意避免细胞从培养皿上脱落。将细胞放回培养箱。
      注：此时在显微镜下可清晰观察到 CaPO4 沉淀，表现为大小类似细菌的小晶体。通常在 30–60 分钟后晶体沉降至培养皿底部，更易观察。
  3. 从培养上清中收集病毒
    1. 次日（转染后 12–24 小时内），吸去培养基，并用 10 ml 新鲜 HEK 293T 培养基换液，操作时仍需小心避免细胞脱落。
      注：此步骤可稀释 HEK 293T 细胞在转染过程中分泌到培养基中的淋巴细胞抑制物质。
    2. 第二天傍晚（约转染后 24 小时），用 3.5 ml 新鲜 HEK 293T 培养基换液。注意将培养皿在培养箱中放置水平，避免一侧干燥。
    3. 约 12 小时后收集培养基（置于 4 °C 保存），并再次加入 3.5 ml 新鲜 HEK 293T 培养基。此后每隔约 12 小时重复收集一次，共收集 3 次，总计收集约 10 ml 培养基。此即为病毒原液。
    4. 通过以 600 × g 离心 5 分钟去除残留的 HEK 293T 细胞及细胞碎片。也可选用 0.45 µm 低蛋白结合力的一次性注射式滤器过滤。病毒液储存于 4 °C，为获得最佳滴度，建议在 1–2 天内使用，因滴度在 4 °C 下会缓慢下降。切勿冷冻，否则将显著降低病毒滴度。

2. 初始CD4+ T细胞的分离

  1. 白细胞的分离
    1. 通过颈椎脱位法处死小鼠，CO2 窒息，或其他符合机构动物操作规范的人道方法。
    2. 解剖 freshly 安乐死的小鼠，取出脾脏和所需的淋巴结 15将器官置于含有 R10 培养基（RPMI 培养基，含 10% 热灭活 FBS、100 单位/毫升 青霉素、0.1 毫克/毫升 链霉素、2 毫摩尔 L-谷氨酰胺和 0.1% β-巯基乙醇）。对小鼠进行解剖及所有后续操作均需在细胞培养罩内进行，以最大限度降低培养物污染的风险。
      注意：保持 R10 培养基低温，并在 4 °C 下进行所有后续纯化步骤 °C.
    3. 放置一个70 µ将细胞筛置于含有约5 ml R10培养基的50 ml锥形管中。每只细胞筛可用于三只小鼠以内的脾脏和淋巴结组织。
    4. 将脾脏和淋巴结加入细胞筛中，使用5 ml注射器活塞末端进行研磨。用1-2 ml R10培养基冲洗。
    5. 将细胞转移至15 ml锥形管中，用R10补至14 ml体积，于4℃以600 × g离心5 min °C. 通过一次干净的倾倒动作弃去上清液，以防止扰动细胞沉淀。
    6. 加入 2 ml 冷（4 °C）红细胞裂解缓冲液（表1)加入各管中，轻轻混匀3.5分钟，期间保持试管置于冰上。
      注意：红细胞裂解的时间至关重要，以防止淋巴细胞死亡。因此，每批红细胞裂解缓冲液的精确作用时间需要进行优化。
    7. 添加 ≈12-13 ml R10 培养基。立即离心并弃上清液，操作同步骤 2.1.5。用 R10 培养基再洗涤两次，以彻底去除细胞中残留的红细胞裂解缓冲液，避免淋巴细胞死亡。
    8. 使用血细胞计数板，将细胞用台盼蓝按1:20稀释后计数，以确定活细胞产量。预计获得约8–10 × 10⁶个细胞。7 每只小鼠的细胞数。
  2. CD4+ T细胞的分离+ 使用磁珠试剂盒去除CD8的T细胞+CD11b+CD16/32+CD45R+，MHC II 类分子+ 和 Ter-119+ 细胞
    1. 分装 8-10 × 107 每15 ml锥形管分装步骤2.1.8的细胞，于4℃下以600 × g离心5分钟 °C. 用一次干净的操作倾去上清液，以防止扰动细胞沉淀。将每管中的细胞重悬于 100 µl 热灭活胎牛血清，然后加入 100 µ来自试剂盒的抗体混合物，4℃孵育30分钟 °在滚轴上轻轻混匀。
    2. 在上述细胞孵育的同时，准备磁珠。
      1. 通过涡旋振荡重悬小瓶中的珠子 >30 秒后，每 8–10 × 10⁶ 个细胞转移 1 ml 磁珠7 将制备好的细胞加入15 ml锥形管中。每毫升磁珠加入2 ml R10培养基，轻轻混匀。
      2. 将试管置于磁铁上1分钟，然后弃去上清液。从磁铁上取下试管，加入4 ml R10培养基重悬磁珠。此量的磁珠足以进行两轮孵育。
    3. 在抗体孵育结束时（步骤 2.2.1），每管加入 10 ml R10 培养基洗涤细胞。轻轻旋转混匀，于 4℃ 以 600 × g 离心 5 分钟 °C. 用一次干净的操作倾去上清液，以防止扰动细胞沉淀。用1 ml R10培养基重悬细胞。
    4. 加入 2 ml 步骤 2.2.2.2 中洗涤后的磁珠（½ 将每管所需的量加入各管经抗体处理的细胞中，4 °C孵育30分钟 °在滚轴上轻轻混匀。
    5. 用窄口吸头轻轻吹打细胞-磁珠混合物5次使其重悬，避免产生气泡。将离心管置于磁力架上2分钟，然后将含有阴性选择细胞的上清液转移至新离心管中。保留这些细胞，因其为CD4+ 群体。
    6. 再进行一次阴性筛选。将步骤 2.2.5 中的细胞在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟 °C. 如步骤 2.2.3 所述倒掉上清液，并用 1 ml R10 培养基重悬。重复执行步骤 2.2.4 和 2.2.5。在最后一次磁珠分选后，计数细胞以确定回收率（典型产量为 15–20 × 10⁶）。6 每 10 个细胞8 白细胞
  3. 初始CD4⁺ T细胞的分离+ T细胞（CD25）- 和 CD62L高) 使用细胞分离柱
    1. 离心 CD4+ T细胞在4℃下以600 × g离心5分钟° C，并重悬于150-200 µ每10毫升R10培养基8 细胞。加入2 µl 原液生物素标记的 CD25 单克隆抗体（克隆 7D4）。4℃ 孵育 30 分钟° C，轻轻混匀后置于摇床上。
    2. 用10 ml细胞分离柱缓冲液洗涤细胞（表1。在 4℃ 下以 600 × g 离心 5 分钟 °C. 尽可能吸除上清液，并估算残留的缓冲液/细胞体积。用缓冲液重悬细胞，终体积约为 90 µ每10升7 细胞
    3. 加入20 µ每10微升链霉亲和素磁珠7 细胞并轻轻弹击混匀。4℃孵育15分钟 °C.
    4. 细胞孵育的同时，准备用于手动操作的中型细胞分离（MS）柱。每个MS柱可保留107 细胞，且由于 CD25+ 细胞通常约占总CD4的10%+ 细胞，每10个使用1列8 CD4+ T 细胞。加入 500 µ将1毫升细胞分离柱缓冲液加入柱中，使其流过。重复此步骤2次。
    5. 细胞与磁珠孵育结束后，加入10 ml细胞分离柱缓冲液洗涤细胞，并于4℃下以600 × g离心5分钟 °C. 将细胞重悬于 500 µ每10个细胞分离柱缓冲液1升8 细胞，但仍使用 500 µ如果细胞数量较少。
    6. 加入500 µ将细胞/磁珠悬液加入柱中，收集穿流液。将穿流液再次过柱一次，并再次收集穿流液。用500 μL缓冲液冲洗柱子3次。 µl 细胞分离柱缓冲液，将每次冲洗的流穿液加入收集的细胞中。这些是 CD25- 细胞。计数细胞以确定产量。
    7. 如果Tregs（CD25+ 若需要细胞，则按如下方法进行分离。
      1. 将柱子从分离器上取下，悬于一个打开的通用管上方，注意保持无菌。迅速用移液器加入500 µ将1毫升细胞分离缓冲液加到柱上，并使用随柱提供的推杆彻底冲洗出阳性组分。
      2. 再重复冲洗步骤两次。将阳性组分过一个新的MS细胞分离柱，弃去流穿液。同前，用缓冲液彻底冲洗阳性细胞三次，随后在4℃下以600 × g离心5分钟。° C. 用1 ml R10培养基重悬细胞，计数以确定产量。
    8. 获得 CD25- CD62L高 T 细胞，离心 CD25- 在步骤 2.3.6 中，于 4 °C 以 600 × g 离心 5 分钟分离 T 细胞° 并重悬于150-200 µ每10毫升R10培养基7 细胞。加入5 µl 原液生物素标记的 CD62L 单克隆抗体（克隆 MEL-14），4 ℃孵育 30 分钟° C，以前述方式在滚轴上轻轻混匀。
    9. 按照Treg分离方案（2.3.7）中所述进行洗涤、链霉亲和素磁珠结合及细胞分离柱准备。此次使用容量为10的大型细胞分离（LS）柱8 细胞
      1. 由于CD62L高 T细胞通常占CD25的约60-70%- 细胞，每10⁷个细胞使用1个LS细胞分离柱8 细胞。将细胞/磁珠混合物按步骤2.3.6所述加至LS细胞分离柱中——此次弃去最后的穿流液和柱冲洗液。收集CD62L高 如步骤 2.3.7 中所述的 T 细胞用于 CD25+ 细胞收集
      2. 在 4℃ 下以 600 × g 离心 5 分钟° C. 用1 ml R10重悬细胞，计数以确定产量。调整细胞浓度至0.75–1 × 10⁶ cells/ml。6 每毫升 R10 培养基中的细胞数
  4. 通过荧光激活细胞分选（FACS）分析细胞纯度。
    1. FACS 染色策略
      1. 对于分离前后的所有阶段细胞，使用 CD4-FITC、CD8a-PerCP-Cy5.5（辅助性和细胞毒性 T 细胞）和 MHCII-PE（表达 MHC II 类分子的细胞）进行染色。
      2. 对于CD25分离前后的细胞，使用CD4-FITC和CD25-PE进行染色（以区分调节性T细胞与其他辅助性T细胞）。
      3. 对于CD62L分离前后细胞，使用CD4-FITC、CD62L-PE和CD44-APC进行染色（以区分初始型、记忆型和效应型辅助性T细胞）。
    2. 每次分析时放置 105 将细胞置于96孔U型底板的一个孔中，在4℃下以600 × g离心5分钟 °C. 吸去培养基，用 200 µl DPBS。按上述方法离心并弃去DPBS。
    3. 加入50 µ毫升 DPBS 每孔和 0.5 µ每种抗体各加 l（如 2.4.1 中所示），在室温下避光孵育 30 分钟，以避免荧光标记物褪色。
    4. 用DPBS洗涤细胞2次（同2.4.2步骤），然后立即根据所用仪器的特定操作流程和指南，通过流式细胞仪进行分析。
      注意：在一次优质制备的最终分离步骤后，90–95% 的细胞将为 CD4+ CD25- CD62L高 T细胞

3. 活化CD4+ T细胞的逆转录病毒转导及其向特定辅助T细胞亚群的分化

  1. 逆转录病毒转导
    注意：逆转录病毒对基因的整合与表达需要细胞分裂，因此T细胞必须激活过夜（O/N）。
    1. 在分离初始T细胞的同时，用抗CD3和抗CD28抗体（溶于DPBS中）包被24孔组织培养板。加入250 µ每孔1升。使用抗-CD3抗体，浓度为1µg/ml。使用抗CD28，浓度为2 µg/ml，若细胞最终将在Th0、Th1、Th2和iTreg条件下分化。使用抗CD28抗体，浓度为10 µg/ml，用于Th9和Th17诱导条件。在37℃孵育约2小时 °在组织培养孵育箱中于37°C、5% CO₂条件下培养。
    2. 细胞培养前，立即移除抗体溶液，并用约250 μL PBS洗涤培养板。 µ每孔加入 DPBS 1 ml 以去除未结合的抗体。注意避免板孔干燥，因此每次处理最多不超过 6 孔。吸除 DPBS 洗液后，每孔加入 1 ml 初始 CD4+ R10 培养基中的 T 细胞浓度为 0.75–1 × 106 每毫升细胞数。激活细胞过夜（14–16 小时）。
    3. 次日，将培养板中的细胞在30℃下以900 × g离心5分钟° C，使细胞贴附于孔板底部。
    4. 收集并保存培养基，注意不要扰动细胞，然后加入1 ml由病毒生产方案制备的病毒培养上清液。细胞不可干燥，因此每次处理不超过4个孔。
      1. 向每个孔中加入 1 µ8 mg/ml 多聚素溶液 1 μl 和 10 µ1 M HEPES（pH 7.5）以促进病毒摄取，并防止在环境 CO₂ 条件下发生显著碱化2 在接下来的离心过程中，将培养板中的细胞于30℃以900 × g离心90分钟° C.
  2. 细胞向特定亚群的分化
    1. 小心移除病毒培养上清，替换为步骤 3.1.4 中收集的 1 ml 培养基，因其含有 IL-2 及其他 T 细胞生长因子。加入表 2 所示试剂，将细胞培养 3–4 天，以诱导细胞分化为特定亚群。
  3. 细胞分析
    1. 对于细胞内细胞因子染色，用1 µ每毫升加入佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）和离子霉素各1 g，刺激4小时。在刺激的最后2小时，加入1 µg/ml 的布雷菲德菌素A。
    2. 用移液器反复吹打数次，重悬各孔底部的细胞。转移约105 细胞至96孔U型底板（通常为100 µ从1 ml Th细胞培养物中取样用于固定和染色。
    3. 对于GFP染色，用100 µ在室温下用 2% 多聚甲醛固定 5 分钟，固定时间过长会导致 GFP 荧光淬灭并干扰 Foxp3 染色。通过加入 100 μL 洗涤液洗涤细胞 µDPBS 1 l 加入每个孔中，于 22℃ 下以 600 x g 离心 °4°C 离心 5 分钟。弃去上清液。
      注意：多聚甲醛具有毒性，需在通风橱中操作，并做好皮肤和眼睛防护。
    4. 再次使用 100 µl 由Foxp3染色试剂盒配制的1×固定缓冲液（1份固定缓冲液加3份稀释液）。将细胞在室温下孵育45分钟，或 alternatively 在4℃孵育 °C孵育16小时。
    5. 固定后，通过加入100 μL破膜液对细胞进行破膜处理。 µ来自同一试剂盒的1微升破膜缓冲液。室温孵育30–45分钟，然后在22℃下以600 × g离心 °5 分钟
    6. 进行抗体染色时，去除固定/透化缓冲液，并加入 50 µ新鲜破膜缓冲液1升。将所需抗体用破膜缓冲液按1:2比例稀释后加入 µ升每50 µ每样品加入 l 缓冲液，室温避光孵育 30–45 分钟，以避免荧光标记物漂白。
    7. 加入150 µl 破膜缓冲液，22℃下以600 × g离心 °C，5 分钟。弃去破膜缓冲液，加入 200 µl DPBS。使用流式细胞仪，并根据所用仪器的特定操作规程和指南进行分析。
      注意：务必设置细胞因子染色的适当对照，例如使用同型对照抗体进行染色，以及分析未活化或Th0活化状态的细胞， 等等。

结果

该实验体系的成功依赖于高纯度的T细胞群体以及高滴度的逆转录病毒制备物。此处展示的代表性结果为成功实验的示例。图1显示了在初始辅助T细胞分离流程的各个阶段，分选前和分选后细胞群体的典型纯度。图2和图3展示了通过转染的HEK 293T细胞（图2）以及转导的T细胞（图3）中GFP的表达来分析逆转录病毒产生的结果。HEK 293T细胞的转染效率会因不同的逆转录病毒载体而有显著差异，但这通常与GFP+ T细胞数量所反映的逆转录病毒产量水平无直接相关性。此外，GFP+ T细胞的数量可能因极化条件的不同而变化。同时，GFP及插入基因的平均表达水平也可能受到整合病毒拷贝数、整合位点对转录的影响以及影响病毒转录本的转录后调控机制的影响。

最后，图4展示了我们在过表达miRNA miR-15b/16时观察到的一些典型的辅助性T细胞分化结果。这些结果表明，在单次实验中可能会出现一定的变异性，因此必须通过多次独立重复实验（使用不同制备的辅助性T细胞）进行统计学分析，以确证真实效应。在本实验中，由于所使用的C57BL/6小鼠品系倾向于产生Th1型反应，因此Th2反应较难观察到。同样，IL-9染色信号也难以在背景之上被明确检测。因此，必须进行同型对照实验，并设置适当的补偿，以确保细胞因子表达的门控分析准确无误。我们的研究结果表明，miR-15b/16通过抑制mTOR信号通路中的组分Rictor和mTOR的表达，从而增强iTreg细胞的诱导分化15。在个别实验中，miR-15b/16有时可能影响Th0、Th1和Th17的分化，但在多次重复实验中并未发现显著效应。相比之下，miR-15b/16的过表达能显著抑制Th9细胞的分化（参见参考文献18）。

免疫细胞分析中CD4、CD25、CD62L筛选的流式细胞术图谱；数据可视化
图1. 辅助性T细胞在分离各阶段的典型纯度。 代表性流式细胞术结果显示了在前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图中圈定的活细胞门内指定抗原的表达情况。A) CD4阳性前与阳性后的阴性筛选。图示CD4、CD8a和MHCII的表达谱，显示辅助性T细胞得到富集，而细胞毒性T细胞及表达MHC II类分子的细胞被去除。一次良好的纯化应获得约90%的CD4+ 此阶段的T细胞。BCD25 筛选。左侧为 CD4、CD8a 和 MHCII 的表达谱，右侧为筛选前后 CD4 和 CD25 的表达谱。此时 >95%的CD25阴性筛选细胞应为CD4阳性+ CD25-. (CCD62L 筛选。左侧显示 CD4、CD8a 和 MHCII 的表达谱。右侧显示筛选前和筛选后细胞中 CD62L 和 CD44 的表达谱，以及筛选后细胞中 CD4 和 CD62L 的表达谱。经过 CD62L 筛选后，几乎所有记忆细胞（CD44）+) 被去除，留下高度富集的初始辅助性T细胞群体，其中含有10-15%的效应细胞（CD62L低）。所有FACS图谱中，特定参数的设置和比例尺均保持一致。数值表示门控细胞群中细胞所占的百分比。初始筛选后细胞尺寸的轻微减小可能是由于实验操作过程中机械应力所致。 请点击此处以查看此图的放大版本。

流式细胞术分析；散点图；293T细胞中的GFP表达；转染效率。
图2. 逆转录病毒转染的HEK 293T细胞分析。 图中显示了未转染或转染后的HEK 293T细胞在收集病毒培养上清后进行的GFP表达分析。第一张图中，基于FSC和SSC图的门控区域对活细胞进行GFP分析。数值表示门控区域内GFP+细胞的百分比。典型的转染效率范围为30-90%。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术结果、GFP表达、pMIG-miR-15b/16、T细胞分化、散点图
图3. 逆转录病毒转导的辅助性T细胞分析。 将逆转录病毒转导的辅助性T细胞在Th0、Th1、Th2、Th9、Th17和Treg极化条件下培养三天后，检测GFP表达。分析时根据FSC/SSC图中所示的活细胞和活化细胞进行设门。转导效率因质粒构建体和极化条件不同而有所差异，通常在10%-75%之间。同样，GFP表达的平均荧光强度也可能存在差异。请点击此处查看该图的放大版本。

免疫细胞分化流式细胞术结果；IL-4、IFNγ、Foxp3 标记物；六个图谱。
图 4. 在不同极化条件下 miR-15b/16 过表达对辅助性 T 细胞分化的影响。 图中显示的是来自图 3中GFP+细胞群体的代表性细胞因子谱型。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液制备方案，包含用于实验室实验的 NaCl、KCl、Na2HPO4、CaCl2、NH4Cl 配方。
表 1： 本实验方案中使用的缓冲液。 请点击此处下载本表的 Excel 电子表格。

辅助性T细胞极化条件
Th0抗IL-45 µg/ml
抗IFN-γ5 µg/ml
Th1重组IL-1220 ng/ml
抗IL-45 µg/ml
Th2重组IL-440 ng/ml
抗IFN-γ5 µg/ml
Th9重组TGF-β2.5 ng/ml
重组IL-440 ng/ml
抗IFN-γ10 µg/ml
Th17重组TGF-β2.5 ng/ml
重组IL-650 ng/ml
抗IFN-γ5 µg/ml
抗IL-45 µg/ml
抗IL-25 µg/ml
Tregs重组TGF-β2.5 ng/ml
重组IL-25 ng/ml

表2：辅助性T细胞亚群极化条件。

讨论

逆转录病毒介导的基因过表达是分析辅助性T细胞功能的一种有力方法，因为辅助性T细胞的发育和功能通常由关键调控因子的表达水平决定。然而，由于外源基因的表达水平显著高于内源基因时可能引入多种人为假象，因此对实验结果的解释需谨慎。为此，该技术应与其他方法结合使用，以验证所观察功能的相关性。例如，在条件允许的情况下，应通过siRNA或基因敲除实现基因表达下调，以补充过表达实验的结果。对于miRNA的研究，我们采用表达人工miRNA靶位点的病毒作为竞争性抑制剂来阻断miRNA功能，从而与过表达实验相互印证。 15逆转录病毒转导的细胞也可用于涉及RNA和蛋白质分析的生化实验。然而，这类实验的一个主要局限在于转导效率，导致细胞群体中存在转导与未转导细胞的混合。因此，这些实验极可能需要对GFP进行分选+ 群体。最后， 体外 分化实验应与 体内 实验，而实现这一目标的方法之一是将转导的T细胞过继转移至小鼠体内，进而追踪其分化情况及其对免疫应答的影响。

该系统的一个关键限制因素是可被包装进逆转录病毒衣壳的RNA基因组大小。根据我们的经验，MIG逆转录病毒系统在获得良好病毒产量时，最大插入片段大小为3-3.5 kb。因此，更大的基因无法通过该系统进行分析，因为其产生的病毒滴度很低。然而，大多数基因的大小均小于该范围，因此该系统适用于多种多样的基因研究。

在逆转录病毒转导过程中，这些方案中存在多种可选方法。许多研究人员使用了稳定表达逆转录病毒基因的包装细胞系（例如参考文献16）。然而，我们通过共转染pCL-Eco辅助病毒载体至标准的HEK 293T细胞，获得了最高的病毒滴度。初始辅助性T细胞的分离也可通过细胞分选而非磁珠与细胞分离柱的方法实现，但该方法需要使用细胞分选仪，且分选时间的成本通常高于磁珠试剂。最后，在诱导辅助性T细胞分化为不同亚群时，激活条件也存在多种变化。例如，在暴露于诱导调节性T细胞（Treg）的条件之前，若对细胞进行过长时间的TCR刺激，则可能抑制其诱导效果16。这可能带来问题，因为逆转录病毒的表达依赖于细胞刺激所诱导的细胞分裂。尽管如此，我们在逆转录病毒转导前采用过夜（O/N）激活的条件下，仍在此方案中实现了高效的Treg诱导。

在这些实验方案中，成功应用需要考虑多个因素。高效的逆转录病毒制备依赖于对 HEK 293T 细胞的高效转染，因此高质量的 DNA 和精确配制的 2x HBS 至关重要。此外，转染时 HEK 293T 细胞的密度应约为 50%，因为转染 DNA 的良好表达要求细胞处于活跃生长状态，而细胞密度过低或过高都会抑制这一过程。在转染时处于最佳密度的细胞，应在病毒收集过程中某个时间点达到汇合状态，但它们将持续产生高滴度的病毒，直至最后一次收集。辅助性 T 细胞的有效分化依赖于良好的细胞质量，因此需确保分离得到的细胞纯度达到图 1所示的标准。同样，细胞质量也取决于其来源小鼠。在本研究中，我们使用的是 6 至 8 周龄的 C57BL/6 小鼠。较年长的小鼠可能含有较少的初始 T 细胞，而不同品系在分化能力上也可能存在差异。例如，与 C57BL/6 小鼠相比，BALB/c 小鼠更倾向于产生 Th2 型免疫反应17，因此如上所述，C57BL/6 T 细胞较难诱导出 Th2 反应。此外，不同实验室之间的各种分化条件可能存在细微差异，而基因过表达的效果可能仅在次优条件下才显现出来，因此在不同极化条件下可能需要对细胞因子浓度进行滴定优化。最后，过表达基因或极化条件对细胞增殖的影响可能会影响转导效率，因此在研究目的基因的作用时，可能需要优化极化试剂的使用时机和浓度。全面优化上述各项因素，将有助于在此系统中获得具有科学意义的结果。

披露

作者在发表本作品方面无任何利益冲突。

致谢

本工作得到了生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）基金（BB/H018573/1）和BD生物科学基金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMISigmaR8758
DMEMSigmaD5671
青霉素-链霉素溶液SigmaP4333
L-谷氨酰胺SigmaG7513
β-巯基乙醇SigmaM3148
DPBSSigmaD8537
MIG 载体Addgene质粒 9094
pCL-Eco 载体Addgene质粒 12371
细胞筛BD Falcon352350
小鼠 CD4 细胞磁珠试剂盒 Invitrogen (Dynabeads)11415D
链霉亲和素磁珠 Miltenyi Biotech130-048-102
MS 细胞分离柱Miltenyi Biotech130-042-201
LS 细胞分离柱Miltenyi Biotech130-042-401
CD25 生物素化单克隆抗体 BD Biosciences85059克隆号 7D4
CD62L 生物素化单克隆抗体 BD Biosciences553149克隆号 MEL-14
聚凝胺（六亚甲基溴化铵）Sigma107689
抗 CD3 抗体eBiosciences16-0031-85克隆号 145-2C11 
抗 CD28 抗体eBiosciences16-0281-85克隆号 37.51 
抗 IL-4 抗体BD Biosciences559062克隆号 11B11
抗 IFN-γ 抗体BD Biosciences559065克隆号 XMG1.2
抗 IL-2 抗体BD Biosciences554425克隆号 JES6-5H4
重组 IL-12 p70eBiosciences14-8121
重组 IL-4BD Biosciences550067
重组 TGF-βeBiosciences14-8342-62
重组 IL-6eBiosciences14-8061
重组 IL-2eBiosciences14-8021
PMA SigmaP8139
离子霉素SigmaI0634
布雷菲德菌素 AeBiosciences00-4506
多聚甲醛Sigma16005多聚甲醛具有毒性，操作时应采取适当防护措施 
Foxp3 染色缓冲液套装eBiosciences00-5523
抗 CD4  FITCeBiosciences11-0041克隆号 GK1.5 
抗 CD8a perCP-cy5.5eBiosciences45-0081-80克隆号 53-6.7 
抗 MHCII PEeBiosciences12-0920 克隆号 HIS19
抗 CD25 PEeBiosciences12-0251-82 克隆号 PC61.5 
抗 CD62L PEeBiosciences12-0621-82克隆号 MEL-14 
抗 CD44 APCeBiosciences17-0441克隆号 IM7 
抗 IFN-γ FITC eBiosciences11-7311-81克隆号 XMG1.2
抗 IL-4 PEBD Biosciences554435克隆号 11B11
抗 IL-9 PE 或 APCeBiosciences/Biolegend50-8091-82/514104克隆号 RM9A4
抗 IL-17a PEBD Biosciences559502克隆号 TC11-18H10
抗 Foxp3  APC 或 PEeBiosciences17-5773-82/12-5773-80 克隆号 FJK-16s
NaClSigmaS7653
KClSigmaP9333
Na2HPO4·2H2OSigma71643
葡萄糖SigmaG7021
HEPES，游离酸SigmaH3375
NH4ClSigmaA9434
乙二胺四乙酸二钠SigmaD2900000
KHCO3Sigma237205
 CaCl2 SigmaC5670

参考文献

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