自动定量分析细胞计数程序使用ImageJ插件

Summary

本文通过两个新的开源 ImageJ 插件 Cell Concentration Calculator 和 Migration assay Counter 描述了血细胞计数器和迁移/侵袭显微照片的定量。 此外，它还描述了图像采集和校准协议，并详细讨论了插件的输入要求。

Abstract

健康的ImageJ的国家研究所是一个功能强大，免费的图像处理软件套件。 ImageJ的具有可有效地用于计算各种生物颗粒全面粒子分析算法。当计数大量细胞样品，血细胞计数仪呈现与问候时间的瓶颈。同样地，从与ImageJ的插件细胞计数迁移/侵袭测定法计数的膜，虽然准确，分外劳动密集型的，主观的和声名狼藉用于使手腕疼痛。为了满足这一需求，我们开发了内ImageJ的两个插件用于自动血球（或已知体积）和迁移/侵袭细胞计数的唯一任务。这两个插件依靠获得高品质的显微照片以最小的背景的能力。他们很容易使用，对于大样本容量，内置分析工具的快速计算和分析，帮助计数的校准优化。通过组合的核心原则与自动计数算法和后计数分析细胞计数的S，这大大增加了与该迁移测定可以不准确性的任何损失进行处理的容易性。

Introduction

体外细胞计数是在广泛的组织培养实验的一个重要的基本技术。准确地确定在培养细胞的数目为实验的重复性和标准化^1,2-必不可少的。细胞计数可以手动使用血细胞计数器以及使用各种自动化方法，各有各的优点和缺点^3,4,5来执行。大多数的细胞计数的自动化方法属于两类，那些使用库尔特原理或流式细胞仪中的一个。犁刀计数器利用细胞电阻，以确定细胞数量和大小。他们是快速，准确，价格比流式细胞仪。然而，它们很少用于仅细胞计数，由于其相当大的成本相比，人工计数^3。流式细胞仪，在另一方面，是昂贵的，但它们有许多应用，例如细胞计数，细胞形状，ST的分析ructure和测量内部细胞标记物^4,5。使用以下两种原则的机器都可以从许多制造商。人工计数是可以承受的，但费时，并受偏压而自动化方法来提供关于整个人工计数所需要的时间的一小部分，但使用昂贵的机器^6。

其他常见的细胞培养过程是在体外细胞运动性测定法，即，细胞迁移和侵入^7。迁移和侵袭测定法通常用于研究细胞运动和侵袭响应于趋化反应。另外，它们被广泛地用于研究胚胎发育，分化，炎症反应，并转移多种细胞类型^7-11的。已迁移或侵入通过迁移测定的多孔膜细胞可以在两种不同的方式来量化。首先，通过用荧光染料染色的细胞中，分离来回中号使用荧光读取器¹²的膜，和定量。....

Protocol

1.复式显微镜和摄像机设置（细胞浓度计算器）

1. 增加灯泡亮度完整与光调节旋钮，切换到4X物镜，并确保相衬滤波器被选中。
   注意:任何倒置显微镜进行组织培养与黑暗的背景， 例如，PHP相衬，可以按照标准的显微镜和照相机过程中使用。
2. 在显微镜的软件，集图像采集设置为默认值。
   注:请参阅显微镜的用户手册，以找到这些设置的位置。
   1. 设置"亮度"，"对比度"和"饱和"为100％，"γ"和"增益"为1.0。
      注:根据不同的软件，"亮度"和"对比度"可能默认为0％的值，而不是100％。
   2. 设置图像的黑白使用最高分辨率availabl被捕获E（可达1,600 x 1200像素（PX）或更大）。
      注:0％'饱和'是足够的，如果黑白设置不可用。
3. 将一个标准的血球到显微镜台上，拍摄图像如（ 图1A）中描述;这是"音量校正图像"。调整曝光时间的要求。

2.图像体积校准

1. 打开ImageJ的，并从插件菜单，启动细胞浓度计算器（CCC）的插件， 如插件>分析仪>'细胞浓度计算器"。
   1. 如果右侧的"图像体校准"面板不可见，点击"校准"来证明这一点。
2. 在ImageJ的，从步骤1.3（"....

Results

细胞浓度计算器

图1呈现CCC校准和可数的图像采集的整个过程。 图1A和1B描绘了在像素P-正方形长度的P平方校准图像和计算。 CCC确定在使用公式给定体积的细胞浓度:

血球的P-正方形有100 NL的体积（1毫米×1毫米×0.1毫米），并考虑到这种恒定的，总的图像体积可以像素转换为毫米后计算。 图1C是在对焦细胞显示特性相照明和没有背景血球刻度的理想可数的图像。最后，FIGUR的散点图Ë1D示出一个.......

Discussion

关键步骤，故障排除和限制

自动计算方法的本质，特别是那些颗粒的分析，就必须确定这些粒子的数学能力。因此，这两种细胞浓度计算器和迁移测定计数器的精度majorly依赖图像保真度，也就是，所捕获的图像如何酷似细胞样品或迁移测定膜。因此的至上重要性跟随显微镜和相关软件校准协议尽可能最好。这包括限制的背景噪声，减少了不必要的颗粒，捕捉明亮，均匀对焦的图像，并在无损文件格式，如TIFF格式保存。因此，这两个插件都有可能，如果这些要求得不到满足，产生错误的结果。因此，总是好的做法，仔细检查细胞计数，以确定他们是否在DOUB匹配时，视觉的期望吨。如果确实是这样做的结果不符，将原始图像与二值图像比较可能有助于阐明问题（10.4注）。在一些情况下，较深的迁移测定的图像可能包含已经计数由于落入色的阈值限制内的像素值大的区域。一般情况下，使用平场图像去除黑暗和色斑，并防止因色差违规行为最不想要的计数。

考虑到这些可能的，比较常见的问题，它遵循像那些由自然出版集团等¹³提出的标准图像的完整性的准则是很重要的。为了保持一致的计数，任何调整.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone 经典液体培养基：RPMI 1640 - 含 L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	SH3002702	细胞培养基
胎牛血清 （FBS）	GIBCO BRL	P00015	培养基供应
HTR8/SVneo 滋养层细胞系	细胞来自查尔斯·格雷厄姆博士（女王s University， Kingston， Canada）		软件旨在处理任何细胞系。
胰蛋白酶	GIBCO BRL	27250-018	在 10 µ 中制备为 0.20% （w/v）;M EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm 细胞培养板	SARSTEDT	833902	任何经组织培养处理的板都适用
Transwell 聚酯膜插件 - 8.0 &微;m 孔径	Costar 3422 订购自 Fisher Scientific	7200150	用于 24 孔板;孔径：8.0 µm;直径 6.5 mm;0.33 cm2生长区域
HARLECO 血液学染色剂和试剂，EMD Millipore - 解决方案 1、2 和 3	EMD Millipore，从 VWR	65044A、B 和C	Hemacolor 染色剂套装由三个 500 毫升（16.9 盎司）塑料瓶组成，包括甲醇固定剂（溶液 1）、伊红或酸性染色剂（溶液 2）和亚甲基蓝或碱性染色剂（溶液 3）
棉尖涂抹器	Puritan Medical	806-WC
单刃工业剃须刀片	VWR	55411 - 055	厚度：0.30 毫米（0.012 英寸）
显微镜载玻片 - 预清洁/普通	Fisher Scientific	12550A3	尺寸：25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand 盖玻片 - 矩形 no. 1	Fisher Scientific	12-545E	厚度：0.13 至 0.17 mm;尺寸：50 毫米 x 22 毫米
Fisher Chemical Permount 安装介质	Fisher Scientific	SP15-500
徕卡立体解剖显微镜	徕卡显微系统		徕卡显微镜相机 MC170 HD 型和相机软件是徕卡应用程序套件 （LAS E2） 版本 3.1.1 [构建：490]。显微镜零件： LED3000 点光源照明型号：MEB126，Leica M80 光学载体型号 M80，消色差物镜 1.0X，WD=90 mm 型号： MOB306 &物镜消色差物镜 0.32X， WD=303 mm 型号：MOB315，视频物镜 0.5X 型号：MTU-293
血细胞计数器	助手 德国		0.100 mm 深度 - 0.0025 mm2
Olympus 倒置光学显微镜	奥林	CKX41SF	显微镜配备 Lumenera Infinity 1-2 2.0 百万像素 CMOS 彩色相机和相机软件是 Infinity analyze 版本 6.5.2
层流柜 1300 系列 A2	Thermo Scientific	型号： 1375	任何用于细胞培养工作的层流柜都是合适的
Thermo Scientific 细胞培养箱		型号：370	任何细胞培养箱都适用 - 细胞在潮湿的环境中培养，5% CO2，37 °C
ImageJ	NIH	版本 1.50e	所需的最低版本
Java 运行时环境	Oracle	版本 1.8.0_66	所需的最低版本