非洲锥虫培养 体外 以较低速率发生抗原变异，导致群体由表达一种主导型变异表面糖蛋白（VSG）的寄生虫和少量“转换”变异体组成。本方案描述了一种快速检测和定量这些群体的方法。
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摘要
摘要
Trypanosoma brucei 是一种原生动物寄生虫，可在采采蝇媒介与哺乳动物宿主之间循环传播，引起人类非洲锥虫病和动物非洲锥虫病（分别称为昏睡病和那加纳病）。该寄生虫通过周期性地更换其表面密集覆盖的变异表面糖蛋白（VSG），从而逃避免疫系统的识别。检测 Trypanosoma brucei 中的抗原变异过程既繁琐又耗费人力。本文介绍一种用于量化特定群体中“转换”表达新VSG的寄生虫数量的方法。首先用针对起始VSG的抗体对寄生虫进行染色，再用连接磁性微珠的二抗进行标记。将寄生虫样品通过置于磁场中的层析柱，表达起始VSG的寄生虫被保留在柱上，而未被保留的流穿部分则包含表达新VSG的寄生虫以及少量仍表达起始VSG的污染细胞。将此流穿群体再次用荧光标记的抗起始VSG抗体染色以标记污染细胞，并加入碘化丙啶（PI）标记死细胞。向流穿群体中加入已知数量的、可通过流式细胞术检测的绝对计数微珠，通过微珠数量与所收集细胞数量的比例，可推算出整个样品中的细胞总数。利用流式细胞术统计不表达优势型起始VSG且PI染色阴性的活细胞数量，从而定量“转换”群体的比例，并结合流式细胞术数据计算出群体中转换子所占比例。
引言
原生动物寄生虫， 布氏锥虫，是通过影响人类的疾病的致病因子（ 布氏冈比亚锥虫和布氏锥虫 罗得西亚锥虫）以及动物（通过 布氏布鲁氏锥虫在整个撒哈拉以南非洲地区传播。它通过采采蝇媒介的唾液传播给哺乳动物宿主。人类非洲锥虫病和动物非洲锥虫病均在流行地区造成严重的经济负担，且目前可用于治疗这两种疾病的药物极少，相关新药研发也十分有限。了解免疫逃逸机制对于开发抗锥虫病药物至关重要。覆盖在寄生虫表面的密集变异表面糖蛋白（VSG） coat 的抗原变异，是该寄生虫实现免疫逃逸的主要机制之一 T. brucei 逃避哺乳动物的抗体反应。大约有 2,000 种该蛋白的变体 VSG 基因存在于锥虫基因组中，但任意时刻仅有一个基因从约15个表达位点中的一个被转录。表达的VSG可通过将VSG基因复制到活性表达位点，或通过激活先前沉默的表达位点进行转录而发生“转换”（详见综述于1).
尽管已有大量研究致力于理解抗原变异 T. brucei，影响转换频率的因素仍不清楚。迄今为止的研究受到以下事实的限制：尽管转换是随机发生的 体外 切换频率非常低，大约为10分之16 细胞2这使得测量某一特定因素是否增加或减少转换频率变得困难，因为转换事件本身首先难以检测。在2009年之前，从特定群体中分离出发生转换的细胞的方法耗时且....
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方案
注意：整个操作过程中必须将细胞置于冰上。全程均应使用预冷的培养基。
1. 样品采集
- 将利什曼原虫427株血液型锥虫培养至密度为0.5–1×10⁶个/mL。最好以少量寄生虫起始培养。离心50×10⁶个细胞。6 细胞/样本在1,500 × g离心10分钟。务必留下1 × 106 用于后续实验的阳性与阴性抗体对照的培养细胞。
注意：本方案也可用于从动物血液中分离的锥虫（详见讨论部分）。 - 用移液器吸出或倒掉大部分上清液（保留约 750 µl）。将细胞转移至 1.5 ml 微离心管中。
- 在4 °C下，于微型离心机中以5,200 x g离心4分钟，然后移除上清液。
2. 磁性标记
- 在 150 µl 培养基（例如含血清的 HMI-9）中重悬细胞，并加入适当稀释倍数的抗 VSG 一抗。
注意：抗 VSG 一抗为实验室自制，使用稀释倍数为 1:50。请务必使用未标记荧光染料的抗 VSG 一抗。 - 在 4 °C 冷室中，使用涡旋振荡仪适配器-60 以 6–8 档速度涡旋振荡细胞 10 分钟。用 800–1,000 µl 冷的含血清 HMI-9 洗涤细胞。
- 在 4 °C 条件下以 5,200 × g 离心 4 分钟，吸除上清液。用 1....
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结果
本文所述方法用于证明，VSG表达位点内的双链断裂会增加群体中发生转换的细胞数量8在此，我们展示了在表达位点被诱导产生双链断裂的锥虫群体的代表性结果。我们将这些锥虫与未被诱导产生双链断裂的锥虫进行了比较。 图1 显示了从磁性激活细胞分选柱流穿部分收集的未诱导和诱导细胞的代表性流式细胞术图谱。在此特定实验中，起始优势VSG为VSG2。左侧面板的 图1A 显示前向散射和侧向散射，可用于在绝对计数微球以及具有活细胞典型前向散射和侧向散射特征的细胞周围设定门控。注意，门控可设置为包含更多细胞，因为死细胞可通过碘化丙啶（PI）染色排除；但所有样本的门控必须保持一致。右侧面板的 图1A 仅显示左侧面板中“活细胞”门控范围内的细胞。PI 染色阳性（Q1 和 Q2）的细胞为死细胞。对优势VSG染色阳性且PI染色阴性（Q3）的细胞为污染细胞。对PI和优势VSG均染色阴性（Q4）的细胞为已发生转换的活细胞。可以观察到，在诱导双链断裂的细胞中，Q3区域的污染细胞比例较低。然.......
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讨论
就实验技术而言，该方案中最关键的步骤是始终保持所有样品处于低温状态。布氏锥虫会迅速内化与其表面结合的抗体9，但这一过程依赖于细胞运动性，只要细胞维持在4 °C条件下，就不会影响检测结果。所有样品必须始终置于冰上，移液操作应迅速完成，以尽量减少暴露于25 °C实验室环境的时间。实验开始时即应准备好含血清的冷HMI-9培养基，并在整个实验过程中保持冰上放置。由于将1 ml样品通过层析柱需要5–7分钟，因此使用层析柱分离锥虫的操作必须在冷室中进行。如果样品数量超过可用的磁性分离装置数量，只要未被主动分离的样品始终保持在冰上，磁性分离可依次进行。
在与磁珠孵育后的最后一次洗涤步骤完成后、以及在磁铁上进行分离之前，必须将样品充分混匀。可通过用力弹击离心管或轻微涡旋来实现充分混悬。在将样品加入分离柱之前，不应观察到任何细胞沉淀或细胞团块，可通过显微镜观察来检查。如果存在细胞团块，则表达优势VSG的细胞流穿样品中的污染水平通常会显著高于理想水平。在计算实验结束时样品中发生转换的细胞数量时，必须明确用于流式细胞分析的是全部流穿液还是仅一半体积。如果仅使用了一半体积，则计算所得.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 George Cross 在锥虫生物学方面的总体指导。本工作还得到了比尔和梅琳达·盖茨基金会GCE项目对DS的资助、美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1325261）对MRM的资助，以及美国国立卫生研究院/过敏与传染病研究所（资助号#AI085973）对FNP的资助。我们感谢 Galadriel Hovel-Miner 提供含有 I-SCEI 基因及其识别位点的菌株。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 未标记的抗VSG抗体 | n/a | n/a | VSG抗体为本实验室自制 |
| 荧光标记的抗VSG抗体 | n/a | n/a | VSG抗体为本实验室自制 |
| HMI-9培养基 | n/a | n/a | HMI-9为本实验室自制 |
| 碘化丙啶 | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright绝对计数微球 | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD柱 | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS磁铁 | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS磁性分离器 | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| 涡旋振荡适配器-60 | ThermoFisher Scientific | AM10014 | |
| 流式细胞仪 | Coulter | n/a | |
| 流式细胞仪分析软件 | FloJo | n/a |
参考文献
- Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
- Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
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重印与许可
