使用 ImageJ 插件对细胞计数过程进行自动化定量与分析

摘要

本文介绍了通过两个新开发的开源 ImageJ 插件——细胞浓度计算器（Cell Concentration Calculator）和迁移实验计数器（migration assay Counter），对血细胞计数板图像以及迁移/侵袭显微图像进行定量分析的方法。此外，本文还描述了图像采集与校准的实验方案，并详细讨论了插件的输入参数要求。

摘要

美国国立卫生研究院（NIH）开发的 ImageJ 是一款功能强大且免费的图像处理软件套件。ImageJ 拥有全面的颗粒分析算法，可高效用于计数多种生物颗粒。在对大量细胞样本进行计数时，使用血细胞计数板会因耗时而成为实验瓶颈。同样，利用 ImageJ 插件 Cell Counter 对迁移/侵袭实验中的膜上细胞进行计数虽准确，但工作量极大、主观性强，且因易引发手腕疼痛而广为人知。为解决这一需求，我们在 ImageJ 中开发了两个专用插件，分别用于血细胞计数板（或已知体积）和迁移/侵袭实验的自动化细胞计数。这两个插件均依赖于获取背景干扰极小的高质量显微图像。它们操作简便，专为大规模样本的快速计数与分析而优化，并内置分析工具以辅助计数校准。通过将 Cell Counter 的核心原理与自动化计数算法及计数后分析功能相结合，显著提高了迁移实验处理的便捷性，同时完全不损失准确性。

引言

体外细胞计数是多种组织培养实验中一项重要的基础技术。准确测定培养物中的细胞数量对于实验的可重复性和标准化至关重要^1,2。细胞计数既可通过血细胞计数板进行人工计数，也可采用多种自动化方法，每种方法各有优缺点^3,4,5。大多数自动细胞计数方法属于两类之一：基于库尔特原理或流式细胞术的方法。库尔特计数器利用细胞的电学电阻特性来测定细胞数量和大小，具有快速、准确且比流式细胞仪便宜的优点。然而，由于其成本远高于人工计数，因此很少仅用于细胞计数³。相比之下，流式细胞仪价格昂贵，但具有多种应用，如细胞计数、细胞形态与结构分析以及细胞内标志物的检测^4,5。基于上述两种原理的仪器均可从多家厂商获得。人工计数成本较低，但耗时较长且易受主观偏差影响；而自动化方法虽仅需人工计数所需时间的一小部分，但依赖于昂贵的设备⁶。

其他常见的细胞培养步骤包括 体外 细胞运动能力检测，即细胞迁移与侵袭⁷迁移和侵袭实验常用于研究细胞在趋化性刺激下的运动能力和侵袭性。此外，这些实验也广泛应用于多种细胞类型的胚胎发育、分化、炎症反应以及转移过程的研究。^7-11迁移或侵袭实验中穿过孔径膜的细胞可通过两种不同方法进行定量。第一种方法是用荧光染料对细胞染色，从膜上解离后，使用荧光读板仪进行定量。¹²该定量方法的一个局限性在于，无法保留膜的记录，也无法进行后续分析。¹³第二种定量方法是将迁移或侵袭的细胞固定，并用荧光染料染色，或更常用细胞学染料如结晶紫、甲苯胺蓝或苏木精染色；随后通过倒置显微镜观察这些膜的图像，手动计数细胞，该过程极为耗时。^12,13.

为了克服人工细胞计数的缺点，开发了两种可靠且准确的自动细胞计数器，分别用于细胞浓度测定和迁移实验。这些自动细胞计数算法以 Oracle 公司的 Java 计算机语言编写，作为 ImageJ 的插件。ImageJ 是由美国国立卫生研究院（NIH）开发的一款公开且广泛使用的图像处理工具^14,15；因此，为 ImageJ 开发这些插件有助于其在生物领域中的便捷整合。

与手动计数相比，细胞计数的自动化可确保高通量和可重复性。尽管已有其他可用的软件和插件可通过图像分析来计算细胞浓度^5,16,17，但细胞浓度计算器（Cell Concentration Calculator）插件速度更快，且能够处理细胞稀释和不同处理条件。此外，这两种计数器的所有结果和计算数据均可保存并导出。本文所描述的两个插件已针对相衬显微镜用于活细胞成像，以及利用解剖显微镜进行大视野成像（完整膜捕获）的细胞迁移实验膜进行了优化。这些插件可免费下载，并附有安装说明，获取地址为：http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins。

方案

1. 复合显微镜与相机设置（细胞浓度计算器）

1. 使用光线调节旋钮将灯泡亮度调至最大，切换到4X物镜，并确保选择相衬滤光片。
   注意：任何带有暗背景的组织培养用倒置相差显微镜， 例如， PhP 相衬技术可按照标准显微镜和相机操作流程使用。
2. 在显微镜软件中，将图像采集参数设置为默认值。
   注意：请参考显微镜的用户手册以确定这些设置的位置。
   1. 将“亮度”、“对比度”和“饱和度”设置为100%，“伽马”和“增益”设置为1.0。
      注意：根据软件的不同，“亮度”和“对比度”的默认值可能为0%，而非100%。
   2. 使用可用的最高分辨率（1,600 × 1,200 像素（px）或更高）以黑白模式设置图像采集。
      注意：若无法使用黑白模式，饱和度设置为 0% 即可。
3. 将标准血细胞计数板置于显微镜载物台上，并拍摄如图所示的图像（图1A）；此即“体积校准图像”。根据需要调整曝光时间。

2. 图像体积校准

1. 打开 ImageJ，从 Plugins 菜单启动 Cell Concentration Calculator (CCC) 插件， 例如，插件 > 分析仪 > 细胞浓度计算器
   1. 如果右侧的“图像体积校准”面板不可见，请点击“校准”以显示该面板。
2. 在 ImageJ 中，打开步骤 1.3 中的“体积校准图像”（“文件” > “打开”），然后在 CCC 中点击“获取图像尺寸”按钮。
   注意：这将自动在图像宽度和高度文本框中填入以像素为单位的图像分辨率。
3. 在 ImageJ 中，选择选择工具旁的“直线工具”，并在血细胞计数板的主（P）方格上沿其整个长度画一条直线，如（图1B通过点击并拖动光标来选择。
   1. 按“M”键以显示包含直线测量结果的“结果”窗口。将“长度”列中的数值输入 CCC 的“P-square 长度”文本框中图1B).
   2. 单击“计算图像体积”按钮，将图像体积输出至“图像体积”文本框中。或者，若图像体积已知，可直接在“图像体积”文本框中输入以 nL 为单位的体积值。
4. 点击“保存”按钮。
   注意：插件现已校准。

3. 相机曝光校准

1. 使用血细胞计数板进行细胞计数时，收集细胞后，取 10 μL 细胞悬液加入血细胞计数板的计数室中，并将其置于显微镜载物台上。
2. 沿用步骤 1.2 中的相同设置，调整曝光时间，使血细胞计数板的背景刻度线消失。
   1. 调节焦距，使细胞内部比细胞膜更暗，表明焦平面位于细胞的中央横截面而非细胞两极。
   2. 进一步调整曝光，使细胞未过曝，且形态与（图 1C）中所示相似。
      注意：血细胞计数板刻度线轻微可见是可以接受的。建议保存或记录这些设置，以保证准确性和可重复性。

4. 图像采集

1. 对于每个细胞样品，将 10 μL 加样至血细胞计数板的两个计数室中，以提高统计推断的效力²。将血细胞计数板置于显微镜载物台上进行成像。
   注意：每幅图像的分辨率和放大倍数必须与“体积校准图像”相同。该插件会统计所选文件夹中的所有图像；请将需要一起计数的图像保存在同一文件夹中。
   1. 如果显微镜具备文件名自动递增功能，请开启此功能，并确保拍摄后图像不立即显示，以提高通量。
      注意：手动保存并关闭每幅图像将显著降低操作速度。有关自动递增功能是否可用，请参阅显微镜的用户手册。
   2. 至少拍摄血细胞计数板中央区域三个无重叠的图像，但建议拍摄更多图像（5–10 个）以提高准确性。
      注意：应避免计数室的顶部和底部区域，因为细胞在这两个区域的密度往往较高。每个计数室应拍摄相同数量的图像，这是插件在计数过程中正常运行的必要条件。

5. 图像计数与稀释

1. 在 CCC 中，点击“计数细胞”并观察“选择目录”对话框。选择一个需要计数的文件夹。
2. 选择文件夹后，观察样本数量输入框。输入每个腔室拍摄的图像数量，即 4.1.2，然后点击“确定”。插件现在将按字母顺序对所选文件夹中的所有 jpg、tiff 和 png 图像进行计数。
   注意：点击“样本查看器”按钮将弹出样本查看器窗口，显示已计数样本的相关信息。样本浓度为每个腔室所拍摄的所有图像的平均浓度。可向此列表中添加无量纲浓度的样本，例如添加药物或小分子处理。
   1. 如果同一样本在多次计数中浓度差异显著，则需重新计数细胞样本（见第 4 节）。
      注意：CCC 会自动使用公式 C₁V₁ = C₂V₂ 计算所有已计数样本的稀释量。
3. 以向 96 孔板的 30 个孔中每孔接种 15,000 个细胞（200 μL）并额外预留 1 孔为例：
   1. 将 C2 标签右侧的文本框设置为 15,000，将浓度体积文本框设置为 200，并将相邻的单位下拉框更改为“μL”。
      注意：插件最终将以细胞/mL 为单位计算浓度。
   2. 确保体积下拉框中已选择 V2（终体积），在右侧文本框中输入 6200（200 μL × (30 + 1)），并在体积单位下拉框中选择“μL”。
4. 点击“计算稀释”按钮，将当前输入的稀释参数添加到底部左侧的列表框中。
   注意：每添加一个稀释参数，系统将为每个样本进行计算，并在右侧的树状图中显示。双击每个条目可展开查看。
5. 点击“样本查看器”按钮下方的“保存”按钮，将所有样本数据和稀释参数写入文件。
6. 注意：通过点击“加载”并选择已保存的文件，可随时恢复这些数据。

6. 迁移与侵袭（计数）

1. 采用标准的Boyden小室法进行迁移和侵袭实验^7-9。
2. 细胞迁移/侵袭完成后，将小室倒置并轻轻敲击，小心移除插入物内的培养基。用滤纸边缘轻轻接触膜底部，吸除附着的多余液体。
   注意：切勿让膜本身接触滤纸，以免扰动已黏附的细胞。
3. 按照已有文献报道的方法^7-9对细胞进行固定和染色，使用24孔板，每行各孔分别加入约500 µl的不同溶液，例如，固定液、染色液1、染色液2和双蒸水（ddH₂O）。另准备一块板，每孔加入1×PBS，用于放置小室在切割前的暂存。
4. 将小室放入盛有ddH₂O的孔中进行洗涤，并向小室内加入ddH₂O。洗涤后通过倒置排出液体，再进行擦除操作。
5. 使用干净的棉签小心擦除膜上表面未迁移或未侵袭的细胞，注意不要损伤膜，尤其需彻底清洁膜的边缘区域。
6. 用剃刀或手术刀将膜切下，并小心地将膜（底面朝上）转移至洁净的玻璃载片上。
7. 在膜的下方和上方各加一滴封片液，并用盖玻片覆盖。
   注意：应避免封片液中产生气泡，以确保细胞计数的准确性。

7. 内窥镜与摄像头设置

1. 打开显微镜的光源和相机。
   注意：详细操作步骤请参考显微镜的用户手册。
2. 在显微镜软件中，将图像采集设置为默认值。
   注意：如果软件具有平均功能，建议设置为四。这在平均程度与图像采集时间之间达到了良好平衡。同样，轻微的锐化可能提高图像保真度。
   1. 将“亮度”、“对比度”和“饱和度”设置为100%，将“伽马值”和“增益”设置为1.0。
      注意：根据软件不同，“亮度”和“对比度”可能默认为0%而非100%。
   2. 将显示（实时）分辨率和采集分辨率均设为最大值（分别为1,600 × 1,200 px和2,592 × 1,944 px）。
      注意：若刷新率过慢，可根据需要调整显示分辨率。较低的分辨率会使精确对焦更加困难，但可提高刷新率。
3. 对于解剖显微镜的载物台，应使用纯白色背景；黑色或玻璃背景均不适用。
4. 使用载物台上方的光源，最好采用位于载物台左右两侧的两个可调节LED灯。
   注意：载物台下方的光源会照亮迁移实验膜上的孔隙，可能对后续计数的准确性产生负面影响。
5. 将已完成的迁移实验膜玻片放置于载物台上。观察软件显示的实时图像，调节变焦旋钮，使单个膜的边缘恰好位于相机视野范围内。
   注意：将玻片置于白色背景载物台上的玻璃板上，有助于在成像过程中更方便地移动玻片。
6. 调节光源位置（7.6.1）和曝光时间，尽可能接近还原图2A所示的理想图像。根据亮度不同，5–60 ms的曝光时间通常已足够。
   注意：目标是尽可能减少背景颜色，获得均匀照明的膜图像，同时不降低图像保真度，即避免过度曝光导致可见细胞丢失。
   1. 将左右光源以较低角度对准玻片。这有助于消除背景染色和色差。尽量使两个光源彼此正对。
      注意：在调节每个光源位置时，关闭另一个光源。这有助于更轻松、准确地将照明区域中心对准膜本身。
7. 取下玻片，并通过显微镜软件中的单次点击完成图像白平衡。
   注意：此时显微镜已完成校准。尽可能保存所有设置以供将来使用，并记录光源的位置和强度。

8. 图像采集与平场校正

1. 在软件中设置图像保存文件夹位置，并为每张膜拍摄一张图像。图像命名需遵循以下通用模板：名称 - ###，例如，Control - 001.tif、Control - 002.tif、Test drug - 001.tif，依此类推。
   注意：为获得最佳图像效果，建议将图像文件类型保存为 TIFF 格式，而非 JPEG 等有损压缩格式。
   注意：未遵循通用命名模板的图像仍将被计入，但不会进行自动分组和背景场校正。
   1. 若需进行背景场校正，需为每张玻片寻找一个空白区域，并按照命名规范拍摄一张空白图像：名称 - Blank。
      注意：空白区域指玻片上无膜的部分，用于代表背景光照情况。
   2. 在成像前立即通过按压盖玻片使每张膜平整，并尽可能去除夹带的气泡。
2. 在 ImageJ 中，进入 Plugins 菜单并打开 TC 插件；例如，Plugins > Analyze > 'Transwell Counter'。
3. 在 TC 插件中，点击“Flatfield”按钮，此时将弹出“Choose Directory”对话框。选择保存膜图像的文件夹。
   注意：只有按照上述通用模板命名的图像才会被自动进行背景场校正，并保存在所选文件夹内新建的名为 Flatfield 的子文件夹中。背景场校正图像示例见图 2B。

9. 配置设置

1. 在 ImageJ 中打开迁移实验膜图像（“文件” > “打开”），然后选择图像 > 调整 > “颜色阈值…”。观察颜色阈值窗口，调整将从图像中滤除的颜色。
   1. 在窗口底部，将阈值方法设置为“Shanbhag”，阈值颜色设置为“白色”，颜色空间设置为“RGB”（红绿蓝）；如果已选中“暗背景”，请取消勾选。
   2. 通过单击并拖动滑块，将上方滑块设置为 0，下方滑块设置为 255（下方滑块保持在 255）。确保图像完全变为白色。
2. 调整绿色和红色的上方滑块，直到仅细胞核可见。
   注意：所选设置将完全取决于所使用的细胞染色方法。参见图 2C。
3. 在 TC 插件中，将 RGB 上方滑块的数值输入到相应配置设置的“RGB 阈值”文本框中。点击“添加/修改”按钮，覆盖当前配置。
   1. 将大小范围的下限和上限值保持为 1 - 无穷大。
4. 在配置设置面板中，点击“保存”以将设置写入硬盘。

10. 图像计数与校准

1. 打开 TC 插件（8.2），点击“Count Folder”，观察“选择目录”对话框。选择要计数的文件夹，并等待其完成计数。
2. 每个已计数的样本将自动添加到主表中。关键列包括“Count”（计数）、“Quality”（质量）和“Calibrate?”（是否需要校准？）。
   注：未校准的“Count”是指在“Area range”（面积范围）列所示区域内每张膜上的颗粒数量。
   注：“Quality”值范围约为 -0.8 至 1.7；Q ≥ 0.5 视为可接受。
   1. 若某图像因其接近理想指标而被标记为需要校准，则在“Calibrate?”列中会显示一个对勾。
      注：质量和校准建议均可能提示当前设置可能不足。若在正确选择了“Color Thresholding”（颜色阈值）和“Size Ranges”（尺寸范围）后仍建议进行校准，则应通过检查原始图像与计数结果图像来最终判断计数的有效性。
3. 选中表格中所有被标记为需要校准的样本。
   1. 在表格中右键单击，选择 Recount > 'Suggested size'（建议尺寸）。此操作将使用建议的最小颗粒面积重新计数图像。
   2. 再次右键单击，选择“Show Plot”（显示图表）。观察颗粒面积的频率散点图。理想图像的图形应类似于右偏长尾的正态分布，i.e., 钟形曲线。参见 图 3B。
   3. 如有需要，可通过选中样本后右键单击，选择 Recount > 'Manual settings'（手动设置），调整下限“Size Range”（尺寸范围）。观察弹出的手动设置对话框，输入所需参数后点击“Count”按钮，以新设置重新计数图像。
4. 如需手动调整计数结果，请先选中样本，在表格中右键单击，然后选择“Open image with counts”（打开带计数标记的图像）。观察原始图像，其中红色标记代表插件识别出的每一个颗粒。
   注：使用 Recount > 'Show counted binary image'（显示已计数的二值图像）有助于检查颜色阈值对单个细胞的分辨效果。
   1. 如需添加计数，请按住 'Ctrl' 键并左键单击。光标位置将出现一个标记，并计入样本的总数量中。如需删除标记，请右键单击图像，插件将移除距离光标最近的标记。
   2. 如需删除一组标记，请在 ImageJ 中使用选区工具选择一个感兴趣区域（ROI）。在按住 'Ctrl' 键的同时右键单击图像，ROI 内的所有标记将被移除。观察“Count”列中的细胞数量变化。

11. 保存/打开结果并导出为 CSV

1. 在 TC 中，转到菜单栏并点击“文件” >“保存结果”。观察“保存结果”对话框，选择文件名和保存位置，然后点击“保存”。
   1. 使用“文件” >“打开结果”来加载包含主表格中所有数据显示（包括图表）的文件。
      注意：结果文件会保存图像所在的目录。如果在保存后移动了原始图像文件，“打开原始图像”和“打开带计数的图像”功能将无法使用。
   2. 要重置图像目录，请选中样本，在表格上单击右键，然后选择“重置图像目录”。观察“选择目录”对话框，选择新的文件夹；如果图像存在，目录将被重置。请重新保存结果文件。
2. 要保存为逗号分隔值（CSV）文件，请在菜单栏中选择“文件” >“导出为 .csv”。此操作将生成一个文件，其中样本按统计组组织，并包含平均计数值和平均值的标准误差；其布局设计便于在常用绘图软件中快速作图。
   注意：统计组基于在 TC 中创建的组。
   1. 如果样本遵循通用的命名模板，请选中需要分组的样本，右键单击并选择“自动分组”。此功能会将具有相同“名称”的样本归入同一组。例如，Control - 1、Control - 2、Treatment - 1、Treatment - 2：两个对照样本将被归入“Control”组，处理样本归入“Treatment”组。
   2. 通过双击样本的“组”单元格并输入组名，可手动将样本添加到组中。选中要加入该组的样本，右键单击并选择“添加到组”。

结果

细胞浓度计算器

图1展示了CCC校准和可计数图像获取的整体流程。图1A和1B分别显示了P方格校准图像及P方格像素长度的计算。CCC通过以下公式计算给定体积中的细胞浓度：

血细胞计数板的P区体积为100 nL（1 mm × 1 mm × 0.1 mm），基于此恒定值，可通过将像素转换为毫米后计算出图像的总体积。 图1C 是一幅理想的可计数图像，其中细胞聚焦清晰，呈现出特征性的相差照明效果，且无背景血细胞计数板刻度干扰。最后，该散点...

讨论

关键步骤、故障排除与局限性

自动计算方法（特别是颗粒分析方法）的本质要求具备用数学方式定义这些颗粒的能力。因此，细胞浓度计算器和迁移实验计数器的准确性在很大程度上依赖于图像保真度，即所捕获的图像与细胞样本或迁移实验膜的相似程度。因此，尽可能严格遵循显微镜及相关软件的校准规程至关重要。这包括降低背景噪声、减少不需要的颗粒、获取明亮且焦距均匀的图像，并以无损文件格式（如 tiff）保存图像。如果未能满足上述要求，这两个插件均可能产生错误结果。因此，当结果存疑时，始终建议重新核对细胞计数，以确认其是否符合视觉预期。若结果确实不符，将原始图像与二值图像进行比较可能有助于查明问题所在（参见第10.4条说明）。在某些情况下，较暗的迁移实验图像中可能存在大范围区域因像素值落在颜色阈值范围内而被误计数。通常情况下，使用平场校正图像可消除明暗不均和斑驳现象，防止因色素不均导致的大多数非预期计数。

鉴于这些可能且相对常见的问题，遵循标准的图像完整性指南非常重要，例如《自然》出版集团及其他机构提出的指南¹³。为了保持计数的一致性，对...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HyClone 经典液体培养基：RPMI 1640 - 含 L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	SH3002702	细胞培养基
胎牛血清（FBS）	GIBCO BRL	P00015	培养基补充剂
HTR8/SVneo 滋养层细胞系	细胞由查尔斯·格雷厄姆博士（Queen’加拿大金斯顿，皇后大学		软件设计适用于任何细胞系。
胰蛋白酶	GIBCO BRL	27250-018	以 10 中 0.20%（w/v）配制 µM EDTA 1x PBS
Accutase	创新细胞技术	AT104
10 cm 细胞培养板	SARSTEDT	833902	任何经过组织培养处理的培养板均可使用
Transwell 聚酯膜小室 - 8.0 µm 孔径	从赛默飞世尔科技公司订购的 Costar 3422	7200150	对于24孔板；孔径：8.0 µm；6.5 mm 直径；0.33 cm2 生长区域
HARLECO 血液学染色剂与试剂，EMD Millipore - 溶液 1、2 &和 3	EMD Millipore，由 VWR 订购	65044A, B, &和 C	Hemacolor 染色套装包含三个 500 ml（16.9 oz.）聚乙烯瓶 &以及包含甲醇固定剂（溶液1）、伊红或酸性染料（溶液2）和亚甲蓝或碱性染料（溶液3）
棉签	Puritan Medical	806-WC
单边工业剃须刀片	VWR	55411 - 055	厚度：0.30 mm（0.012")
显微镜载玻片 - 预清洁/普通	Fisher Scientific	12550A3	尺寸：25 mm × 75 mm × 1.0 mm
Fisherbrand 盖玻片 - 长方形，1 号	Fisher Scientific	12-545E	厚度：0.13 至 0.17 mm；尺寸：50 mm × 22 mm
Fisher Chemical Permount 封片介质	Fisher Scientific	SP15-500
徕卡体视解剖显微镜	Leica Microsystems		显微镜配备了徕卡MC170 HD型号显微镜相机 &且相机软件为 Leica App. Suite (LAS E2) 版本 3.1.1 [构建版本：490]。显微镜部件：  LED3000 点光源照明装置型号：MEB126，Leica M80 光学载具型号 M80，1.0X 消色差物镜，工作距离=90 mm 型号：MOB306 & 目标消色差物镜 0.32X，工作距离=303 mm 型号：MOB315，视频物镜 0.5X 型号：MTU-293
血细胞计数板	助理 德国		0.100 mm 深度 - 0.0025 mm2
奥林巴斯倒置光学显微镜	奥林巴斯株式会社	CKX41SF	显微镜配备有Lumenera Infinity 1-2摄像头 200万像素CMOS彩色相机 & 相机软件为 Infinity analyze 版本 6.5.2
1300系列A2型层流柜	赛默飞世尔科技	型号：1375	任何用于细胞培养操作的层流净化台均适用
细胞培养箱	赛默飞世尔科技	型号：370	任何细胞培养箱均可使用——细胞在加湿环境、5% CO₂条件下培养2, 37 °C
ImageJ	美国国立卫生研究院	版本 1.50e	最低版本要求
Java运行时环境	Oracle	版本 1.8.0_66	最低版本要求