利用磁激活细胞分选与流式细胞术检测Trypanosoma brucei变异表面糖蛋白的转换

摘要

非洲锥虫培养 体外 以较低速率发生抗原变异，导致群体由表达一种主导型变异表面糖蛋白（VSG）的寄生虫和少量“转换”变异体组成。本方案描述了一种快速检测和定量这些群体的方法。

摘要

Trypanosoma brucei 是一种原生动物寄生虫，可在采采蝇媒介与哺乳动物宿主之间循环传播，引起人类非洲锥虫病和动物非洲锥虫病（分别称为昏睡病和那加纳病）。该寄生虫通过周期性地更换其表面密集覆盖的变异表面糖蛋白（VSG），从而逃避免疫系统的识别。检测 Trypanosoma brucei 中的抗原变异过程既繁琐又耗费人力。本文介绍一种用于量化特定群体中“转换”表达新VSG的寄生虫数量的方法。首先用针对起始VSG的抗体对寄生虫进行染色，再用连接磁性微珠的二抗进行标记。将寄生虫样品通过置于磁场中的层析柱，表达起始VSG的寄生虫被保留在柱上，而未被保留的流穿部分则包含表达新VSG的寄生虫以及少量仍表达起始VSG的污染细胞。将此流穿群体再次用荧光标记的抗起始VSG抗体染色以标记污染细胞，并加入碘化丙啶（PI）标记死细胞。向流穿群体中加入已知数量的、可通过流式细胞术检测的绝对计数微珠，通过微珠数量与所收集细胞数量的比例，可推算出整个样品中的细胞总数。利用流式细胞术统计不表达优势型起始VSG且PI染色阴性的活细胞数量，从而定量“转换”群体的比例，并结合流式细胞术数据计算出群体中转换子所占比例。

引言

原生动物寄生虫， 布氏锥虫，是通过影响人类的疾病的致病因子（ 布氏冈比亚锥虫和布氏锥虫 罗得西亚锥虫）以及动物（通过 布氏布鲁氏锥虫在整个撒哈拉以南非洲地区传播。它通过采采蝇媒介的唾液传播给哺乳动物宿主。人类非洲锥虫病和动物非洲锥虫病均在流行地区造成严重的经济负担，且目前可用于治疗这两种疾病的药物极少，相关新药研发也十分有限。了解免疫逃逸机制对于开发抗锥虫病药物至关重要。覆盖在寄生虫表面的密集变异表面糖蛋白（VSG） coat 的抗原变异，是该寄生虫实现免疫逃逸的主要机制之一 T. brucei 逃避哺乳动物的抗体反应。大约有 2,000 种该蛋白的变体 VSG 基因存在于锥虫基因组中，但任意时刻仅有一个基因从约15个表达位点中的一个被转录。表达的VSG可通过将VSG基因复制到活性表达位点，或通过激活先前沉默的表达位点进行转录而发生“转换”（详见综述于¹).

尽管已有大量研究致力于理解抗原变异 T. brucei，影响转换频率的因素仍不清楚。迄今为止的研究受到以下事实的限制：尽管转换是随机发生的 体外 切换频率非常低，大约为10分之1⁶ 细胞²这使得测量某一特定因素是否增加或减少转换频率变得困难，因为转换事件本身首先难以检测。在2009年之前，从特定群体中分离出发生转换的细胞的方法耗时且劳动强度大。这些方法包括将锥虫通过针对优势VSG免疫的小鼠进行传代，然后在一天后收集细胞。³，或通过免疫荧光计数数百个细胞^4,5另一种策略依赖于药物抗性筛选来分离转换子⁶由于培养的非洲锥虫 体外 通常由表达一种主要变异体的大量群体和表达其他变异体的少量转换子群体组成，本文将该主要变异体称为主导性起始VSG。需要强调的是，我们采用这一表述并不意味着该主要变异体在群体中具有比其他变异体更高的适应性。

本文介绍一种可在3至4小时内可靠测定特定群体中表达非优势VSG的锥虫数量的方法。该方法特别适用于确定某种遗传操作或药物处理是否增加了群体中发生VSG转换的细胞数量。本方法并非通过药物或免疫手段清除表达优势起始VSG的细胞，而是首先使用连接有抗优势VSG抗体的磁珠对这些细胞进行标记，随后通过磁柱分离将其去除。发生VSG转换的细胞则保留在流穿组分中，并再次用荧光标记的抗-VSG抗体染色，以识别可能的污染细胞。通过向每个样本中加入已知数量的绝对计数微球，根据微球与细胞的比例即可实现定量，从而计算出群体中发生VSG转换的细胞数量⁷。

方案

注意：整个操作过程中必须将细胞置于冰上。全程均应使用预冷的培养基。

1. 样品采集

1. 将利什曼原虫427株血液型锥虫培养至密度为0.5–1×10⁶个/mL。最好以少量寄生虫起始培养。离心50×10⁶个细胞。⁶ 细胞/样本在1,500 × g离心10分钟。务必留下1 × 10⁶ 用于后续实验的阳性与阴性抗体对照的培养细胞。
   注意：本方案也可用于从动物血液中分离的锥虫（详见讨论部分）。
2. 用移液器吸出或倒掉大部分上清液（保留约 750 µl）。将细胞转移至 1.5 ml 微离心管中。
3. 在4 °C下，于微型离心机中以5,200 x g离心4分钟，然后移除上清液。

2. 磁性标记

1. 在 150 µl 培养基（例如含血清的 HMI-9）中重悬细胞，并加入适当稀释倍数的抗 VSG 一抗。
   注意：抗 VSG 一抗为实验室自制，使用稀释倍数为 1:50。请务必使用未标记荧光染料的抗 VSG 一抗。
2. 在 4 °C 冷室中，使用涡旋振荡仪适配器-60 以 6–8 档速度涡旋振荡细胞 10 分钟。用 800–1,000 µl 冷的含血清 HMI-9 洗涤细胞。
3. 在 4 °C 条件下以 5,200 × g 离心 4 分钟，吸除上清液。用 1 ml 含血清 HMI-9 洗涤后，按上述条件再次离心，吸除上清液。将沉淀重悬于 100 µl 含血清 HMI-9 中。
4. 加入 110 µl 磁性激活细胞分选（MSC）微珠。根据所用抗 VSG 一抗的种属来源，选择相应的抗小鼠、抗兔或抗生物素微珠。充分混匀。在 4 °C 冷室中涡旋振荡细胞 10 分钟。
5. 在细胞涡旋振荡的同时，将一个磁性激活分选柱/样品安装于分离磁铁上。确保在分选柱下方放置收集容器（我们使用 15 ml 离心管）以收集流穿液。整个装置置于冷室中进行操作。
6. 加入 2 ml 含血清 HMI-9 以预处理分选柱。预处理完成后，在分选柱下方放置一个 15 ml 离心管，用于收集每个样品的流穿液。
7. 完成步骤 2.4 的 10 分钟孵育后，加入 800–1,000 µl 冷的含血清 HMI-9。在 4 °C 条件下以 5,200 × g 离心 4 分钟，去除上清液以清除未结合的抗体。用 1 ml 含血清 HMI-9 洗涤一次，并重复离心步骤，最后保留 100 µl 上清液。
8. 用力轻弹离心管，肉眼观察以确认沉淀已完全重悬。加入 1 ml 含血清 HMI-9，反复吹打以确保细胞充分重悬。

3. 磁分离

1. 确保按上述方法对柱子进行预处理。将细胞上样至柱中，收集流出液中的表达非优势VSG的细胞。通常情况下，1 ml培养基加锥虫需6-7分钟流过柱子。
2. 用1 ml含血清的HMI-9洗涤2次，将流出液收集至与步骤3.1相同的离心管中。
3. 将流穿液（3 ml）分装至两个1.5 ml微量离心管中。
   注意：这些样品可后续合并，或取其中一半用于RNA提取， 等等。
4. 将柱子从磁铁上取下。向柱子中加入3 ml含血清的HMI-9培养基，将柱子插入15 ml离心管中，以收集表达起始型优势VSG的细胞。取300 µl洗脱液用于后续分析。将这些细胞置于冰上保存。
5. 作为阳性和阴性对照，从在37 °C培养且不频繁发生转换的对照细胞起始培养物中，取约100万个细胞，用移液器转移至1.5 ml微量离心管中。
   注意：阳性对照细胞将在步骤4.1中用荧光标记抗体染色。阴性对照细胞在整个后续实验流程中均不进行染色。
6. 在 4 °C 条件下，以 5,200 x g 离心 4 分钟，收集流穿样品和阳性抗体对照样品，并弃去上清液。
   注意：可将另取的300 µl洗脱细胞作为抗VSG染色的阳性对照。

4. 染色以鉴定污染物和细胞系错用

1. 将流穿样品和阳性对照细胞重悬于 100 µl 含血清的 HMI-9 培养基中，并加入适当稀释倍数的荧光标记抗 VSG 一抗。
   注意：荧光标记的抗 VSG 抗体为实验室自制，使用稀释比例为 1:1,000。用于流式细胞术检测的荧光标记抗 VSG 抗体可与 MACS 分离步骤中使用的未标记抗体来源相同。在完成步骤 3.5 后，应有 3 ml 流穿样品分装于两个微量离心管中。
2. 为通过流式细胞术分析全部流穿样品，将两个微量离心管中的细胞沉淀合并，并在含血清的 HMI-9 培养基 100 µl 中重悬，同时加入抗 VSG 抗体。充分混匀。
3. 在 4 °C 冷室中涡旋振荡细胞 10 分钟。加入 800 - 1,000 µl 冷的含血清 HMI-9 培养基。在 4 °C 下以 5,200 × g 离心 4 分钟，弃去上清以去除未结合的抗体。
4. 用 1 ml 含血清的 HMI-9 培养基洗涤细胞。在 4 °C 下以 5,200 × g 离心 4 分钟，弃去上清。在此最后一次离心过程中，同时离心步骤 3.4 中获得的洗脱样品和阴性对照样品。
5. 将所有流穿样品和洗脱样品重悬于以下混合液中：148.5 µl 含血清的 HMI-9 培养基、25 µl 绝对计数微球和 1.5 µl 碘化丙啶（Propidium Iodide）染色液（总体积为 175 µl）。将阳性和阴性抗体对照样品重悬于 175 µl 含血清的 HMI-9 培养基中。务必记录所用批次绝对计数微球每 25 µl 中的微球数量。
6. 将所有样品上机进行流式细胞术检测并收集数据。死细胞染色呈 PI⁺，污染物染色呈 PI^-VSG⁺，发生转换的细胞（switchers）染色呈 PI^-VSG^-8。
7. 利用流式细胞术数据计算转换频率。
   注意：有关计算转换频率的具体方法，请参阅补充文件 Flow Cytometry Calculations.docx 和 表 1。

结果

此处所述方法用于证明，VSG表达位点内的双链断裂会增加群体中发生转换的细胞数量⁸在此，我们展示了在表达位点被诱导产生双链断裂的锥虫群体的代表性结果。我们将这些锥虫与未被诱导产生双链断裂的锥虫进行了比较。 图1 显示了从磁性激活细胞分选柱流穿部分收集的未诱导和诱导细胞的代表性流式细胞术图谱。在本实验中，主要的起始VSG为VSG2。左侧面板的 图1A 显示前向散射和侧向散射，可用于在绝对计数微球以及具有活细胞典型前向散射和侧向散射特征的细胞周围设定门控。注意，门控可设置为包含更多细胞，因为死细胞可通过碘化丙啶（PI）染色排除；但所有样本的门控必须保持一致。右侧面板的 图1A 仅显示左侧面板中“Live”门内的细胞。PI 染色阳性（Q1 和 Q2）的细胞为死细胞。对优势VSG染色阳性且PI染色阴性（Q3）的细胞为污染细胞。对PI和优势VSG均染色阴性（Q4）的细胞为已发生转换的活细胞。可以观察到，在诱导双链断裂的细胞中，Q3区域的污染细胞比例较低。然而，Q...

讨论

就实验技术而言，该方案中最关键的步骤是始终保持所有样品处于低温状态。布氏锥虫会迅速内化与其表面结合的抗体⁹，但这一过程依赖于细胞运动性，只要细胞维持在4 °C条件下，就不会影响检测结果。所有样品必须始终置于冰上，移液操作应迅速完成，以尽量减少暴露于25 °C实验室环境的时间。实验开始时即应准备好含血清的冷HMI-9培养基，并在整个实验过程中保持冰上放置。由于将1 ml样品通过层析柱需要5–7分钟，因此使用层析柱分离锥虫的操作必须在冷室中进行。如果样品数量超过可用的磁性分离装置数量，只要未被主动分离的样品始终保持在冰上，磁性分离可依次进行。

在与磁珠孵育后的最后一次洗涤步骤完成后、以及在磁铁上进行分离之前，必须将样品充分混匀。可通过用力弹击离心管或轻微涡旋来实现充分混悬。在将样品加入分离柱之前，不应观察到任何细胞沉淀或细胞团块，可通过显微镜观察来检查。如果存在细胞团块，则表达优势VSG的细胞流穿样品中的污染水平通常会显著高于理想水平。在计算实验结束时样品中发生转换的细胞数量时，必须明确用于流式细胞分析的是全部流穿液还是仅一半体积。如果仅使用了一半体积，则计算所得...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
未标记的抗VSG抗体	n/a	n/a	VSG抗体为本实验室自制
荧光标记的抗VSG抗体	n/a	n/a	VSG抗体为本实验室自制
HMI-9培养基	n/a	n/a	HMI-9为本实验室自制
碘化丙啶	BD Pharmingen	556463
CountBright绝对计数微球	Thermofisher Scientific	C36950
LD柱	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS磁铁	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS磁性分离器	Miltenyi Biotech	130-042-302
涡旋振荡适配器-60	ThermoFisher Scientific	AM10014
流式细胞仪	Coulter	n/a
流式细胞仪分析软件	FloJo	n/a