溶解性有机质为溪流生态系统提供了重要的能量和营养来源。本文展示了一种基于野外的方法，用于调控环境中的溶解性有机质库 原位 通过易于复制的营养脉冲。
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摘要
摘要
溶解性有机质（DOM）是一类高度多样化的分子混合物，为溪流生态系统提供了最大的能量和营养来源之一。然而 原位 由于DOM库的分子复杂性难以在实验条件下轻易重现，因此对DOM的研究较为困难。然而，向溪流中添加营养物质已被反复证明会改变DOM的组成和特性 原位 以及环境中的溶解性有机质（DOM）库。本文展示了一种易于重复的、基于野外的生态系统尺度方法，用于调控环境中的DOM库。在营养脉冲实验中，可检测溶解性有机碳和溶解性有机氮浓度在较宽营养浓度范围内的变化。该方法使研究人员能够探究对DOM库的调控机制，并推断DOM库中特定组分在生态系统中的作用与功能。我们建议采用该方法作为深入理解DOM生物地球化学过程及其与营养物质相互作用的技术手段。随着进一步发展，该方法有望阐明DOM在其他生态系统中的动态变化规律。
引言
溶解性有机质（DOM）是淡水生态系统重要的能量和营养来源，定义为能够通过0.7 µm滤膜的有机物质。在水生生态系统中，DOM还可能影响光的衰减以及金属的络合作用。DOM是由多种具有不同官能团的有机化合物组成的高度多样且异质的混合物，同时也含有氮（N）和磷（P）等必需营养元素。尽管该术语 "DOM" 描述了包括其碳、氮和磷组分在内的整个溶解有机物库，其浓度以溶解有机碳（DOC）来测定。然而，溶解有机物库固有的分子复杂性为其研究带来了挑战。例如，目前尚无直接方法可测量溶解性有机氮（DON）和溶解性有机磷（DOP）等有机营养物在总溶解有机物库中所占的比例。因此，有机营养物的浓度必须通过差减法来确定例如 [DON] = [总溶解氮] - [溶解性无机氮]
向溪流中添加一种真实的溶解性有机质（DOM）改良剂十分困难，这是由于环境DOM库具有高度多样性。以往的研究通常添加单一碳源（例如 葡萄糖，尿素1) 或特定来源（如凋落物浸出液）2 以调控野外环境中的浓度。然而，这些来源并不能很好地代表环境中的溶解性有机质（DOM）组分。尝试对环境DOM进行纯化或浓缩以用于后续实验也存在诸多困难，包括某些组分的损失（例如 在处理过程中，这些高度不稳定的组分容易发生变化。因此，目前我们尚无直接调控环境溶解性有机质（DOM）库的方法，导致难以理解环境DOM库的调控机制。然而，由于DOM的生物地球化学过程与环境中常见的营养物质相关联（例如 硝酸盐 [NO3-]3），我们可以向溪流生态系统中添加其他溶质，并测量溶解性有机质（DOM）库对这些操作的响应。通过考察DOM库在一系列实验设定的养分浓度下的响应，我们希望更深入地了解DOM如何响应变化的环境条件。
一种在河流生物地球化学研究中常用的方法是营养盐添加法。传统上，营养盐添加实验被用于理解营养物质的吸收动力学或所添加溶质的归趋4,5,6,7营养添加可以是短期的，以小时计6 天尺度4或持续数年的长期干预8营养添加物还可包括同位素标记的营养物质（例如 15N-NO3-）以追踪添加的营养物质在生物地球化学反应中的去向。然而，基于同位素的研究通常成本较高，且需要复杂的分析过程（例如 消化）多个底栖组分，以回收同位素标记的养分。近期实验表明，短期养分脉冲可用于阐明非添加性和环境溶质（如DOM）的调控机制9,10，揭示了一种实时检测的新方法 原位 生物地球化学反应。本文描述并演示了进行短期营养脉冲实验的关键方法步骤，旨在理解碳（C）和氮（N）的耦合生物地球化学过程，特别是调控高度多样化的溶解性有机物（DOM）库的因素。该方法易于重复，包括向实验溪流河段添加营养脉冲，并测量被操纵溶质以及目标响应变量浓度的变化（例如 DOC、DON、DOP）。通过直接调控营养物浓度 原位 我们能够间接改变DOM库，并检测DOM浓度在一系列动态变化的营养物质浓度下的变化情况10.
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方案
1. 确定并表征理想的实验溪流河段
- 确保实验河段足够长，以促进溶质的完全混合11，并保证有足够的长度使生物吸收能够发生。河段长度可根据不同溪流和实验条件而变化。在小型一级源头溪流中，河段长度可能在20–150 m之间（或根据系统需求更长），具体取决于流量及其他物理特性。
- 应将大型深潭排除在实验河段之外，因其会延缓溶质向下游的运移；同时避开流量极小的区域以及会稀释所添加溶液的支流。在低流量时期，可能需要缩短河段长度；而在高流量时期，则可能需要更长的河段。
- 在实验河段上游、急流上方选择一个合适位置，以便所添加的溶质充分混合，该位置将作为添加点。在实验河段下游末端，选择一个水流受限且能代表约90%总流量的位置（图1），该位置将作为样品采集点。
图1：下游采样点示例。 理想的采样点应位于水流主要被收窄且易于接近的位置，同时不会对溪道和底栖环境造成干扰。在此处，一段倒下的木质残骸在一条小型一级源头溪流中形成了该采样点。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 在实验前获取河流的流量测量值以及目标溶质的背景营养物浓度，以计算操作处理所需溶质的质量。具体计算方法见步骤 2.2.1。
- 获取目标溶质操控的背景浓度数据例如 一氧化氮3-) 和氯离子（Cl-）通常用作保守性示踪剂。在本实验中，利用保守性示踪剂监测电导率的变化，以指示营养脉冲到达采样点的时间及其通过的速率。电导率（或称比电导）是作为替代指标的 原位 保守性示踪剂浓度的变化
- 通过收集河段宽度和深度、温度、pH值以及溶解氧等辅助数据，表征实验河段的理化性质。
- 进行无法通过环境探针完成的测量例如 宽度和深度），在实验前一天或实验结束后立即进行，以尽量减少对河道内底栖环境或化学性质的干扰。将实验河段划分为等距的横断面（例如 每10米）进行宽度及至少3个深度测量的评估（例如 右岸、主流线和左岸）。这些数据对于将河流的物理特性与生物地球化学测量结果相联系具有重要价值，且当研究人员希望计算营养物质吸收动力学参数时尤为有用6.
2. 实验准备
- 使用下方列出的公式确定操作所需的溶质质量（kg）。
注意：以下示例适用于以硝酸钠（NaNO3）形式提供 NO3- 的硝酸盐实验，假设目标浓度为背景浓度的 3 倍（公式基于 Kilpatrick 和 Cobb12 的方法）。本示例中对背景条件作出如下假设：流量 = 10 L/sec；[Cl] = 10 mg/L；[NO3-] = 50 µg N/L。由于不同实验之间存在差异，请根据实际情况调整所需输入数据。- 计算目标增加量（公式 1）：
目标 [NO3- µg N/L] 增加量 = 预期背景 [NO3- µg N/L] × 目标增加倍数
150 µg N/L = 50 µg N/L × 3 - 计算总原子质量通量（公式 2）：
总原子质量通量（NO3- µg N）= 30 min × 60 sec × Q(L/sec) × 目标 [NO3- µg N/L] 增加量
其中 30 分钟为假设的溶质峰值持续时间12，Q 为流量
2 700 000 µg N = 30 min × 60 sec × 10 L/s × 150 µg N/L - 计算总分子质量通量（公式 3）：
总分子质量通量（NO3- µg N）= 总原子质量通量（NO3- µg N）/ 原子质量（14）× 分子量（85）
其中原子质量指 N，分子量指 NaNO3。
16,392,857.14 µg N = 2,700,000 µg N / 14 × 85 - 计算需添加的质量（公式 4）：
需添加的质量（g）= 总分子质量通量（NO3- µg N）/ 1,000,000 g/µg
16.39 g NaNO3 = 16,392,857.14 µg N / 1,000,000 g/µg
注意：对其他任何溶质（包括保守性示踪剂，例如 氯化钠）均应按照上述计算方法进行计算。务必根据目标溶质调整相应的原子质量和分子量。
- 计算目标增加量（公式 1）：
- 在野外实验前一天准备好所有溶质。称取足量的溶质，使生物示踪剂和保守性示踪剂的环境浓度均提高至背景浓度的三倍（或所需倍数）。所添加的溶质量必须足以引起可测量的浓度变化，且应提供足够宽的营养物质添加浓度动态范围。
- 使用分析天平称量溶质，随后将其储存于洁净、经酸洗的高密度聚乙烯瓶中，并贴上适当标签。生物示踪剂示例包括：NO3-：硝酸钠（NaNO3）；NH4+：氯化铵（NH4Cl）；PO4-3：磷酸氢二钾（K2HPO4）。然而，生物示踪剂的选择取决于所研究的生物地球化学问题。保守性示踪剂可选氯化钠（NaCl）或溴化钠（NaBr）。
- 准备其余材料：野外记录本、标签胶带和笔、野外卷尺、保温箱、电导率仪、约 20 L 的桶以及大型搅拌棒（例如 啤酒桨、钢筋或粗木棍），以及大约 50 个洁净且经酸洗的 125 ml 高密度聚乙烯瓶。将 125 ml 瓶编号为 #1–50。
注意：每次实验采集的样品数可少于 50 个，背景样品也包含在这 50 个瓶子总数中。 - 可选步骤：根据野外工作人员数量，可在现场进行样品过滤（见第 5 节）。若选择此方案，需携带 50 个洁净、预先标记并经酸洗的 60 ml 高密度聚乙烯瓶进入野外。将 60 ml 瓶编号为 #1–50，与 125 ml 采样瓶一一对应。
3. 实验设置当天
- 在采样现场部署现场电导率仪。将仪器放置在采样点上游约0.5–1.0 m处，以避免样品采集干扰仪器读数。实验全程保持仪器位置不变。建议使用现场电导率仪，因其可提供实时电导率读数，用于确定采样速率（见步骤5.2）、过滤顺序（步骤5.3）及分析顺序（步骤6.1）。
- 在溶液添加前，于添加点和实验河段采样点分别采集125 ml背景样品，每处设三个重复。这些数据将用于验证当天的环境浓度，并确定溶质浓度在河段内的空间变化。这些数据还有助于关联环境河流化学特征（例如. DOC：否3- 比率13) 与感兴趣的生物地球化学测量指标。
- 记录所采集空白样品的时间和电导率。
- 记录添加溶液前溪流的背景电导率。
4. 添加溶质
- 将所有试剂（16.39 g NaNO3 和 1483 g NaCl）倒入一个大容器中（例如 20 L 桶），并加入足够的溪水以完全溶解溶质。用额外的溪水冲洗试剂容器三次，并将冲洗液倒入溶液容器中。记录所加水的总量。
- 例如，使用 500 ml 的瓶子将溪水倒入容器中。搅拌溶液直至所有试剂完全溶解。
- 取 60 ml 该添加溶液作为分样。将此高浓度样品与其他所有样品分开保存（例如 密封袋），以尽量减少交叉污染。如果研究项目还旨在计算养分吸收动力学6，此类样品尤为重要，因其可用于确定所添加溶质的精确质量。
- 将溶液倒入添加点。应以平稳且快速的方式倾倒溶液，以尽量减少传输延迟时间以及可能减少试剂添加量的飞溅。添加完成后，立即在溪流中将容器和搅拌棒冲洗三次，以确保所有试剂均已加入溪流中。
- 记录溶液添加的时间：时:分:秒。
- 记录所添加示踪剂的质量（例如 NaNO3 和 NaCl）。
- 溶液添加后，不得扰动溪流。确保沿溪流的所有移动均在河岸上进行，以避免对溪流底栖环境及溶液本身造成干扰。
5. 野外采样
- 在等待溶液到达采样地点期间，按顺序准备采样瓶。迁移时间将取决于流量和河段长度，可提前一天通过仅注入氯化钠（NaCl）或罗丹明染料来确定（后者可用于确定迁移时间14）。
注意：若正在进行与溶解性有机氮（DON）相关的研究项目，应避免使用罗丹明染料，因其属于一种DON，若在研究河段中残留，将改变环境中的DON本底水平。
图 2：溶质穿透曲线（BTC）示意图示例。 BTC 表示溶质浓度随时间的变化，可用于解释示踪剂在溪流中的迁移过程及生物地球化学循环。应在整个 BTC 过程中采集抓取样，采样频率应确保对 BTC 的上升段和下降段均有同等代表性。请点击此处查看该图的放大版本。
- 样本采集
注意：样品采集的总体目标是充分代表穿透曲线（BTC）上升段和下降段中溶质浓度的变化。图2).- 当溶液到达时（通过电导率升高检测），在整个突破曲线（BTC）过程中，将125 ml样品瓶置于采样点的主流水流中收集样品。迅速用溪水冲洗样品瓶，将冲洗液弃于下游，然后采集样品。盖紧样品瓶并放入冷藏箱中。
- 记录沿BTC采集的每个样品的时间（时:分:秒）和电导率至野外记录本中（表1).
- 根据时间采集样本（例如 根据电导率变化的速率，以1分钟为间隔，或调整取样频率。例如，当电导率变化较快时，每30-60秒取样一次，直至电导率变化减缓，此时可调整为每5-10分钟取样一次。若依据电导率数值变化设定取样间隔，则应根据电导率变化速率，每变化15-30个单位取样一次。
- 样品采集直至电导率恢复至背景值或其范围内 5 µS/cm 背景条件的采样间隔可根据实验情况进行调整，只要抓取样品能够充分代表突破曲线（BTC）即可。
| 瓶子编号 | 电导率 | 时间 | 备注 |
| 1 | 小时:分钟:秒 | 例如：背景值（下游） | |
| 2 | 例如：背景值（下游） | ||
| 3 | |||
| 4 | |||
| 5 | 例如：电导率峰值时的样品 | ||
| . | |||
| . | |||
| . | |||
| 最高瓶子编号 |
表1P 实验记录本：实验记录本中的示例页面及所需信息
- 样品过滤
注意：样品过滤可在野外或返回实验室后进行。- 按照比电导率升序，依次过滤上升支的样品，直至达到比电导率峰值。等待实验结束后，再按照比电导率升序过滤下降支的样品（即从最后一个样品开始，逆向操作至比电导率峰值处）。
注意：此样品顺序可最大限度减少样品间的交叉污染，并允许使用同一滤膜、注射器和滤器，前提是每次过滤样品之间对滤膜、注射器和滤器进行适当冲洗（见步骤 5.3.2–5.3.4）。 - 从 60 ml 注射器中取出活塞，关闭旋塞。将约 10 ml 样品倒入注射器中，重新插入活塞。摇动注射器，使样品冲洗注射器内壁。将注射器连接至滤器，打开旋塞，推动样品通过滤器，弃去冲洗液。
- 取出活塞并关闭旋塞。将约 30 ml 样品倒入注射器中，重新插入活塞。打开旋塞，将约 10 ml 样品通过滤器压入 60 ml 采样瓶中。盖上瓶盖，用滤液振荡混匀后弃去。重复此步骤，共进行 3 次冲洗。此操作可确保 60 ml 采样瓶中的任何杂质均被去除，并使瓶壁被样品充分润湿。
- 取出活塞并关闭旋塞。将约 60 ml 样品倒入注射器中，重新插入活塞。推动样品通过滤器进入 60 ml 采样瓶中。将瓶子装至瓶颈处，以防止冷冻时瓶子破裂。盖上瓶盖，放入冷藏箱中。
- 对所有剩余样品重复步骤 5.3.2–5.3.4。在上升支和下降支样品之间更换滤膜，以最大限度减少污染。
- 当天将样品带回实验室，并置于冰上运输。
- 按照比电导率升序，依次过滤上升支的样品，直至达到比电导率峰值。等待实验结束后，再按照比电导率升序过滤下降支的样品（即从最后一个样品开始，逆向操作至比电导率峰值处）。
6. 实验室分析前准备
- 若需在实验室中对样品进行过滤，请按照第 5.3.1 节所述方案操作。按照电导率递增的顺序，依次过滤穿透曲线升支和降支的样品。在升支和降支样品之间更换滤膜。
- 将过滤后的样品在 -20 °C 下冷冻保存，直至分析。
- 确保分析设施具备处理高浓度样品的能力。
注意：部分实验室不具备分析高浓度样品的条件，因此应格外谨慎。应使用能够覆盖预期溶质浓度高端范围的预配标准品。高浓度标准品有助于确保标准曲线涵盖经操纵后的溶质浓度预期范围。 - 在所有分析仪器上，均应按照电导率由低到高的顺序分析样品。按比电导由低到高排列样品，可防止高盐/高营养样品污染低盐/低营养样品。这意味着升支和降支的样品在序列上将混合进行。
- 对样品进行总溶解有机碳、总溶解氮、硝酸盐和铵盐的分析，但具体的溶质分析组合应根据研究问题而定（例如参见 Wymore et al.10）。
7. 数据分析
- 使用简单线性回归分析数据。自变量为添加的营养物质浓度，因变量为溶解性有机物浓度（以DOC或DON表示）。图中的每个点代表穿透曲线中的一个瞬时样品，以及该样品的营养物质和DOC/DON浓度。
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结果
图3： 以溶解性有机氮（DON）为响应变量的硝酸盐（NO3-）添加实验示例结果。分析采用线性回归。星号表示在 α = 0.05 水平上具有统计学显著性。请注意，通过营养脉冲法实现了较宽的 NO3- 浓度动态范围。不同子图代表在不同月份和地点开展的实验。地点缩写指三个实验溪流10。正相关关系被解释为反映 DON 作为营养源的作用，而负相关关系则被解释为反映 DON 作为能源的作用。未产生显著关系的实验结果被解释为可能反映了非响应性 DON 池（i.e.
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讨论
营养脉冲法的目标在于表征并量化环境溪流水中高度多样化的溶解性有机质（DOM）库在添加无机营养物浓度动态范围内的响应。若所添加的溶质足以显著提高反应性溶质的浓度，则可构建较大的推断空间，以理解DOM的生物地球化学循环如何与营养物浓度相关联。该营养脉冲方法具有优势，因其无需使用与平台式添加相关的复杂设备例如 蠕动泵），且无需使用昂贵的同位素技术。这些操作易于重复，且可在一天内完成多个实验。然而，我们建议，若在同一天内于同一河段进行重复实验，应将每次添加间隔数小时，以确保残留溶质得到充分冲洗。
在这些生态系统操纵实验中，我们能够测量溶解性有机质（DOM）环境库浓度在添加营养物质后的变化情况。然而，采用这种方法无法判断DOM库中具体是哪一种组分发生了实际的减少或增加，超出溶解性有机氮（DON）和溶解性有机碳（DOC）浓度变化所反映的信息。我们无法辨别是否存在某种特定形态的DON，例如在添加硝酸盐后被优先消耗。3-. 变化可能是由于存在高丰度且可利用的溶解性有机氮（DON）形态例如 氨基酸）发生了足够改变，从而影...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢新罕布什尔大学水质分析实验室在样品分析方面提供的帮助。作者还感谢两位匿名审稿人，他们的意见有助于改进本文手稿。本研究由美国国家科学基金会（DEB-1556603）资助。部分资金还来自EPSCoR生态系统与社会项目（NSF EPS-1101245）、新罕布什尔农业实验站（科学贡献编号 #2662）、美国农业部国家食品与农业研究所（McIntire-Stennis）项目（1006760）、新罕布什尔大学研究生院以及新罕布什尔水资源研究中心。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硝酸钠 | 任意 | 任意 | |
| 氯化钠 | 任意 | 任意 | 可使用市售食盐，但其中含有微量杂质 |
| Whatman GFF 玻璃纤维滤膜 | 任意 | 任意 | |
| BD 过滤注射器 | 任意 | 任意 | |
| EMD Millipore Swinnex 滤器支架 | 任意 | 任意 | |
| 注射器活塞阀 | 任意 | 任意 | |
| YSI 多参数探头 | Yellow Springs International | 556-01 | |
| 广口高密度聚乙烯 125 ml 瓶 | 任意 | 任意 | |
| 60 ml 高密度聚乙烯瓶 | 任意 | 任意 | |
| 20 L 桶 | 任意 | 任意 | |
| 野外卷尺 | 任意 | 任意 | |
| 实验室标签胶带 | 任意 | 任意 | |
| 搅拌棒 | 任意 | 任意 | |
| 保温箱 | 任意 | 任意 | |
| Sharpie 记号笔 | 任意 | 任意 | |
| 野外记录本 | 任意 | 任意 | |
| 镊子 | 任意 | 任意 | |
| 自封袋 | 任意 | 任意 |
参考文献
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