一种简便高效的可逆二硫键交联胶束制备方法

摘要

为了以高特异性将抗癌药物递送至肿瘤部位并减少副作用，需要基于纳米颗粒的新方法。本文描述了可通过过氧化氢介导的氧化反应简便制备的二硫键交联胶束，该胶束在还原性的肿瘤微环境中能有效解离，从而释放所载药物。

摘要

纳米医学是一种新兴的治疗方法，它利用尺寸在纳米级的颗粒所具有的独特性质，将其应用于生物医学领域。提高药物递送效率以最大化治疗效果并减少药物相关副作用，是当今纳米医学的重要基石之一。特别是纳米颗粒在癌症治疗中已得到广泛应用。那些能够根据肿瘤微环境在设计、应用和生产方面提供高度灵活性的纳米颗粒，有望实现更高效的治疗，并快速转化为临床实践。聚合物胶束纳米载体是药物递送应用中的常用选择。

本文介绍了一种简单且高效的合成载药型二硫键交联胶束的方法，该胶束基于结构明确的两亲性线性-树形共聚物（端粒树形聚合物，TD）的自组装特性制备而成。TD由聚乙二醇（PEG）作为亲水性链段，以及通过溶液相肽化学方法逐步连接至氨基封端PEG上的巯基化胆酸簇作为疏水性成核部分构成。化疗药物如紫杉醇（PTX）可通过标准的溶剂蒸发法进行负载。此前曾采用O₂介导的氧化反应，将TD分子上自由的巯基在胶束内部形成二硫键交联结构，但该反应速度较慢，难以实现大规模生产。近期研究探索了H₂O₂介导的氧化方法，作为一种更可行且高效的替代方案，其反应速率比先前报道的方法快96倍。利用该方法，已成功制备出50克载PTX的二硫键交联纳米颗粒，产物具有较窄的粒径分布和高载药效率。通过在含有去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）并添加或不添加还原剂的破坏性条件下共孵育，对所得胶束溶液的稳定性进行分析。与未交联的胶束相比，载药型二硫键交联胶束表现出更低的溶血活性。

引言

纳米技术是一个快速发展的领域，已使多个生物医学领域受益¹。纳米颗粒为设计和调控其他传统治疗方法无法实现的特性提供了可能。纳米载体可增强药物对抗生物降解的稳定性，延长药物在体内的循环时间，克服药物溶解度问题，并可精确调控以实现靶向药物递送及与成像剂的共递送^1,2。基于纳米颗粒的递送系统在癌症成像和治疗方面展现出巨大前景。肿瘤血管具有通透性，可使大分子物质渗漏，从而通过增强的渗透性和滞留效应（EPR效应）促使循环中的纳米颗粒在肿瘤部位选择性积聚³。在多种正在积极研究用于抗癌药物递送的纳米载体（例如，脂质体、水凝胶和聚合物胶束）中，聚合物胶束在过去十年中获得了广泛的关注^4,5。

聚合物胶束是一种热力学系统，静脉给药后可能被稀释至临界胶束浓度（CMC）以下，从而解离为单体分子。已采用交联策略以尽量减少胶束解离成单体。然而，过度稳定的胶束可能阻碍药物在靶部位的释放，从而降低整体治疗效果。已有多种化学方法被探索用于实现交联结构在氧化还原环境或外部刺激下的可降解性，例如可还原的二硫键^6,7以及pH可裂解⁸或可水解的酯键^9,10。

我们先前已报道过由树状胆酸（CA）嵌段与线性聚乙二醇（PEG）共聚物组成的胶束纳米颗粒的设计与合成，此类共聚物被称为端树状大分子（telo....

方案

伦理声明：购入6至8周龄的雌性裸鼠（Nu/Nu品系），根据AAALAC指南在无病原体条件下饲养，并在进行任何实验前至少适应环境4天。所有动物实验均遵循机构指南，并依照加州大学戴维斯分校动物使用与护理管理咨询委员会批准的第07-13119号和第09-15584号实验方案进行。

1. TD PEG^5K-Cys₄-Ebes₈-CA₈ 的合成

1. 在圆底烧瓶中，将 MeO-PEG^5K-NH₂（2 g，0.4 mmol）溶于 10–20 ml 无水二甲基甲酰胺（DMF）中，并置于冰上冷却。
2. 在玻璃烧杯中，将 3 当量的 1-羟基-6-氯苯并三唑（HOBt）、3 当量的 N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）和 3 当量的 (Fmoc)₂Lys-OH 溶于无水 DMF（10–15 ml）中。在磁力搅拌器上搅拌 15–20 分钟。
3. 将上述混合液加入含有 MeO-PEG^5K-NH₂ 的反应烧瓶中。撤去冰浴，室温下搅拌反应混合物过夜。
4. 通过薄层色谱法（TLC）¹⁶ 和凯撒试验¹⁷ 确认反应完成（黄色表明无游离 NH₂）。向反应烧瓶中加入约 ....

结果

载药二硫键交联胶束的制备与表征

两亲性聚合物 PEG^5K-Cys₄-Ebes₈-CA₈ 是一种树状聚合物，能够形成二硫键交联的胶束体系，用于癌症药物递送。从结构上看，该聚合物由胆酸的树状寡聚体（疏水区域）通过支化的聚（赖氨酸-半胱氨酸-Ebes）骨架连接至线性 PEG 分子（亲水区域，分子量为 5K）的一端构成。相较于其他已报道的胶束体系，此类嵌段共聚物具有多项优势：第一，可通过逐步溶液相缩合反应便捷地合成；第二，与其他多种已报道的两亲性聚合物相比，通过成熟的溶液相逐步 Fmoc 肽化学法制备的含巯基聚合物体系具有明确的结构，可制成冻干粉末储存，且具有较长的保质期。

可采用多种技术对终产物进行表征。通过比较¹H NMR谱图中聚乙二醇（PEG）上的质子信号与.......

讨论

已有多种纳米颗粒被研究用于药物递送的潜在应用。脂质体阿霉素和紫杉醇（PTX）负载的人血清白蛋白纳米聚集体是已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于癌症治疗的纳米药物之一。然而，尽管这些纳米药物在临床上有效，但它们的粒径相对"较大"，且倾向于在肝脏和肺部蓄积。具有相对较小粒径和较高载药能力的聚合物胶束正成为新兴的药物递送纳米载体。其独特的核-壳结构通过物理包封的方式在水相环境中“增溶”疏水性药物分子。由本实验室制备的结构明确的TD组成的聚合物胶束可形成单一分散的纳米颗粒（粒径10–50 nm），具有较长的储存稳定性和高效的药物包封能力。这种稳定的TD平台众多优势之一在于聚合物的多功能性。多种药物、荧光染料以及靶向配体均可被便捷地整合到TD平台中^13,15,24。

方案中的关键步骤

我们开发了一种稳定、可逆、通过二硫键交联的胶束系统用于紫杉醇（PTX）递送，该系统结构明确，粒径约为27 nm，且具有较窄的尺寸分布。TDs通过逐步溶液相肽化学方法合成。这些T.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MeO-PEG5K-NH2	Rapp Polymere	125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH	Aaptec	AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Anaspec	AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Aapptec	AAC105
二甲基甲酰胺	菲舍尔科技	BP1160-4
乙醚	菲舍尔科技	E134-20
N,N-二异丙基乙胺	西格玛-奥德里奇	D125806
三氟乙酸	西格玛-奥德里奇	T6508	腐蚀性，小心操作
4-甲基哌啶	阿尔法-埃萨	L-02709
Ebes接头	Anaspec	AS-61924
胆酸	西格玛-奥德里奇	C1129
1,2-乙二硫醇	西格玛-奥德里奇	02390	在通风橱内操作。使用后用漂白剂处理手套。
三异丙基硅烷	西格玛-奥德里奇	233781
氯仿（无水）	西格玛-奥德里奇	288306
30%过氧化氢溶液	Aaron Industries	NA
HoBt-Cl	Aaptec	CXZ096
DIC	西格玛-奥德里奇	D125407
雌性裸鼠（Nu/Nu品系），6–8周龄	Harlan（加利福尼亚州利弗莫尔）