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一种简便高效的可逆二硫键交联胶束制备方法

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DOI：

10.3791/54722

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2016年12月23日

 ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

本文内容

摘要

为了以高特异性将抗癌药物递送至肿瘤部位并减少副作用，需要基于纳米颗粒的新方法。本文描述了可通过过氧化氢介导的氧化反应简便制备的二硫键交联胶束，该胶束在还原性的肿瘤微环境中能有效解离，从而释放所载药物。

摘要

纳米医学是一种新兴的治疗方法，它利用尺寸在纳米级的颗粒所具有的独特性质，将其应用于生物医学领域。提高药物递送效率以最大化治疗效果并减少药物相关副作用，是当今纳米医学的重要基石之一。特别是纳米颗粒在癌症治疗中已得到广泛应用。那些能够根据肿瘤微环境在设计、应用和生产方面提供高度灵活性的纳米颗粒，有望实现更高效的治疗，并快速转化为临床实践。聚合物胶束纳米载体是药物递送应用中的常用选择。

本文介绍了一种简单且高效的合成载药型二硫键交联胶束的方法，该胶束基于结构明确的两亲性线性-树形共聚物（端粒树形聚合物，TD）的自组装特性制备而成。TD由聚乙二醇（PEG）作为亲水性链段，以及通过溶液相肽化学方法逐步连接至氨基封端PEG上的巯基化胆酸簇作为疏水性成核部分构成。化疗药物如紫杉醇（PTX）可通过标准的溶剂蒸发法进行负载。此前曾采用O2介导的氧化反应，将TD分子上自由的巯基在胶束内部形成二硫键交联结构，但该反应速度较慢，难以实现大规模生产。近期研究探索了H2O2介导的氧化方法，作为一种更可行且高效的替代方案，其反应速率比先前报道的方法快96倍。利用该方法，已成功制备出50克载PTX的二硫键交联纳米颗粒，产物具有较窄的粒径分布和高载药效率。通过在含有去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）并添加或不添加还原剂的破坏性条件下共孵育，对所得胶束溶液的稳定性进行分析。与未交联的胶束相比，载药型二硫键交联胶束表现出更低的溶血活性。

引言

纳米技术是一个快速发展的领域，已使多个生物医学领域受益1。纳米颗粒为设计和调控其他传统治疗方法无法实现的特性提供了可能。纳米载体可增强药物对抗生物降解的稳定性，延长药物在体内的循环时间，克服药物溶解度问题，并可精确调控以实现靶向药物递送及与成像剂的共递送1,2。基于纳米颗粒的递送系统在癌症成像和治疗方面展现出巨大前景。肿瘤血管具有通透性，可使大分子物质渗漏，从而通过增强的渗透性和滞留效应（EPR效应）促使循环中的纳米颗粒在肿瘤部位选择性积聚3。在多种正在积极研究用于抗癌药物递送的纳米载体（例如，脂质体、水凝胶和聚合物胶束）中，聚合物胶束在过去十年中获得了广泛的关注4,5。

聚合物胶束是一种热力学系统，静脉给药后可能被稀释至临界胶束浓度（CMC）以下，从而解离为单体分子。已采用交联策略以尽量减少胶束解离成单体。然而，过度稳定的胶束可能阻碍药物在靶部位的释放，从而降低整体治疗效果。已有多种化学方法被探索用于实现交联结构在氧化还原环境或外部刺激下的可降解性，例如可还原的二硫键6,7以及pH可裂解8或可水解的酯键9,10。

我们先前已报道过由树状胆酸（CA）嵌段与线性聚乙二醇（PEG）共聚物组成的胶束纳米颗粒的设计与合成，此类共聚物被称为端树状大分子（telodendrimers, TD）。11-15这些TD以PEG表示nK-CAy（其中 n = 以千道尔顿为单位的分子量（K），y = 胆酸（CA）单元的数量）。这类物质具有体积小、保存期长以及在疏水核心中高效包载药物（如紫杉醇（PTX）和多柔比星（DOX））的特点。TD 的构建单元（如 PEG、赖氨酸和 CA）具有良好的生物相容性，且 PEG 冠状结构的存在可赋予其 "隐匿" 纳米颗粒特性，防止胶束纳米颗粒被网状内皮系统非特异性摄取。

通过在标准TD的树状寡聚赖氨酸骨架中引入半胱氨酸，可轻松制备巯基化线性-树状聚合物。本文介绍了一种简便的制备方法，通过在TD的疏水核心中引入二硫键交联，从而构建可逆交联的胶束药物递送系统（图1）。

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方案

伦理声明：购入6至8周龄的雌性裸鼠（Nu/Nu品系），根据AAALAC指南在无病原体条件下饲养，并在进行任何实验前至少适应环境4天。所有动物实验均遵循机构指南，并依照加州大学戴维斯分校动物使用与护理管理咨询委员会批准的第07-13119号和第09-15584号实验方案进行。

1. TD PEG5K-Cys4-Ebes8-CA8 的合成

  1. 在圆底烧瓶中，将 MeO-PEG5K-NH2（2 g，0.4 mmol）溶于 10–20 ml 无水二甲基甲酰胺（DMF）中，并置于冰上冷却。
  2. 在玻璃烧杯中，将 3 当量的 1-羟基-6-氯苯并三唑（HOBt）、3 当量的 N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）和 3 当量的 (Fmoc)2Lys-OH 溶于无水 DMF（10–15 ml）中。在磁力搅拌器上搅拌 15–20 分钟。
  3. 将上述混合液加入含有 MeO-PEG5K-NH2 的反应烧瓶中。撤去冰浴，室温下搅拌反应混合物过夜。
  4. 通过薄层色谱法（TLC）16 和凯撒试验17 确认反应完成（黄色表明无游离 NH2）。向反应烧瓶中加入约 200 ml 冰乙醚，使聚合物产物 1（MeO-PEG5K-Lys(NH-Fmoc)2）沉淀。通过离心分离沉淀的聚合物（6,000 × g，4 °C，离心 6 分钟）。
    1. 进行 TLC 时，将样品点样于硅胶涂层的 TLC 板上。以二氯甲烷/甲醇（9:1）作为流动相。展开 TLC 板后，在紫外灯下观察斑点。也可使用茚三酮显色试剂在加热板上显色以观察胺基斑点。
    2. 进行凯撒试验时，取少量样品加入含有凯撒试剂的玻璃试管中。在 100 °C 下加热 5 分钟，观察颜色变化（若溶液保持黄色，则反应已完成）。
  5. 将产物重新溶于无水 DMF（10–20 ml），重复沉淀和离心操作（见步骤 1.4）。
  6. 重复步骤 1.5，然后用冰乙醚洗涤聚合物沉淀三次。
  7. 将聚合物沉淀 1 转移至洁净的反应烧瓶中，并将烧瓶连接至高真空系统以除去残留乙醚。
  8. 配制并加入约 20–30 ml 的 20%（v/v）4-甲基哌啶 DMF 溶液至聚合物中间体 1 中。搅拌至完全溶解，反应持续 3 小时。
  9. 进行 TLC16 和凯撒试验（蓝色表明存在游离 NH2）17（见步骤 1.4）以确认反应完成。若反应完成，则按产物 1 的方法进行乙醚沉淀（步骤 1.4–1.6）。
  10. 在真空条件下干燥聚合物产物 2（MeO-PEG5K-Lys(NH2)2）。
  11. 对中间体 2 再进行一轮 (Fmoc)2Lys-OH 偶联反应（步骤 1.1–1.7），生成产物 3（MeO-PEG5K-Lys(Lys(NH-Fmoc)2)2）。脱除 Fmoc 保护基（步骤 1.8–1.10），得到 4（MeO-PEG5K-Lys(Lys(NH2)2)2），再进行偶联反应（步骤 1.1–1.7）引入 (Fmoc)Lys(Boc)-OH，生成在 PEG 链一端带有四个 Boc 和 Fmoc 保护基的第三代树枝状聚赖氨酸 5（MeO-PEG5k-Lys-Lys2-((Fmoc)Lys(Boc))4）。
  12. 将所得聚合物中间体 5 转移至反应烧瓶中。另取一个反应烧瓶，配制体积比为 1:1 的三氟乙酸（TFA）/二氯甲烷（DCM）溶液。向聚合物中间体 5 中加入 15–20 ml 的 1:1 TFA/DCM（v/v）混合液。搅拌至聚合物完全溶解，继续搅拌 3 小时。
  13. 进行 TLC16 和凯撒试验（蓝色表明存在游离 NH2）17（见步骤 1.4）以确认反应完成。若反应完成，用空气吹扫 TFA/DCM 中的聚合物溶液，直至形成粘稠溶液。按产物 1 的方法进行乙醚沉淀（步骤 1.4–1.6）。在真空条件下干燥聚合物产物 6（MeO-PEG5k-Lys-Lys2-((Fmoc)Lys(NH2))4）。
  14. 将聚合物中间体 6 转移至反应烧瓶中。用约 40 ml 含 8 当量 N,N-二异丙基乙胺（DIEA）的无水 DMF 溶解中间体 6。在玻璃烧杯中，将 12 当量 HOBt、12 当量 DIC 和 12 当量 (Fmoc)Cys(Trt)-OH 溶于 20–25 ml 无水 DMF 中。振荡 10–15 分钟后，将反应混合物加入含 6 的反应烧瓶中。反应过夜进行。
  15. 通过 TLC16 和凯撒试验（见步骤 1.4；黄色表明无游离 NH2）17 确认反应完成。若反应完成，则按产物 1 的方法进行乙醚沉淀（步骤 1.4–1.6），分离产物 7（MeO-PEG5K-Lys-Lys2-((Fmoc)Lys-((Fmoc)Cys(Trt)))4）。
  16. 按照步骤 1.8 所述方法对产物 7 进行 Fmoc 脱保护，得到产物 8（PEG5K-Lys-Lys2-(Lys(NH2)-(Cys(NH2)(Trt)))4）。使用上述 HOBt/DIC 介导的偶联方法，将 (Fmoc)-PEG2-Suc-OH（"Ebes" 连接子，24 当量）偶联至聚合物中间体，得到中间体 9（MeO-PEG5K-Lys-Lys2-Lys4-(Cys(Trt))4(Ebes(NH-Fmoc))8）。
  17. 再进行一轮 Fmoc 脱保护（步骤 1.6–1.8），得到中间体 10（MeO-PEG5K-Lys-Lys2-Lys4-(Cys(Trt))4(Ebes(NH2))8）。
  18. 将聚合物中间体 10 转移至反应烧瓶中，加入无水 DMF（约 30–40 ml）溶解。在另一反应烧瓶中，将 24 当量 CAOSu（按先前发表的方法制备）溶于无水 DMF（20–30 ml）18。加入 48 当量 N,N-二异丙基乙胺，搅拌 10–15 分钟。将溶液转移至含 10 的反应烧瓶中，反应过夜进行。
  19. 通过 TLC16 和凯撒试验（见步骤 1.4；黄色表明无游离 NH2）17 确认反应完成。若反应完成，则按产物 1 的方法进行乙醚沉淀（步骤 1.4–1.6），分离产物 11（MeO-PEG5K-Lys-Lys2-Lys4-(Cys(Trt))4-Ebes8-CA8）。将产物在去离子水中透析，并冷冻干燥得到白色粉末。
  20. 将聚合物中间体 11 置于反应烧瓶中。配制并加入 20 ml TFA/1,2-乙二硫醇（EDT）/三乙基硅烷（TIS）/H2O（94/2.5/1/2.5，v/v）混合液至聚合物溶液中。搅拌至完全溶解，反应持续 4 小时。通过 TLC16 确认反应完成。
  21. 在通风橱中，向聚合物-TFA/EDT/TIS/H2O 混合液中通入空气，直至溶液变粘稠。按产物 1 的方法进行乙醚沉淀（步骤 1.4–1.6），分离最终产物 12（PEG5K-Cys4-Ebes8-CA8）。将其溶于乙腈中，冷冻干燥得到白色粉末。

2. 制备载紫杉醇的胶束

  1. 采用标准蒸发法制备载有紫杉醇（PTX）的 PEG5K-Cys4-Ebes8-CA8 胶束。
    1. 将20 mg TD与不同量的PTX（1–9 mg）溶解于1 ml氯仿（CHCl3）中。使用旋转蒸发仪除去溶剂，得到均匀的干燥聚合物薄膜。加入1 ml磷酸盐缓冲液（PBS），通过涡旋重新分散薄膜，必要时在40 kHz条件下超声30分钟，以形成载药胶束。
    2. 加入6 µl 3%（w/w）H2O2（相当于游离巯基的等摩尔量），以氧化TD上的巯基。当Ellman法检测显示游离巯基含量保持在稳定低水平时，即可将胶束溶液用于后续表征19。
    3. 使用0.22 µm滤膜过滤溶液，以实现样品灭菌。通过加入9倍体积的乙腈并超声10分钟释放胶束中的药物后，采用HPLC20系统分析胶束中的载药量。HPLC分析使用C18色谱柱，以乙腈/水作为流动相。
    4. 根据HPLC峰面积与药物标准品浓度之间的标准曲线计算载药量。
      注：载药效率定义为胶束中实际载药量与初始投药量的比值11。

3. 胶束的表征

  1. 使用动态光散射（DLS）仪器测量胶束的粒径及其分布29。在室温下进行测量，并将胶束浓度保持在 1 mg/ml。
    注意：进行粒径分析时，以 PBS 作为空白对照，然后记录实际样品的粒径。每个样品测量三次，取平均值。
  2. 采用荧光光谱法测定 PEG5K-Cys4-Ebes8-CA8 在以芘作为疏水性荧光探针交联前后的临界胶束浓度（CMC），方法如前所述13,21。
    注意：通常胶束浓度范围为 5×10-7 至 5×10-4 M。

4. 在含或不含还原剂的 SDS 中胶束的稳定性

  1. 在 PBS 中配制十二烷基硫酸钠 (SDS) 溶液（7.5 mg/ml）和二硫键交联胶束（1.5 mg/ml）的储备液。随后，使用上述储备液配制混合溶液，使最终 SDS 浓度为 2.5 mg/ml，胶束浓度为 1.0 mg/ml。
  2. 在预设的时间点，测量胶束溶液的粒径及粒径分布（如步骤 3.1 所述），可选择是否添加 10 mM 谷胱甘肽（GSH）。

5. 溶血实验

  1. 采用先前发表的方法11制备载紫杉醇的非交联胶束（PTX-NCMs）和载紫杉醇的交联胶束（PTX-DCMs），并利用裸鼠尾静脉采集的新鲜枸橼酸抗凝血评估其溶血潜力。
    1. 将血液样本（1.0 ml）在1,000 × g条件下离心10分钟以收集红细胞，用PBS洗涤3次，然后用PBS重悬细胞沉淀，最终浓度为2%。
  2. 分别将200 µl红细胞悬液与不同浓度（0.2 和 1.0 mg/ml）的PTX-NCMs和PTX-DCMs混合，在37 °C摇床中孵育4小时。
  3. 将胶束-红细胞混合物在3,000 × g条件下离心5分钟。取各样品上清液100 µl转移至96孔板中。使用酶标仪在540 nm处测定上清液中游离血红蛋白的吸光度。
    注意：分别以含Triton-100（2%）和PBS的红细胞作为阳性对照和阴性对照。红细胞溶血率按以下公式计算：红细胞溶血率 = (OD样品 - OD阴性对照) / (OD阳性对照 - OD阴性对照) × 100%。

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结果

载药二硫键交联胶束的制备与表征

两亲性聚合物PEG5K-Cys4-Ebes8-CA8是一种树状聚合物，能够形成二硫键交联的胶束系统，用于癌症药物递送。从结构上看，该聚合物由胆酸的树状寡聚体（疏水区）通过支化的聚（赖氨酸-半胱氨酸-Ebes）骨架连接至线性PEG分子的一端（亲水区，分子量为5K）构成。与已报道的其他胶束系统相比，此类嵌段共聚物具有多项优势：首先，其可通过逐步溶液相缩合反应便捷地合成；其次，与多种其他已报道的两亲性聚合物相比，该巯基化聚合物系统采用成熟的溶液相逐步Fmoc肽化学法合成，结构明确，可储存为冻干粉末形式，且具有较长的保质期。

可采用多种技术对终产物进行表征。通过比较1H NMR谱图中聚乙二醇（PEG）上的质子信号与胆酸三个甲基基团上...

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讨论

已有多种纳米颗粒被研究用于药物递送的潜在应用。脂质体阿霉素和紫杉醇（PTX）负载的人血清白蛋白纳米聚集体是已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于癌症治疗的纳米药物之一。然而，尽管这些纳米药物在临床上有效，但它们的粒径相对"较大"，且倾向于在肝脏和肺部蓄积。具有相对较小粒径和较高载药能力的聚合物胶束正成为新兴的药物递送纳米载体。其独特的核-壳结构通过物理包封的方式在水相环境中“增溶”疏水性药物分子。由本实验室制备的结构明确的TD组成的聚合物胶束可形成单一分散的纳米颗粒（粒径10–50 nm），具有较长的储存稳定性和高效的药物包封能力。这种稳定的TD平台众多优势之一在于聚合物的多功能性。多种药物、荧光染料以及靶向配体均可被便捷地整合到TD平台中13,15,24。

方案中的关键步骤

我们开发了一种稳定、可逆、通过二硫键交联的胶束系统用于紫杉醇（PTX）递送，该系统结构明确，粒径约为27 nm，且具有较窄的尺寸分布。TDs通过逐步溶液相肽化学方法合成。这些T...

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披露

Y. Li 和 K.S.L. 是关于可逆交联胶束系统的一项待审批专利（美国专利申请号 61/485,774）的发明人。K.S.L. 是 LamnoTherapeutics Inc. 公司的创始科学家，该公司计划开发本论文中所述的纳米治疗药物。其余作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者感谢 Alisha Knudson 女士提供的编辑帮助。同时感谢美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI，3R01CA115483，授予 K.S.L.）、美国国防部前列腺癌研究计划奖（DoD PRMRP，W81XWH-13-1-0490，授予 K.S.L.）、美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI，1R01CA199668，授予 Y.L.）以及美国国立卫生研究院/国家儿童健康与人类发展研究所（NIH/NICHD，1R01HD086195，授予 Y.L.）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MeO-PEG5K-NH2Rapp Polymere125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OHAaptecAFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OHAnaspecAS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OHAapptecAAC105
二甲基甲酰胺菲舍尔科技BP1160-4
乙醚菲舍尔科技E134-20
N,N-二异丙基乙胺西格玛-奥德里奇D125806
三氟乙酸西格玛-奥德里奇T6508腐蚀性，小心操作
4-甲基哌啶阿尔法-埃萨L-02709
Ebes接头AnaspecAS-61924
胆酸西格玛-奥德里奇C1129
1,2-乙二硫醇西格玛-奥德里奇02390在通风橱内操作。使用后用漂白剂处理手套。
三异丙基硅烷西格玛-奥德里奇233781
氯仿（无水）西格玛-奥德里奇288306
30%过氧化氢溶液Aaron IndustriesNA
HoBt-ClAaptecCXZ096
DIC西格玛-奥德里奇D125407
雌性裸鼠（Nu/Nu品系），6–8周龄Harlan（加利福尼亚州利弗莫尔）

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