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一种用于定量检测犬中性粒细胞胞外诱捕网释放的简易荧光检测法

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DOI：

10.3791/54726

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2016年11月21日

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1Department of Veterinary Microbiology and Preventative Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh, 3Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University

本文内容

摘要

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由DNA、组蛋白和中性粒细胞蛋白构成的网状结构。尽管NETs是先天免疫反应的组成部分，但也与自身免疫和血栓形成相关。本实验方案描述了一种简单的方法，用于分离犬中性粒细胞，并通过微孔板荧光检测法对NETs进行定量分析。

摘要

中性粒细胞胞外诱捕网是由DNA、组蛋白和中性粒细胞蛋白组成的网状结构，在感染性和炎症性刺激下释放。尽管是先天免疫反应的一部分，但NETs（中性粒细胞胞外诱捕网）也参与多种疾病过程，包括自身免疫和血栓形成。本方案描述了一种简单的方法，用于犬中性粒细胞的分离以及利用微孔板荧光检测法对NETs进行定量。通过常规静脉穿刺技术采集血液。采用葡聚糖沉降法和密度梯度离心法分离中性粒细胞，所用条件已针对犬血液优化。将中性粒细胞接种于96孔板中，使其贴壁后，使用NET诱导剂（如佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯或血小板活化因子）进行处理。通过细胞不可渗透性核酸染料的荧光信号来检测DNA的释放。该检测方法是一种简单且经济的NET释放定量手段，但需通过其他方法确认观察到的DNA释放确实源于NET形成，而非其他类型的细胞死亡。

引言

仅在美国，宠物狗的数量就超过7000万只1。作为备受重视的家庭成员，这些动物通常能够接受前沿的医疗护理。同时，由于狗与人类共享生活环境，它们也能为人类疾病的发病机制和治疗提供重要启示1。然而，无论将人类医学中的发现转化为兽医治疗手段，还是反之，都必须充分表征物种间的差异，即使是在高度保守的系统（如先天免疫反应）中也是如此。犬类与人类先天免疫系统差异的实例包括：狗的中性粒细胞高表达CD4分子2；狗缺乏细胞质鞭毛蛋白感受器IPAF的功能性同源物3；以及食肉动物表达一种caspase 1/4杂合蛋白4。

中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）是先天免疫系统中一种相对较新发现的组分5。NETs 是由 DNA、细胞核蛋白和颗粒蛋白组成的网状结构，在多种炎症或感染性刺激下被释放6。已在多种物种中观察到类似 NET 的结构，包括鸡7、鱼类8、软体动物9和无体腔动物10，但不同物种之间存在差异。例如，小鼠中性粒细胞对 NETosis 刺激的反应比人类中性粒细胞更慢，且形成的 NETs 扩散程度较低11。来自多个物种的大量证据表明，NETs 能够捕获微生物，而其是否直接参与杀灭病原体则尚存争议12,13。然而，NETs 的组分也可能加剧组织损伤、促进血栓形成并作为自身抗原发挥作用14,15。NETs 的有益作用与有害作用之间的平衡可能因疾病类型和物种不同而异，提示在特定研究关注的物种和病理条件下对 NETs 进行研究具有重要意义。

本文介绍了一种诱导并检测犬中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的简单实验方案。该方法与用于分离中性粒细胞16以及在其他物种中诱导NET形成的方案类似，但激动剂浓度和孵育时间等条件已针对犬中性粒细胞进行了优化。类似的基于DNA释放量的NET定量检测方法也已在其他物种中报道，但本文所述方法同样针对犬进行了优化8,17,18。

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方案

所有实验均获得爱荷华州立大学机构动物护理和使用委员会的伦理许可。

1. 血液采集

  1. 从隐静脉、头静脉或颈静脉直接抽取9 ml血液至抗凝剂中（例如， 乙二胺四乙酸（EDTA），1.8 mg K2EDTA/ml 血液）真空采血管，或使用注射器采集后立即转移至含 EDTA 的采血管中。轻轻滚动或倒置采血管，以确保血液与抗凝剂充分混匀。

2. 中性粒细胞分离

  1. 在50 ml锥形管中，通过轻轻倒置将血液与等体积的无菌室温3%右旋糖酐-500（用0.9%无菌生理盐水配制）混合。室温下直立静置18–20分钟。将上层淡黄色液体转移至新管中，直至无法在不混入下层红色液体的情况下继续收集为止。原管中的红细胞可弃去。
  2. 在4 °C条件下，以500 × g离心10分钟，去除并弃去上清液。用手动方式将细胞沉淀重悬于10 ml室温无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。注意：在整个实验方案的任何步骤中均不应使用涡旋振荡来重悬中性粒细胞。为最大化细胞得率，建议在整个操作过程中手动吸走上清液，而非倾倒。
  3. 在50 ml锥形管中加入10 ml室温的多聚蔗糖-泛影酸钠细胞分离液（例如，Histopaque 1077）。小心地将含细胞的溶液分层加至细胞分离液上方。注意：若细胞分离液未平衡至室温，可能会降低细胞得率。
  4. 在室温下以300 × g离心30分钟，关闭刹车。
  5. 由于中性粒细胞位于梯度的最底层，吸除并弃去上层三层液体，包括上层的血浆和血小板层、中间狭窄的单个核细胞白色条带以及清晰的密度梯度介质层。
  6. 为裂解残留的红细胞，将中性粒细胞沉淀重悬于10 ml室温水中。
  7. 30秒后，加入10 ml无菌室温1.8%氯化钠溶液以恢复渗透压，并通过轻轻倒置混匀。
  8. 在4 °C条件下以500 × g离心5分钟，吸除上清液并弃去。
  9. 若沉淀仍呈红色，则重复裂解步骤；若沉淀已呈白色（或裂解步骤已进行两次），则轻柔地将细胞重悬于10 ml无菌PBS中。
  10. 使用自动细胞计数器或血细胞计数板进行细胞计数。典型的细胞得率至少为每毫升血液106个细胞。
  11. 在4 °C条件下以500 × g离心5分钟，吸除上清液并弃去。
  12. 将细胞重悬于无菌室温PBS中，调整至所需浓度。对于第2节所述的DNA释放检测，应将细胞重悬至每毫升含5 × 106个细胞的浓度。
  13. 如需要，可直接或使用细胞离心涂片机将少量细胞转移至玻片上。待细胞干燥后，根据制造商说明书使用快速固定和染色试剂盒进行染色。若中性粒细胞分离成功，在显微镜下观察时，至少95%的有核细胞应为粒细胞（中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞），且红细胞污染极少。

3. DNA 释放检测

  1. 在中性粒细胞分离后立即设置DNA释放实验。
  2. 若在光学显微镜下观察到储备液中存在细胞聚集体，则在设置实验前立即将细胞悬液通过无菌的70 µm滤膜过滤。
  3. 向无菌96孔板的每个检测孔中加入5 × 104 个细胞/孔，并加入激动剂以及不含酚红、添加0.5%热灭活胎牛血清的Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI）培养基，使终体积达到100–200 µl。每种激动剂至少设置两个空白孔，其中用等体积的PBS替代中性粒细胞储备液。请注意，为每种激动剂设置空白孔对于排除激动剂中的DNA污染或激动剂对荧光检测的干扰至关重要。
  4. 在39 °C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟。
  5. 加入所需浓度的激动剂及一种细胞不可渗透的核酸染料。注意，不同核酸染料的最佳使用浓度可能有所不同。每次实验均应包括未刺激对照组，其中激动剂被等体积的培养基替代。
    注意：建议将激动剂用相似体积的培养基稀释，以保持各孔间条件一致。终体积为200 µl的体系已被成功使用；若调整体积，所有实验条件下的孔体积应保持一致。佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）（终浓度≥0.1 µM）或血小板活化因子（PAF）（终浓度≥31 µM）可作为阳性对照。激动剂处理应至少设置重复孔。
  6. 在39 °C继续孵育。于2小时后或按所需时间间隔使用酶标仪检测荧光信号。请注意，最佳检测时间间隔可能因所用激动剂不同而异。
    注意：激发和发射波长取决于所使用的染料。
  7. 在计算平均荧光强度前，需扣除空白孔的荧光值。
  8. 为便于在不同个体及不同实验板之间进行比较，通过将刺激孔的平均荧光强度除以未刺激孔的平均荧光强度，计算荧光变化倍数（fold change）。

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结果

采用本方案时，中性粒细胞经阳性对照PMA和PAF刺激后，荧光强度应出现显著的倍数变化。如图1B所示，用31 µM PAF刺激犬中性粒细胞1小时后，其荧光强度平均增加4.0倍（范围为2.0–5.8，n = 5只犬）18，相较于未刺激细胞。0.1 µM的PMA（图1A）是一种作用较慢的激动剂，在刺激2小时后才出现荧光强度的上升，但最终产生的荧光倍数增加与PAF相似（平均值：3.3，范围1.36–5.4，n = 5只犬）18。尽管PMA的动力学较慢，但作为阳性对照仍具优势：与高浓度PAF相比，PMA成本相对较低，且在小鼠和人类研究中已被广泛使用。

核酸染料的荧光并非对NET形成具有特异性，因为当细胞通过其他机制发生死亡或试剂被DNA污染时，也会出现荧光。如图2所示，一种市售的LPS制剂在没有中性粒细胞的情况下即产生...

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讨论

本实验所介绍的DNA释放检测法是一种可轻松定量的细胞外DNA检测方法。该方法借鉴了用于评估其他物种中NET形成的类似技术，但已对离心速度、激动剂浓度和孵育时间进行了调整，以优化适用于犬中性粒细胞的实验条件8,17,18。类似调整也可用于将该方法适配于其他物种。与流式细胞术或图像分析等其他NETosis检测方法相比，该检测方法操作简便且成本低廉。此外，该方法无需针对NET组分的特异性抗体，因此特别适用于犬类研究，因为在商业上往往难以获得经过验证的、可与犬类物种反应的特异性抗体。

该方法的主要局限性在于细胞非渗透性核酸染料在中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成检测中的特异性不足。这些染料同样可进入死亡或濒死细胞，与DNA结合并产生荧光。因此，荧光信号并非NET形成所特有。建议结合其他技术（例如强烈建议平行进行定量检测与免疫荧光实验，以直观确认激动剂诱导的是中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成，而非其他形式的细胞死亡。该检测方法也可潜在地用作细胞死亡的通用筛选实验，例如用于量化细胞毒性。 离体.

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者们衷心感谢 James Roth 博士、William Nauseef 博士、Kayoko Kimura 博士以及 Tom Skadow 先生在犬中性粒细胞实验方案开发过程中提供的帮助。RDG 获惠康信托基金（Wellcome Trust Fellowship）资助，项目编号：WT093767MA。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
喷雾涂层含 K2EDTA 的塑料全血管BD367835
Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771
右旋糖酐-500Accurate Chemical and Scientific Corp.AN228410
磷酸盐缓冲液ThermoFisher Scientific20012043
胎牛血清，热灭活ThermoFisher Scientific10100139
RPMI 1640 培养基，不含酚红和 L-谷氨酰胺ThermoFisher Scientific32404-014应不含酚红
96 孔平底无菌聚苯乙烯板Falcon353072
佛波酯-12-十四烷酰-13-乙酸酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate）Sigma-AldrichP1585
血小板活化因子Sigma-AldrichP4904
SYTOX Green 核酸染料ThermoFisher ScientificS7020
Synergy 2 多功能酶标仪BioTekNA

参考文献

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NETosis PMA

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