分析蛋白质向胁迫条件下植物分离叶绿体的导入

摘要

本文介绍了一种在胁迫条件下研究蛋白质导入分离叶绿体的新方法。该方法快速且简便，可用于研究不同胁迫条件对叶绿体蛋白质导入的影响及其相应的调控机制。

摘要

叶绿体是植物中具有多种重要功能的细胞器，不仅参与光合作用，还涉及多种代谢和信号传导功能。此外，叶绿体在植物响应各种非生物胁迫（如盐胁迫和渗透胁迫）过程中发挥关键作用。一个叶绿体可能含有多达约3,000种不同的蛋白质，其中部分蛋白质由叶绿体自身基因组编码。然而，大多数叶绿体蛋白质由细胞核基因组编码，在细胞质中合成，随后需要通过叶绿体被膜上的转运复合体（translocons）导入叶绿体内部。近期研究表明，叶绿体蛋白质的导入过程可受到胁迫条件的主动调控。为了在生物化学层面上研究胁迫条件下蛋白质导入的调控机制，本文介绍了一种快速且简便的实验方法，该方法可在任何实验室中轻松实施。该方法中，植物在正常条件下生长，随后转移至液体培养基中接受胁迫处理。收集植物材料后，通过匀浆释放叶绿体。利用密度梯度离心法分离粗匀浆，从而获得完整的叶绿体。通过计数评估叶绿体产量，并在显微镜下检查叶绿体的完整性。在蛋白质导入实验中，将纯化的叶绿体与 ³⁵S放射性标记 体外 翻译后的前体蛋白，并在不同时间点进行取样，以比较在胁迫条件下不同基因型之间的蛋白质导入速率。我们展示了利用该方法获得的数据，结果表明，在渗透胁迫条件下，调控突变体中蛋白质向叶绿体的导入速率发生特异性改变。

引言

叶绿体是存在于植物绿色组织中的高度丰富的细胞器。它们因在光合作用中的关键作用而广为人知，光合作用利用光能将二氧化碳转化为糖，从而支持地球上几乎所有生命¹。此外，叶绿体（以及更广泛的、相关的细胞器家族——质体）在植物中还发挥着许多其他重要功能，包括氨基酸、脂质、色素的生物合成，以及对重力和病原体侵袭等环境信号的感知。光合作用会产生活性氧（ROS）作为副产物，这些物质在某些情况下具有有益作用，但若过量产生则可能导致损害甚至致命效应。ROS的过量生成尤其由不利环境条件所促进，因此叶绿体与植物对盐胁迫和渗透胁迫等非生物胁迫的响应密切相关²。

叶绿体具有复杂的结构。每个叶绿体都被一种称为被膜的双层膜结构所包围，该被膜由外膜和内膜组成。在内部，还存在另一个称为类囊体的膜系统，光合作用的光反应即在此进行。两个膜系统之间是一个充满液体的区域，称为基质，参与碳固定过程。一个叶绿体可能含有多达约3,000种不同的蛋白质，其中绝大多数蛋白质在细胞质中以前体形式合成，需要通过被膜上的特异性蛋白质转运复合物（translocon）导入细胞器内¹。有趣的是，近期研究表明，叶绿体蛋白质的导入受到主动调控，因而能够对叶绿体蛋白质组实现重要水平的控制。例如，2015年有研究报道，蛋白质导入可通过泛素-蛋白酶体系统直接调控叶绿体外被膜转运复合物（TOC）的丰度，从而响应非生物胁迫³。

使用纯化的叶绿体和 体外 合成的前体蛋白，蛋白质的导入可被重建 体外 ^4,5因此， 体外 可采用多种方法评估不同突变体植物的导入速率 ⁶，这一方法对于分析蛋白质导入机器的潜在组分以及揭示蛋白质导入及其调控机制至关重要。此外，叶绿体可在后续进行进一步的分级分离或蛋白酶消化处理， 体外 导入，有助于研究叶绿体蛋白的亚细胞器定位与拓扑结构 ^7,8.

为了研究应激对蛋白质导入的调控作用，我们对常规的叶绿体分离方法进行了改进，具体如下所述。重要的是，叶绿体来源于在标准的Murashige和Skoog（MS）琼脂培养基上生长8天后，转入添加了应激因子的液体MS培养基中的植物，从而实现了相对短暂且可控的应激处理。从经历此类应激处理的植物中分离得到的叶绿体，其产量和功能均适用于后续的体外蛋白质导入实验³。除了叶绿体分离方案外，我们还介绍了常规的体外蛋白质导入方法，该方法已被证实具有良好的稳定性，并被广泛使用^3,9-12。

方案

1. 拟南芥植株的培养与胁迫处理

1. 通过将 4.3 g MS 基本盐混合物、10 g 蔗糖、0.5 g 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）加入去离子水中并定容至 1 L，用氢氧化钾（KOH）调节 pH 至 5.7。加入 6 g 植物琼脂，并在 120 °C 下高压灭菌 20 分钟。
   1. 在凝固前，将培养基倒入圆形培养皿（直径 9 cm，高 1.5 cm，每皿加入 20 - 25 mL MS 培养基）。在超净工作台中敞盖干燥约 1 小时后再盖上皿盖。
2. 将 Arabidopsis thaliana 种子放入 1.5 mL 离心管中进行表面灭菌：加入含 0.02% (v/v) Triton X-100 的 70% (v/v) 乙醇 1 mL，持续振荡 5 - 10 分钟。每种基因型/处理条件准备 10 个培养皿，每皿约含 100 - 150 株幼苗。
3. 等待约 10 秒 使种子沉降至管底，然后用移液器吸弃上清液。加入 1 mL 100% 乙醇，再次振荡 10 分钟。
4. 在种子灭菌期间准备超净工作台。每个样品取一张滤纸，在超净台内将其对折以便播种，并用 100% 乙醇浸湿。待其完全干燥。注意使用 100% 乙醇是因为其比 70% 乙醇蒸发更快。
5. 使用剪去尖端约 5 mm 的 1 mL 移液枪头，通过移液将种子转移至滤纸上。使其干燥，约需 10 - 15 分钟。
6. 将约 100 - 150 粒灭菌后的种子均匀播种于每块 MS 培养基培养皿中，并用外科胶带密封各皿。
7. 将培养皿倒置存放于 4 °C 环境中 2 - 4 天 以促进并同步萌发。较陈旧的种子可能需要在 4 °C 下存放更长时间（最长可达一周）。
8. 将培养皿转移至植物组织培养室，并正置放置。在长日照条件下（16 小时 100 µmol·m⁻²·s⁻¹ 光照，8 小时 黑暗）于 20 °C 培养 8 天 。
9. 进行胁迫处理时，当植株生长至 8 天 龄，在超净工作台中戴上经乙醇灭菌的手套，轻轻刮取琼脂培养基上的植株，转移至含有胁迫剂（例如，200 mM 甘露醇）的灭菌液体 MS 培养基锥形瓶中。避免带入琼脂培养基。用灭菌铝箔封住瓶口，并将植株置于与步骤 1.8 相同的条件下，在摇床中轻轻振荡（~100 rpm）继续培养 2 天 。

2. 通过制备前体蛋白 体外 转录/翻译

注意：本方案以拟南芥光系统I亚基D前体（pPsaD）作为模板/前体蛋白，但该方法也适用于其他类似蛋白。

1. 将 pPsaD 的编码序列（CDS）克隆至 pBlueScript II SK 载体（或任何其他具有上游 T7 启动子的类似载体）的多克隆位点（MCS）中¹³。使用 DNA 提取试剂盒纯化质粒（pBSK-pPsaD），并通过 DNA 测序验证序列。
   注意：所有这些步骤均采用标准的分子克隆技术。
2. 使用分光光度计在 260 nm 处测定 pBSK-pPsaD 质粒 DNA 的浓度。将质粒稀释至终浓度为 10 ng/µL。
3. 以稀释后的质粒为模板进行 20 µL 的 PCR 反应（共 35 个循环）。反应体系如下：2 µL 10× 聚合酶缓冲液，2 µL 2 mM dNTPs，1 µL 5 mM M13 正向引物（5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'），1 µL 5 mM M13 反向引物（5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'），1 µL 稀释后的 pBSK-pPsaD 质粒，1 U Taq 聚合酶，加去离子水至总体积为 20 µL。采用标准 PCR 程序：95 °C 预变性 5 min；35 个循环 [95 °C 变性 30 sec；56 °C 退火 30 sec；72 °C 延伸 30 sec]；最后 72 °C 延伸 5 min。
4. 取 5 µL PCR 产物在含 TAE 缓冲液（Tris-HCl，pH 7.6，20 mM 乙酸，1 mM EDTA）的 1%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳，以验证 cDNA 的正确扩增，并通过与标准品比较对目标条带进行定量以确认浓度。其余产物储存于 −20 °C，以备后续使用。
5. 使用基于兔网织红细胞裂解物的、适用于 PCR DNA 的无细胞转录/翻译系统，配制 50 µL 反应体系，如下：40 µL 转录/翻译系统提供的网织红细胞裂解物，2.5 µL 放射性标记的 [³⁵S]甲硫氨酸，11 µCi/mL（比活性：>1,000 Ci/mmol），2.5 µL 无菌去离子水，以及 5 µL pPsaD PCR 产物（100–800 ng）。
   注意：操作放射性物质时应佩戴手套、实验服和护目镜。监测并清除工作台面及设备的污染。所有放射性废物须置于经批准的废物容器中处理。
6. 将反应体系在 30 °C 水浴中孵育 90 分钟。将样品置于冰上以终止反应。
7. 取出 1 µL 反应产物作为检测样本（该体积也可作为步骤 5.7 的输入对照），通过标准十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结合自显影、荧光放射自显影 或磷屏成像进行验证。若观察到与 pPsaD 分子量相符（约 23 kD）的清晰且强的条带，则表明结果良好。其余反应产物储存于 −80 °C，以备后续使用。

3. 叶绿体分离

1. 配制以下储备液：
   1. 制备叶绿体分离缓冲液（CIB，2×）：0.6 M 山梨醇，10 mM 氯化镁（MgCl₂），40 mM 2-吗啉乙磺酸（MES），pH 5.5（用氢氧化钾调节），30 mM 氯化钾（KCl），2 mM 乙二醇四乙酸（EGTA），2 mM 二硫苏糖醇（DTT），4%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）。将溶液置于冰上预冷，并在使用前加入 1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）。₂），10 mM 乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA），10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），20 mM 碳酸氢钠（NaHCO₃）₃），40 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）；用KOH调节pH至8.0。配制2 L的2倍浓度CIB溶液，分装后于-20 ℃保存 °用于长期保存，或在4℃下 °短期储存用 C。配制 1× CIB 时，将 2× CIB 与蒸馏水按 1:1 体积比稀释；可在叶绿体分离实验当天新鲜配制。
   2. 配制 HEPES-MgSO₄₄-山梨醇缓冲液（HMS，1×）：50 mM HEPES，3 mM 硫酸镁（MgSO₄），100 mM 山梨醇，pH 7.5（用 KOH 调节）₄)，0.3 M 山梨醇；用氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 8.0。配制 400 mL 缓冲液，分装后于 -20 ℃ 保存 °用于长期保存，或在 4℃ 下短期存放 °短期储存用 C。
2. 所有以下操作均需在冷室中或冰上进行。实验开始前，将所有溶液、装置、设备和转子预冷。
3. 在50 mL离心管中加入13 mL Percoll、13 mL 2x CIB缓冲液和5 mg谷胱甘肽，混匀以制备连续密度梯度，并在43,000 ×g下离心该混合物 × 4℃下以30,000 × g离心30分钟（不启用刹车） °C. 离心后，小心操作离心管以避免扰动密度梯度，并将其置于冰上以备后续使用。
4. 将每种基因型/条件的100 mL 1x CIB转移至1 L烧杯中。
   1. 将幼苗从液体培养基中倒入筛子中取出，转移至另一个含有CIB的烧杯中；然后用CIB冲洗组织以去除残留的液体培养基，再更换为100 mL新鲜的CIB。
5. 为实现充分匀浆，每个样本分五次连续匀浆，每次使用20 mL新鲜CIB（置于50 mL烧杯中），每份样本总计使用100 mL 1× CIB。
   1. 第一轮匀浆时，用手将植物组织转移至50 mL烧杯中，使之前浸泡的缓冲液从指间沥出。尽量在第一轮使用大部分组织，但需确保组织完全浸入缓冲液中；若无法做到，可将剩余未使用的组织在第二轮加入。
6. 将组织匀浆器的探头插入组织中，以每次1-2秒的两次脉冲进行匀浆 每份样品均通过两层滤布过滤匀浆液，轻轻挤压后收集滤液至250 mL离心管中。保留滤液，并将组织重新转移回50 mL烧杯中。
7. 将第二个20 mL CIB等分试样加入50 mL烧杯中，加入第一轮匀浆未使用的任何剩余组织，重复匀浆和过滤步骤。因此，重复步骤3.5和3.6，直至用完全部100 mL CIB即，取5份，每份20 mL），合并所得滤液。
8. 将合并的匀浆在1,000 × g下离心 × 4℃下以5分钟离心（开启刹车） °C，离心结束后立即弃去上清液，注意不要扰动沉淀。将管子置于冰上，通过轻轻振荡，利用管内残留的少量上清液重新悬浮沉淀。切勿使用移液器吹打或涡旋剧烈重悬。
9. 使用巴斯德移液管沿接收管管壁，将匀浆液轻柔地加至预先制备的连续密度梯度顶部，避免扰动梯度。在摆动桶转子中以7,800 × g离心 × 4℃下离心10分钟（关闭刹车） °C.
   注意：离心后梯度中可见两条绿色条带：下层条带含有完整的叶绿体，上层条带含有破碎的叶绿体。
10. 用移液器弃去上层条带，然后用巴斯德移液管将下层条带转移至新的50 mL离心管中，每梯度保留体积最多8 mL。
11. 加入约 25 mL 1x HMS 缓冲液至试管中，轻轻倒置试管两次，以洗涤叶绿体中的 Percoll。将试管再次放入水平转子中，于 1,000 × g 离心 × 4℃下以5分钟离心（开启刹车） °C.
12. 倒掉上清液，轻轻晃动离心管，使叶绿体沉淀在管中残留的HMS中于冰上小心重悬。加入额外的100–300 µ如有必要（根据沉淀物大小和第4节中的计数结果），用HMS补足至L，但尽量避免过度稀释样本。
    1. 将叶绿体置于冰上保存。每次用于下游实验前，需轻轻振荡离心管以重悬叶绿体。转移叶绿体时务必使用剪口吸头（孔径增大）。

4. 叶绿体产量与完整性的分析

1. 取5 µL分离的叶绿体加入到1.5 mL离心管中的495 µL 1x HMS缓冲液中，然后通过轻轻颠倒混匀，得到1:100的稀释液。
2. 将盖玻片盖在血细胞计数板计数室的上方。缓慢吸取约40–60 µL稀释后的叶绿体悬浮液，加入盖玻片与计数室之间的缝隙中。使用配备10X或20X 物镜的相差显微镜观察，完整的叶绿体呈圆形、明亮，并被一圈光晕包围。
   注意：在显微镜下，计数室中央有一个1 mm²的计数区域，包含25个大方格，每个大方格内又分为16个小方格。
3. 计数10个大方格内的叶绿体数量。每个大方格内的叶绿体数量应平均在10至30之间。若叶绿体数量过少或过多，应相应调整稀释倍数（见步骤4.1），并重复操作。
4. 按下述方法计算每毫升叶绿体数量（浓度）：n（步骤4.3中计算得到的每个大方格平均叶绿体数）× 25（大方格总数）× 100（稀释倍数）× 10⁴（换算系数，用于将数据表示为每1 mL的数值，因为25个方格上方的体积为0.1 mm³）。
5. 将上述浓度乘以步骤3.12中获得的叶绿体悬浮液体积，计算叶绿体的实际产量。通常可获得超过50 × 10⁶个叶绿体。

5. 叶绿体蛋白导入

1. 配制以下贮存液：
   1. 配制10倍HMS缓冲液：500 mM HEPES，30 mM MgSO₄₄，以及 3.0 M 山梨醇；用 NaOH 调节 pH 至 8.0。配制 50 mL 该缓冲液，分装后于 −20 ℃ 保存 °长期储存于 C，短期存放于 4 °短期储存用 C。
   2. 制备导入终止缓冲液：将50 mM EDTA溶解于1×HMS缓冲液中。配制50 mL该缓冲液，分装后于−20 ℃保存 °C.
   3. 制备2×蛋白质上样缓冲液：60 mM Tris-HCl，pH 6.8，10% (v/v) 甘油，2% (w/v) SDS，0.005% (w/v) 溴酚蓝。配制50 mL，4 ℃保存 °C. 使用前立即加入100 µ1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT）溶液 900 L µ缓冲液 L
2. 为进行包含3个时间点的时间进程实验，准备3支试管，每支含有130 µ加入适量停止缓冲液，并置于冰上。准备450 µ在2 mL离心管中进行L型导入反应（每种基因型/条件）。所有组分在使用前冰上融化。
   1. 一次导入反应通常使用10 × 10⁶ A中的叶绿体 µL 体积；例如，如果叶绿体浓度为 2.5 × 10⁸ /mL，使用40 µL 叶绿体悬液。需要三个时间点，共需 3 × A µL (即, 120 µL 在我们的示例中）。
   2. 在冰上按以下顺序混合反应组分：蒸馏水（补至总体积600） µL），B µL 10x HMS缓冲液（其中B = [600-3×A]/10 即， 48（以我们的示例为例），12 µL-1 M 葡糖酸（钾盐），6 µL 1 M NaHCO₃₃, 6 µL 20% (w/v) BSA，30 µL 100 mM 腺苷 5′′三磷酸镁盐（MgATP），24 µL 250 mM 甲硫氨酸（非放射性标记），以及 30 µL 前体蛋白。在开始导入反应前，立即加入 3 × A µL 叶绿体，轻轻敲击试管混匀。
3. 将反应管在25℃下孵育 °在100℃水浴中孵育 µmol·m⁻²·s⁻¹ 光照。偶尔轻弹离心管以重新悬浮叶绿体。
4. 为进行时间进程实验，吸取130 µ在导入反应的线性范围内，在所需的时间点（对于 pPsaD 最长约为 12 分钟，本实验可选择 4、8 和 12 分钟）取 L 体积的反应液。不同蛋白质的线性范围可能有所不同。 ¹⁴因此，建议在优化时间点之前对每种前体蛋白分别进行测试。
5. 每次抽出后立即转移130 µ将L等分试样加入预冷的进口终止缓冲液管中，轻轻敲击管壁混匀，并将所有管置于冰上，直至完成时间进程。
6. 将所有样品离心30秒 在 12,000 × g 微量离心后，用移液器弃去上清液，并将沉淀重悬于 15 µ通过涡旋震荡将2x蛋白上样缓冲液混匀。
7. 通过标准 SDS-PAGE 以及放射自显影或荧光自显影分析所有样品及 pPsaD 输入对照（包含相当于步骤 2.7 中加入每个导入反应量的 10% 的 pPsaD） 或磷屏成像 ¹⁵使用图像分析软件对结果进行定量和分析。为了评估导入效率，可通过测量每条成熟条带相关的放射性来确定不同基因型/条件下的蛋白导入量。

结果

一个包含3个时间点的叶绿体蛋白导入实验示例如下所示 图1PsaD 是光系统 I 的一个约 18 kD 的组分，位于基质侧，其前体形式约为 23 kD¹⁶PsaD 被选为本研究的 体外 蛋白质输入实验，因为其稳态水平在该条件下升高 sp1 与野生型相比，该突变体在胁迫条件下表现出其导入效率的变化 ³。该 sp1 突变体在叶绿体蛋白导入机制的一个重要调控因子——SP1蛋白中存在缺陷 ³在正常生长条件下分离的叶绿体中，PsaD 的导入没有明显差异 sp1 以及野生型（数据未显示）³然而，采用本文所述方法检测来自渗透胁迫植物的叶绿体中PsaD的导入情况时，发现明显差异。尽管我们在两种基因型中均观察到成熟蛋白形式随时间依赖性积累，但野生型（WT）叶绿体的导入速率显著低于 sp1 叶绿体（图1），这与我们之前的结果一致 ³并揭示了SP1蛋白在胁迫条件下调控PsaD向叶绿体转运的重要作用。 

图1. 利用在渗透胁迫条件下生长的植物中分离的叶绿体进行蛋白质导入实验。 从10天大的野生型（Col-0）和一个 sp1 在胁迫条件（200 mM 甘露醇）下生长2天的拟南芥突变体植株。A蛋白质导入使用[³⁵S]-甲硫氨酸标记的pPsaD，并分别反应4、8和12分钟，随后通过SDS-PAGE和磷屏成像分析。同时，设置pPsaD 10%输入对照样本 体外 翻译后的蛋白质（IVT）进行了分析。图中显示了pPsaD的前体（pre）和成熟（mat）形式，两者之间有两个条带，其强度在时间过程中未发生变化（*），可能对应于截短或发生蛋白水解的翻译产物。B) 比较野生型（WT）和突变体中蛋白质向叶绿体的导入速率 sp1 在胁迫条件下生长的植物中，每条条带的强度对应于导入的成熟蛋白 A 对蛋白的导入量进行了定量。所有数据均以野生型植株叶绿体在12分钟时导入蛋白量的百分比表示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

我们最近发现，叶绿体蛋白质的导入可受到胁迫的主动调控，这对叶绿体功能和植物存活至关重要³。在该研究中，为了监测这种调控作用，我们改进了叶绿体分离和体外导入实验流程，以便评估在胁迫条件下生长的植物的蛋白质导入能力。结果表明，SP1在叶绿体蛋白质导入调控中具有重要作用。

传统的体外（in vitro）蛋白转运实验通常使用在标准MS琼脂培养基上生长的植物^6,17,18。然而，对于本文所述的sp1突变体而言，此类传统实验并未显示出其蛋白转运能力与野生型（WT）之间存在任何差异³。但是，当采用本文所述方法在胁迫条件下评估蛋白转运时，SP1在调控蛋白转运中的作用则变得明显（图1）。尽管由于实验方法分别采用液体培养和琼脂培养的植株，可能无法将胁迫条件下的蛋白转运数据与传统实验结果进行直接比较，但只要所有植株均在同一液体培养基中培养（无论是否添加胁迫因子），则胁迫与非胁迫条件之间的比较仍是可行的。

与在琼脂培养基上的胁迫处理相比，液体培养更便于处理大量实验所需植株 体外 导入实验。此外，该方法能够对所有植株均匀施加胁迫，这对于短期胁迫处理尤为重要。本文所述方法已应用于通过甘露醇处理研究渗透胁迫，但也可轻松适用于多种其他胁迫类型；例如，短期盐胁迫和氧化胁迫，相应的胁迫剂可通过液体MS培养基以类似方式施加。对于其他类型的胁迫，我们建议首先优化胁迫程度；过于剧烈的处理可能对分离细胞器的产量和/或导入能力产生不利影响。

在本方案中有若干关键步骤需要特别注意，具体如下。

MS 培养基中琼脂的最佳浓度可能因生产商而异（0.6 - 0.9%，w/v），因此建议在开始实验前通过实验优化琼脂浓度。培养基的硬度不应过低，以免在收获步骤（步骤 1.9）时粘附于组织；也不应过高，以免抑制植物根系发育。蔗糖浓度也可根据所用植物种类进行调整。在处理特别衰弱的突变体时，添加 2 - 3%（w/v）蔗糖的 MS 培养基可能有助于植物更好地生长。进行胁迫处理时，不宜将过老的植株转移至液体培养基中（例如，>14 天龄）。原因是较老植株发育更充分的根系在转移过程中更容易受损。

关于转录/翻译系统，主要有两种类型：基于小麦胚芽的系统和基于兔网织红细胞的系统。这些试剂盒可使用不同的模板，例如线性化质粒、非线性化质粒或PCR产物。试剂盒还针对T3、T7和SP6启动子具有特异性。需要注意的是，此处推荐的试剂盒仅适用于PCR产物和T7启动子。然而，由于未知原因，使用该系统制备的一些放射性标记前体蛋白可能在导入实验中效果不佳；在此类情况下，可考虑尝试使用适用于质粒模板的小麦胚芽提取物系统或网织红细胞裂解物系统。此外，也可根据制造商说明书优化反应条件，以提高转录/翻译反应的结果。

为了防止叶绿体因光合作用积累淀粉而影响完整细胞器的分离，应在清晨（或在生长室光照周期的早期）开始叶绿体的分离。叶绿体分离过程必须迅速进行，不得有任何不必要的延迟，且分离得到的叶绿体必须始终保持低温。这是因为分离后的叶绿体活力会逐渐下降，不利于后续实验。若使用新解冻的CIB或HMS缓冲液，使用前务必充分混匀，以获得均一的溶液。植物材料匀浆的最佳条件是通过经验确定的，若使用不同的组织匀浆器，条件可能需要调整。

如果不同植物基因型含有相似的叶绿素水平，则可在进行蛋白导入实验前，采用叶绿素定量作为样品归一化的替代方法。叶绿素含量可通过分光光度法测定，测定前需用80%（v/v）丙酮水溶液提取部分分离得到的叶绿体样品。 ^19,20然而，如果具有不同叶绿素含量的植物的吸收速率（例如，若需比较具有黄化表型的突变体，应在导入实验中通过叶绿体计数对叶绿体样品进行归一化处理。在步骤3.11中充分重悬叶绿体尤为关键。重悬不充分可能导致叶绿体聚集成团，从而难以准确计数，进而影响导入反应中的正确加样。若在显微镜下观察到严重的聚集现象（例如，具有聚集体的 >10个叶绿体连接在一起），继续在冰上振荡叶绿体样品，直至聚集体完全消失。用较小体积的缓冲液重悬叶绿体会更加容易。

需要注意的是，由于蛋白质导入反应（第5节）具有放射性，因此必须采取适当的防护措施。必要的预防措施包括：佩戴一次性手套、实验服和护目镜，监测并清除工作台面和设备的污染，以及将所有放射性废物丢弃至经批准的废物容器中。同时需注意，在导入反应过程中，正确的渗透压对于维持叶绿体的完整性至关重要，而这一点主要由HMS缓冲液来保证。由于10x HMS溶液黏稠，应先将其升温至室温，充分混匀，并使用剪口移液枪头进行移液，以确保体积准确。在导入反应中，加入非放射性甲硫氨酸可抑制游离的放射性标记甲硫氨酸在孵育过程中通过细胞器翻译掺入非目标叶绿体蛋白；而牛血清白蛋白（BSA）则作为蛋白酶的底物，用于减少蛋白质降解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MS基本盐（Murashige和Skoog）	Melford	M0221
植物琼脂（phytoagar）	Melford	P1003
2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）	Melford	B2002
曲拉通X-100（triton X-100）	Fisher	BPE151-500
外科胶带（例如，Micropore，3M）	3M	1530-1
滤纸	Fisher	FB59023
Percoll	Fisher	10607095
乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）	Sigma	E4378
乙二胺四乙酸（EDTA）	Fisher	D/0700/53
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）	Melford	B2001
过滤布（Miracloth）	Calbiochem	475855
50 mL 离心管	Fisher	CFT-595-040M
250 mL 离心瓶	Fisher	CFT-891-V
Polytron均质器（例如，Kinematica PT10-35）	Fisher	11010070
Polytron探头（例如，Kinematica PTA20S）	Fisher	11030083
离心机（例如，Beckman Coulter Avanti JXN-26，适用于50和250 mL管）	Beckman Coulter	B34182
适用于250 mL瓶的固定角转子（例如，JLA-16.250）	Beckman Coulter	363930
适用于50 mL管的固定角转子（例如，JA-25.50）	Beckman Coulter	363058
适用于50 mL管的摆动桶转子（例如，JS-13.1）	Beckman Coulter	346963
放射性标记的[35S]甲硫氨酸	Perkin Elmer	NEG072002MC
基于兔网织红细胞裂解物的无细胞翻译系统（TNT T7 Quick试剂盒，用于PCR DNA）	Promega	L5540
相差显微镜（例如，Nikon Eclipse 80i）	Nikon	不可用
血细胞计数板（改进型Neubauer BS748计数室）	Hawksley Technology	AC1000	0.1 mm深度，1/400 mm2
盖玻片	VWR	16004-094	22 mm × 22 mm，厚度0.13–0.17 mm
1.5 mL 微量离心管	Sarstedt	72.690.001
2 mL 微量离心管	Starlab	S1620-2700
微量离心机（例如，Eppendorf 5415D）	Eppendorf	不可用
Nanodrop 2000分光光度计或类似设备	Thermo Fisher	SPR-700-310L
葡糖酸（钾盐）	Fisher	22932-2500
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A7906
MgATP	Sigma	A9187
甲硫氨酸	Sigma	M6039
溴酚蓝	Fisher	B/P620/44
甘油	Fisher	G/0650/17
SDS	Fisher	S/5200/53
Tris碱	Melford	B2005
二硫苏糖醇（DTT）	Melford	MB1015
图像分析软件（例如，Aida Image Analyzer）	Raytest	不可用