方法文章

用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简单高效制备与纯化

DOI：

10.3791/54727

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2016年10月27日

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Western University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍一种仅使用常规实验室设备的简单方案，用于大量制备和纯化含有小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的融合蛋白。该蛋白可用于诱导由T细胞和B细胞共同介导的实验性自身免疫性脑脊髓炎。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的慢性炎症性疾病，被认为是由针对髓鞘的自身免疫反应所引发。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是CNS自身免疫性疾病的最常用动物模型，通常通过使用代表髓鞘蛋白免疫优势CD4+ T细胞表位的短肽进行免疫接种来诱导。然而，B细胞可直接识别未加工的完整蛋白，而短肽免疫无法激活那些识别天然蛋白的B细胞。鉴于近期针对多发性硬化症患者的B细胞耗竭疗法的临床试验提示B细胞在人类疾病进展中具有重要作用，迫切需要能够包含B细胞对自身抗原识别的动物模型。为此，我们构建了一种新的融合蛋白，其中包含小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的胞外结构域，并在其N端融合了用于纯化的His标签以及硫氧还蛋白蛋白以提高可溶性（MOGtag）。该融合蛋白还包含烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点，以便去除所有标签序列，仅保留纯净的MOG1-125胞外结构域。本文介绍了一种仅使用常规实验室设备即可大量制备纯净MOGtag或MOG1-125的简便方案。该方案可稳定产出超过200 mg的MOGtag蛋白。使用MOGtag或MOG1-125进行免疫接种均可引发包含识别天然小鼠MOG的致病性B细胞在内的自身免疫反应。

引言

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多发性硬化症（MS）是一种人类疾病，其特征是中枢神经系统（CNS）发生慢性炎症和神经退行性病变，被认为是由针对髓鞘的自身免疫反应所引发。随着时间推移，髓鞘和轴突的丧失导致认知功能和运动功能逐渐下降1。"实验性自身免疫性脑脊髓炎"是用于描述以CNS髓鞘为靶标的自身免疫性疾病动物模型的统称。与人类MS相似，EAE通常表现为免疫细胞浸润中枢神经系统，在某些情况下还伴有脱髓鞘2。然而，任一特定EAE模型在多大程度上模拟人类MS，部分取决于所使用的物种或品系，以及潜在抗髓鞘自身免疫反应的复杂性。

抗髓鞘自身免疫可通过多种方式在实验中诱导产生，但目前最常用的方法是用一段模拟髓鞘蛋白中免疫优势CD4+ T细胞表位的短肽对小鼠进行免疫。这代表了诱导致病性免疫反应的最低要求。其中最常用的是来源于少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（MOG35-55）的21个氨基酸肽段，该肽段用于在C57Bl/6小鼠中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）3。然而，出于某些实验目的，使用较大的蛋白质抗原进行免疫更为理想，甚至必不可少，且相比短肽免疫具有多项优势。首先，由于MHC限制性，短肽通常仅在少数品系中有效，而较大的蛋白质抗原（代表完整蛋白或特定结构域）可被正常加工并在多种近交系小鼠甚至不同物种中呈递4。其次，较大的蛋白质抗原能够诱导更为复杂的免疫反应，使更多类型的淋巴细胞参与抗原识别，而不局限于CD4+ T细胞的识别。例如，B细胞通过其B细胞受体（BCR）直接与完整蛋白而非加工后的蛋白发生相互作用。我们及其他研究者已证实，由MOG35-55免疫激活的B细胞无法识别MOG蛋白5。鉴于近期研究已证明B细胞在人类多发性硬化症（MS）中具有致病作用6，能够将B细胞纳入自身免疫病理过程的EAE模型正变得日益重要。

尽管使用较大的蛋白质抗原诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）具有诸多优势，但目前市面上此类蛋白质的来源仍然十分有限。事实上，像MOG35-55这样的短肽可以快速合成且成本相对较低，而MOG蛋白的商业化选择则较少，且购买价格显著更高。尽管如此，目前已有若干表达载体可供研究团队自行制备MOG胞外域（MOG1-125）。然而，我们在文献中所发现的所有表达系统均基于较早期的技术，而这些技术目前已被更高效的表达系统所取代7。此外，大多数系统基于大鼠或人源MOG8。在针对小鼠自身免疫性疾病的研究中，使用基于小鼠MOG自身抗原的抗原更为理想。最后，我们所发现的所有基于MOG的蛋白质，无论是商业产品还是表达载体，均为融合蛋白，其在MOG1-125基本序列基础上额外添加了其他氨基酸序列。这些附加序列包括用于纯化的标签，通常还包含其他功能未知的序列。

为解决这些局限性，我们构建了一种基于小鼠MOG胞外域的新型融合蛋白，该融合蛋白连接了一个含有硫氧还蛋白的标签，以克服MOG蛋白已知的不溶性问题5。该标签序列还包含一个6xHis序列用于纯化，以及一个TEV蛋白酶切割位点，可根据需要完全去除所有标签序列。据我们所知，这是目前唯一能够获得纯MOG1-125蛋白的方法。为了便于大量生产蛋白，MOG1-125序列经过密码子优化以适应细菌表达系统，并将MOGtag融合蛋白插入pET-32表达系统中。本文详细描述了利用大多数免疫学实验室常见的非专用设备来生产并纯化MOGtag蛋白以及纯MOG1-125蛋白的实验方案。

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方案

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1. 蛋白质诱导

注意：在以下步骤中，将含有 MOGtag 融合蛋白序列的 pET-32 载体转化的 BL21 Escherichia coli 细菌（参见参考文献5 和 图 1）将被培养至高密度，随后诱导表达 MOGtag 蛋白。整体时间线请参见 图 2 —— 注意所示天数为近似值，本方案中已标注可选的暂停节点。若起始材料为纯化的 pET-32 MOGtag 载体 DNA，则需使用氨苄青霉素筛选，将其化学转化至感受态 BL21 E. coli 细菌中，该方法已有详尽描述9。转化成功可通过标准商用试剂盒从筛选出的细菌中提取 DNA，再用限制性内切酶 Age1 和 Sac1 进行酶切消化，在琼脂糖凝胶电泳中产生 424 bp 条带来验证10。

  1. 取5 ml无菌的LB液体培养基（含氨苄青霉素0.1 mg/ml），接种BL21-MOGtag甘油菌，并在37 °C、200 rpm条件下过夜培养。
  2. 将两个1 L的锥形瓶（每个含500 ml无菌LB液体培养基）放入37 °C培养箱中，为次日实验做准备。
  3. 向步骤1.2中含500 ml LB培养基的每个锥形瓶中加入500 µl 100 mg/ml氨苄青霉素（终浓度为0.1 mg/ml氨苄青霉素）。从步骤1.1的过夜培养物中取1 ml转移至两个LB培养瓶中。在37 °C、200 rpm条件下培养5小时，或直至光密度达到0.6。
  4. 从其中一个锥形瓶中取出1 ml培养物，转移至一个独立的1.5 ml离心管中。在16,000 × g条件下离心1分钟以收集菌体，弃去上清液。将该离心管标记为T0（诱导前），并将菌体沉淀置于-20 °C冰箱中保存，用于后续的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析（见第8节和图3）。
  5. 向每瓶培养物中加入0.5 ml 1 M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。将锥形瓶在37 °C、200 rpm条件下继续培养4小时，随后在室温、75 rpm条件下过夜培养。

2. 收获MOGtag蛋白

注意：在此阶段，细菌已产生大量 MOGtag 蛋白。为收获 MOGtag，首先使用 Triton X-100 缓冲液裂解细菌，随后进行超声处理。然后从包涵体中释放 MOGtag，并用咪唑和胍进行变性，从而获得含有 MOGtag 蛋白的粗提蛋白溶液。

  1. 从步骤1.5的过夜培养物中取1 ml样品，转移至1.5 ml微量离心管中。在16,000 × g条件下离心1分钟，沉淀细胞，并弃去上清液。将该管标记为TO/N（诱导后），然后将细菌沉淀置于-20 °C冰箱中，用于后续SDS-PAGE分析（图3）。
  2. 将培养物均匀分配至适合高速离心的250 ml离心瓶中，此后始终保持在冰上。在4 °C条件下，以22,000 × g离心15分钟，沉淀细菌细胞。
  3. 弃去上清液。将细菌沉淀保存于-20 °C，或继续进行步骤2.4。
  4. 通过向60 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中加入60 µl Triton X-100和120 µl浓度为50 mg/ml的鸡蛋溶菌酶储备液，配制裂解缓冲液（含0.1 mg/ml鸡蛋溶菌酶，0.1% Triton-X（v/v），溶于磷酸盐缓冲液（PBS））。
  5. 用总共30 ml裂解缓冲液重悬并合并步骤2.3中所得的所有细菌沉淀。将该混合液体转移至可进行高速离心的50 ml圆底离心管中。将此管置于30 °C水浴中孵育30分钟。孵育期间，振荡混匀两次，以确保细胞充分重悬。
  6. 孵育结束后，将离心管转移至冰上，使用与步骤2.6相同的参数对溶液进行超声处理：频率20 kHz，振幅70%，脉冲开启3秒，关闭3秒，每轮5次脉冲。共进行六轮超声处理，每轮之间将溶液置于冰上冷却。
  7. 在4 °C条件下，以24,000 × g离心15分钟。弃去上清液，并重复步骤2.5–2.7一次。将沉淀保存于-20 °C，或继续进行步骤2.8。
  8. 通过将0.8766 g NaCl、0.09456 g Tris-HCl和0.01021 g咪唑加入100 ml烧杯中，配制缓冲液A（500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，5 mM咪唑，pH 7.9）。加入H2O至体积达28 ml，调节溶液pH至7.9。然后将溶液转移至100 ml量筒中，加H2O定容至30 ml。
  9. 用30 ml缓冲液A重悬步骤2.7所得沉淀，并在4 °C孵育3小时。在此期间，称取17.2 g盐酸胍。
  10. 在冰上使用与步骤2.6相同的参数对溶液进行超声处理。然后向溶液中加入17.2 g盐酸胍。继续在冰上孵育1小时，以溶解MOGtag蛋白。
  11. 在4 °C条件下，以24,000 × g离心30分钟。收集上清液，并将上清液于4 °C保存，待进行蛋白纯化。

3. 蛋白质纯化

注意：在以下步骤中，MOGtag 蛋白将通过4轮在带电镍树脂上的吸附（通过His标签）和洗脱进行纯化。

  1. 配制以下缓冲液：
    1. 配制缓冲液 B（500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，5 mM 咪唑，6 M 盐酸胍，pH 7.9）。将 5.844 g NaCl、0.6304 g Tris-HCl、0.0681 g 咪唑和 114.64 g 盐酸胍加入一个 500 ml 烧杯中。然后加入 H2O 至 190 ml，调节 pH 至 7.9。将溶液转移至 250 ml 量筒中，再加 H2O 至总体积为 200 ml。
    2. 配制洗脱缓冲液（500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，0.5 M 咪唑，6 M 盐酸胍，pH 7.9）。将 5.844 g NaCl、0.6304 g Tris-HCl、6.808 g 咪唑和 114.64 g 盐酸胍加入一个 500 ml 烧杯中。加入 H2O 至 190 ml，调节 pH 至 7.9。将溶液转移至 250 ml 量筒中，再加 H2O 至总体积为 200 ml。
    3. 配制剥离缓冲液（500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，100 mM EDTA，pH 7.9）。将 5.844 g NaCl、0.6304 g Tris-HCl 和 40 ml 500 mM EDTA 加入一个 500 ml 烧杯中。加入 H2O 至 190 ml，调节 pH 至 7.9。将溶液转移至 250 ml 量筒中，再加 H2O 至总体积为 200 ml。
    4. 配制上样缓冲液（0.1 M 硫酸镍）。将 5.257 g 硫酸镍加入一个 500 ml 烧杯中，再加 H2O 至 190 ml（注意：在硫酸镍完全溶解于 H2O 之前，切勿在通风橱外操作）。待硫酸镍完全溶解后，将溶液转移至 250 ml 量筒中，再加 H2O 至总体积为 200 ml。
  2. 将 10 ml 镍树脂均分至两个可耐受超过 4,500 × g 离心力的 50 ml 锥形离心管中（每管 5 ml）。
  3. 对镍树脂进行上样与平衡：
    1. 向每支含树脂的离心管中加入 40 ml H2O 洗涤树脂。将离心管水平放置于摇床上，在 4 °C 下振荡 5 分钟。完成后，在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 8 分钟。
    2. 用移液器小心弃去上清液，避免扰动沉淀。向每支离心管中加入 40 ml 上样缓冲液。将离心管置于摇床上，在 4 °C 下振荡 15 分钟。完成后，在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 8 分钟。
    3. 弃去上清液，然后向每支离心管中加入 40 ml 缓冲液 B。将离心管置于摇床上，在 4 °C 下振荡 5 分钟。完成后，在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 8 分钟，随后弃去上清液。
  4. 可选步骤：取第 2.11 步收集的溶解蛋白 150 µl，转移至一支 1.5 ml 微量离心管中。标记该管为“孵育前样品”，并于 -20 °C 冻存，用于后续 SDS-PAGE 分析（图 3，粗提 MOGtag）。
  5. 纯化 MOGtag 蛋白：
    1. 将第 2.11 步所得的全部溶解蛋白（约 40 ml，减去第 3.4 步取出的小份样品）转移至第一支离心管（图 2，管 1），该管中含有第 3.3 步处理过的镍树脂，混匀后于 4 °C 水平放置于摇床上孵育 1 小时。
    2. 在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 8 分钟。离心结束后，将上清液转移至第二支含镍树脂的离心管（图 2，管 2），并按前述步骤孵育。同时，继续对第一支离心管（管 1）执行以下第 3 至第 6 步操作。
    3. 用 40 ml 洗脱缓冲液重悬第一支离心管（管 1）中的镍树脂，于 4 °C 水平放置于摇床上振荡 5 分钟。然后在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 8 分钟。
    4. 将含有洗脱 MOGtag 蛋白的上清液转移至一个标记为“纯化 MOGtag 蛋白”的 250 ml 瓶中，并将该瓶置于 4 °C 保存。每次洗脱步骤所得的上清液均应汇集至该瓶中。
    5. 向镍树脂中加入 40 ml 剥离缓冲液，于 4 °C 水平放置于摇床上振荡 5 分钟。
    6. 在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 8 分钟。弃去上清液，然后按照第 3.3 步所述重新上样镍树脂。
    7. 完成后，对第二支离心管（管 2）执行第 3.5 步所述操作。总共进行四轮溶解蛋白（来自第 2.11 步）在上样镍树脂上的吸附与洗脱，即可回收大部分蛋白；如有需要，还可通过额外轮次进一步回收更多蛋白。
  6. 完成四轮（或更多轮）吸附与洗脱后，将汇集的纯化蛋白于 4 °C 过夜保存。镍树脂可保存于 40 ml 20% 乙醇溶液中，置于 4 °C，待下次使用。

4. 测定蛋白质浓度

注意：在继续下一步之前，必须定量测定第3部分中纯化的MOGtag蛋白的产量。该数值将用于确定在本实验方案结束时蛋白浓缩后的最终体积。此处描述一种标准的布拉德福（Bradford）测定法。通过将系列稀释的MOGtag蛋白的光谱吸光度与已知浓度的牛血清白蛋白（BSA）标准曲线进行比较，来确定纯化MOGtag蛋白的浓度。

  1. 配制10倍浓度乙酸盐缓冲液：在3 L烧杯中加入23 ml冰乙酸和8.2 g乙酸钠，然后加入1.9 L H2O以溶解乙酸钠。将该溶液转移至2 L量筒中，并加H2O至总体积达到2 L。随后将缓冲液储存于2 L瓶中，室温保存。通过将100 µl 10倍浓度乙酸盐缓冲液加入900 µl H2O中，配制1 ml 1倍浓度乙酸盐缓冲液。
  2. 设置96孔板用于稀释：在G2–8孔中各加入30 µl 1倍浓度乙酸盐缓冲液，在G9孔中加入60 µl。在H2和H3孔中各加入48 µl 1倍浓度乙酸盐缓冲液。
  3. 在G行设置BSA标准品的初始系列稀释：在G1孔中加入216 µl 1倍浓度乙酸盐缓冲液和54 µl市售2 mg/ml BSA标准品，并充分混匀。从G1孔取210 µl加入G2孔，充分混匀后，再从G2孔取180 µl加入G3孔。从G3孔取150 µl加入G4孔，充分混匀，并按每次减少30 µl的规律继续向后续各孔加样，直至G8孔。（稀释倍数对应的等效值参见表1）。
  4. 设置每种稀释液的三复孔样品：将G1孔中的10 µl分别转移至A1、B1和C1孔，将G2孔中的10 µl分别转移至A2、B2和C2孔，依此类推。建议使用多通道移液器。
  5. 设置MOGtag的稀释：将步骤3.6中纯化的MOGtag蛋白60 µl加入H1孔。从H1孔取12 µl加入H2孔，充分混匀，再从H2孔取12 µl加入H3孔，充分混匀（此过程在H1孔中形成1倍稀释，在H2孔中为1/5稀释，在H3孔中为1/25稀释）。
  6. 设置MOGtag稀释液的三复孔样品：参照步骤4.4的方法，将H1–H3孔中的各10 µl分别转移至D、E、F行对应孔中。
  7. 将2 ml蛋白检测试剂染料浓缩液与8 ml H2O混合均匀。使用多通道移液器（如有），向A、B、C、D、E和F行所有预加样孔中各加入200 µl该混合液。读取蛋白浓度前，用针头刺破孔中气泡。
  8. 加入染料试剂后10分钟内，测定A、B、C、D、E和F行所有孔在595 nm处的吸光度。
  9. 利用A、B、C行建立标准曲线，其中第1–9列对应的BSA浓度分别为0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05和0 mg/ml。根据该标准曲线，计算MOGtag蛋白的浓度，选择最符合标准曲线范围的MOGtag稀释样品进行定量。通常，按照本方案从1 L细菌培养物中可获得200至250 mg MOGtag蛋白。
    注意：如需制备MOG1-125，请继续进行本方案末尾列出的可选步骤7。否则，请继续进行第5节。

5. 透析

注意：透析的目的是逐步去除含有纯化变性MOGtag溶液中的盐酸胍，以使蛋白质重新折叠。此步骤需格外小心，因为MOG本身溶解度极低，尽管硫氧还蛋白标签的存在可改善其溶解性，但仍容易析出。因此，复性过程应逐步进行，并在相对较低的MOGtag浓度下完成。

  1. 开始透析前，根据第4节计算的MOGtag蛋白量，用缓冲液B（缓冲液B的配制方法见步骤3.1）将纯化的MOGtag蛋白稀释至浓度为0.5 mg/ml或更低。
  2. 剪取约30 cm的赛璐玢透析管，将一端折叠三次后用止血钳夹紧封闭。向透析管中加入稀释后的MOGtag蛋白（每根管中加入60至90 ml MOGtag蛋白），然后从开口端挤出管内的气泡。最后用第二个止血钳封闭另一端。
  3. 重复步骤5.2，将剩余的MOGtag蛋白全部装入透析管中。确保透析管无泄漏。
  4. 使用4 M盐酸胍配制1x醋酸盐缓冲液：称取382.12 g盐酸胍（guanidine-HCl），加入100 ml在步骤4.1中配制的10x醋酸盐缓冲液至2 L烧杯中，再加入0.5 L H2O，搅拌使盐酸胍完全溶解。溶解后将溶液转移至1 L量筒中，并加H2O定容至1 L。每需要处理2根透析管，即按此配方重复一次。
  5. 按以下步骤进行透析：取1 L含4 M盐酸胍的1x醋酸盐缓冲液（来自步骤5.4），加入一个大桶（容量至少10 L）中。将最多2段含有MOGtag蛋白的透析管放入桶中，留出足够空间以便磁力搅拌子在底部自由旋转。将桶置于4 °C环境中，并放置在磁力搅拌器上，开启搅拌，调节至缓慢转速（i.e. 不需高速，仅需足以搅动液体即可）：
    注：通过以下步骤逐步降低缓冲液中盐酸胍的浓度。搅拌时间已给出最低要求，但可过夜进行。透析至少需要3天，也可根据需要延长。应定期检查透析管是否完好，两端是否密封牢固。
    1. 让桶持续搅拌4–5小时。
    2. 向每个桶中加入1 L 1x醋酸盐缓冲液（由100 ml 10x醋酸盐缓冲液与900 ml H2O混合而成）。
    3. 重复步骤5.5.1和5.5.2共3次，使桶中缓冲液体积累计达到4 L。
    4. 弃去桶中一半体积的缓冲液，补充1 L不含盐酸胍的新鲜1x醋酸盐缓冲液（由100 ml 10x醋酸盐缓冲液与900 ml H2O混合而成），重新放置透析管和搅拌子。
    5. 再重复一次步骤5.5.1和5.5.2（i.e. 使桶中缓冲液总体积再次达到4 L）。
    6. 最后，将桶中全部4 L缓冲液更换为4 L新鲜的1x醋酸盐缓冲液，持续搅拌4–5小时。为获得最佳效果，建议在蛋白浓缩当天进行此步骤。
    7. 小心取出含有复性MOGtag蛋白的透析管，并弃去桶中的缓冲液。

6. 浓缩MOGtag蛋白

注意：在最后一步中，将复性后的 MOGtag 蛋白浓缩至工作稀释浓度以便储存。由于 MOGtag 溶解度极低，其浓度不应超过 5 mg/ml。该浓度与常用于诱导小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的 0.4 mg/ml MOG35-55 肽（与完全弗氏佐剂（CFA）按 1:1 混合使用）大致等摩尔。在浓缩过程中，少量蛋白以白色沉淀形式析出是常见现象，但大量沉淀则存在问题。

  1. 根据第4节中计算的数值，计算达到5 mg/ml MOGtag浓度所需的最终体积。
  2. 用铝箔纸衬垫一个托盘，并在铝箔上覆盖聚乙二醇（PEG）3350和PEG 8,000，按1:1比例混合。加入PEG 3350可有助于防止蛋白在浓缩过程中发生聚集，并具有有效的冷冻保护作用11。
  3. 将含有MOGtag蛋白的透析管置于铝箔上，并用PEG 8000覆盖。室温下静置，定期检查体积，直至体积等于或低于第6.1步估算的最终体积（实际体积将在下一步测量）。若在浓缩过程中托盘内水分过饱和，请更换新的铺有铝箔并加有PEG 3350和PEG 8000的托盘。
  4. 用H2O清洗透析管外表面，使用血清移液管将MOGtag蛋白转移至单独的玻璃瓶中。转移过程中需记录体积，以确保最终体积准确。
    1. 若体积已低于估算的最终体积，可加入1x醋酸盐缓冲液至目标体积；若体积高于估算值，则将MOGtag蛋白重新转移回透析管中，继续浓缩（步骤6.2–6.3）。
    2. 将MOGtag蛋白分装至1.5 ml离心管中（每管0.5 ml），于-80 °C保存备用。用于诱导EAE时，按1:1比例与此体积的CFA混合。
  5. 使用第1.4、2.1、3.4步采集的样品以及第6.4步纯化的MOG蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，以确认MOGtag蛋白的表达。

7. 使用 TEV 蛋白酶从 MOGtag 制备 MOG1-125（可选）

注意：此可选步骤接续第4步的末尾。如果需要不含任何额外标签序列的MOG1-125，可使用TEV蛋白酶去除标签序列（图4）。据我们所知，目前尚无其他表达系统能够生成纯净的MOG1-125。然而需要注意的是，去除硫氧还蛋白标签后，MOG1-125具有高度不溶性，这可能在纯化和操作过程中引发问题，因此仅在实验必需时才去除该标签。生成纯净MOG1-125需经过多个步骤：首先将MOGtag对TEV蛋白酶切割缓冲液进行透析；经TEV蛋白酶消化后，浓缩样品体积以利于后续纯化步骤，随后对缓冲液B进行透析，再使用镍树脂去除含His标签的标签序列。最后，对蛋白进行定量，并将纯净的MOG1-125浓缩至最终所需浓度。

  1. 在2 L烧杯中加入1.861 g EDTA、44.4 g Tris-HCl和26.5 g Tris，配制1 L的10× TEV裂解缓冲液（500 mM Tris-HCl，5 mM EDTA）。加入H2O至体积达到990 ml，调节pH至8以溶解EDTA。将溶液转移至1 L量筒中，用H2O定容至1 L。
  2. 根据第4节中计算的蛋白量，使用缓冲液B（即第3.1步所述的缓冲液）将第3.6步中的MOGtag蛋白稀释至0.5 mg/ml。按照第5.2至5.3步所述，将120 ml稀释后的MOGtag蛋白转移至透析袋中。体积可按比例放大，但裂解全部MOGtag蛋白所需的TEV蛋白酶量将显著增加。
  3. 执行第5.5步列出的透析方案，但将其中的10×乙酸盐缓冲液替换为第7.1步配制的10× TEV裂解缓冲液。
  4. 将已处于TEV裂解缓冲液中的MOGtag蛋白转移至一个新的250 ml玻璃瓶中，并监测透析导致的体积增加。每加入2.85 ml MOGtag蛋白，即添加1 µl β-巯基乙醇。每50 mg MOGtag蛋白至少加入1 mg TEV蛋白酶（储存浓度为5 mg/ml的TEV溶液），TEV蛋白酶的添加量最多可达TEV:MOG蛋白质量比1:10。在室温下避光孵育至少72小时。
    注意：TEV蛋白酶孵育结束后，应在玻璃瓶底部观察到白色沉淀。
  5. 在将蛋白转移至透析袋前，向溶液中加入盐酸胍，直至蛋白溶解，以防止蛋白沉淀粘附在玻璃瓶壁上。取150 µl该溶液转移至1.5 ml微量离心管中，并将该管标记为"MOG with TEV"。将该溶液于-20 °C保存，用于后续SDS-PAGE分析。
  6. 按照第5.2至5.3步所述，将第7.5步中的全部液体转移至透析袋中。在大桶中加入2 L H2O，并将透析管放入桶中。在4 °C下轻轻搅拌过夜孵育。此步骤至关重要，可稀释去除盐酸胍，从而加快蛋白浓缩过程，并开始去除会干扰蛋白纯化的EDTA。
  7. 按照第6.2至6.3步所述，对透析袋中的蛋白进行浓缩（仅使用PEG 8000），使最终溶液体积约为40 ml。用H2O冲洗透析袋，去除仍附着在袋壁上的任何残留PEG 8000。体积的减少使得所有消化后的蛋白可装入第3.5步所述的含镍树脂的50 ml离心管中。
  8. 将消化后的蛋白透析至缓冲液B：
    1. 在大桶中加入1 L缓冲液B（29.22 g NaCl，3.152 g Tris-HCl，0.3405 g咪唑，573.18 g盐酸胍，pH 7.9）。
    2. 将第7.7步中含消化后蛋白的透析袋连同搅拌子一起放入桶中（具体操作详见第5.5步）。将桶置于4 °C冷藏室内的搅拌器上，设置为慢速搅拌，使透析袋透析5小时或更长时间。
    3. 倒空桶并重新加入1 L缓冲液B，继续在4 °C冷藏室内的搅拌器上以慢速搅拌，使透析袋再透析5小时或更长时间。
  9. 按照第3节所述详细步骤进行MOG1-125蛋白的纯化，关键区别在于切割下来的标签序列将被镍树脂结合，而MOG1-125则保留在溶液中。同样，对同一份样品进行四轮纯化，但此次目标是提高纯度，而非尽可能回收大量蛋白。参见图4。
    1. 配制第3.1步中列出的蛋白纯化缓冲液。
    2. 按照第3.3步所述，对两管镍树脂进行活化处理。
    3. 按照第3.5步所述方案纯化MOG1-125，关键区别在于含有标签的镍树脂洗脱液应弃去（保留150 µl洗脱液于1.5 ml微量离心管中，用于后续SDS-PAGE分析），而含有MOG1-125的溶液则作为最终产物保留。
  10. 按照第4节所述方法测定MOG1-125蛋白浓度：
    1. 按照第4.2和4.4步所述，配制BSA标准曲线稀释液。
    2. 按照第4.5和4.6步所述，配制MOG1-125的稀释液。也可选择生成更广范围的稀释梯度（例如1倍、1/2、1/4和1/8倍稀释），相应调整1×乙酸盐缓冲液和MOG1-125的体积。
    3. 按照第4.7至4.9步所述进行Bradford法测定，并计算生成的MOG1-125蛋白量。预期产量约为4 mg或更多。
  11. 按照第5节所述，通过透析逐步去除盐酸胍，使MOG1-125蛋白复性。
  12. 按照第6节所述方法浓缩MOG1-125蛋白。最终浓度应为2.24 mg/ml，与5 mg/ml MOGtag等摩尔。

8. SDS-PAGE 凝胶验证 MOGtag 的表达与纯度

注意：在完成 MOGtag 或 MOG1-125 的最终纯化后，应通过标准 SDS-PAGE 分析步骤 1.4、2.1、3.4 和 6.4 中采集的样品，以确认 MOGtag 的表达与纯度。

  1. 配制2× SDS-PAGE上样缓冲液：将1.576 g Tris-HCl加入2 ml H2O中，调节pH至6.8。向Tris-HCl溶液中加入0.4 g SDS，然后加H2O至总体积达到7 ml。
  2. 将0.2 g溴酚蓝加入10 ml H2O中，取1 ml该溶液加入第8.1步制备的溶液中。最后加入2 ml甘油，完成2× SDS-PAGE上样缓冲液的配制。储存该溶液时，应置于4 °C避光保存，可稳定保存最多3个月。
  3. 在室温下解冻第1.4步和第2.1步中保存的细菌分装样品，以及第3.4步和第6.4步中溶解的MOGtag蛋白。
  4. 将第3.4步和第6.4步收集的溶液各取60 µl加入蛋白脱盐柱中，以去除盐分。按照制造商说明书纯化蛋白。
  5. 向第8.2步制备的溶液1 ml中加入20 µL β-巯基乙醇。取40 µl该混合液加入第8.3步所得的两个细菌沉淀中，另取60 µl加入第8.4步脱盐后的蛋白样品中，于95 °C孵育10分钟。
  6. 配制1× SDS-PAGE电泳缓冲液：称取5 g Tris、28.8 g甘氨酸和1 g SDS，加入1 L烧杯中，加入500 mL H2O溶解。待完全溶解后，将溶液转移至1 L量筒中，并用H2O定容至1 L。
  7. 在电泳装置中安装一块12%聚丙烯酰胺凝胶，加入1× SDS-PAGE电泳缓冲液，使缓冲液液面略高于凝胶孔上缘。用移液器将50 µl电泳缓冲液加入每个加样孔中，重复吹打5次，清洗加样孔。
  8. 在第一孔中加入10 µl蛋白Marker，将第8.5步煮沸后的样品各取10 µl分别加入不同加样孔中。以115 V恒压电泳60分钟。
  9. 电泳结束后从装置中取出凝胶，转移至一个小容器中。向容器中加入100 ml纯H2O，置于缓慢旋转的摇床上震荡8分钟。倒去水后，再用H2O重复洗涤凝胶两次。
  10. 倒去容器中的H2O，加入100 ml快速染色液。将容器置于缓慢旋转的摇床上过夜，并用铝箔包裹避光。
  11. 倒去快速染色液，向容器中加入约100 ml H2O。在旋转摇床上震荡8分钟。倒去H2O，再用H2O重复洗涤两次。
  12. 使用考马斯亮蓝染色成像仪对凝胶进行成像。观察约31.86 kDa处的条带（MOGtag蛋白）以及约63.72 kDa处较弱的条带（MOGtag二聚体）。

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结果

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纯化完成后，应将步骤1.4、2.1、3.4中收集的样品以及步骤6.4的最终产物进行蛋白凝胶电泳分析（图3A）。MOG标签 应首先在T中表现为一条31.86 kDa的条带过夜 样本，但非T0，且应是最终纯化产物中的唯一条带。为了检测MOG标签 蛋白正确折叠后，MOG标签 蛋白可用于通过FACS标记MOG-蛋白特异性B细胞。通过以1:1,000稀释度的MOG标记小鼠淋巴细胞标签 结合针对His标签的二抗以及荧光标记的抗IgG1三抗，可鉴定MOG特异性B细胞（图3B）。或者，MOG标签 可直接与荧光染料偶联，以减少背景染色（由B细胞与二抗和三抗结合引起），如参考文献所述5 用于鉴定MOG特异性B细胞。在野生型小鼠中鉴定MOG结合性B细胞时，此步骤是必要的，因为这类细胞通常极为稀少5IgHMOG ...

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讨论

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本文描述了一种MOGtag蛋白的制备方案，以及如何从MOGtag蛋白中获得纯化的MOG1-125。该方案基于标准的His标签蛋白纯化方法，同时也参考了先前报道的一种较早期MOG相关蛋白的制备流程15。尽管本文未详细说明，MOGtag蛋白的主要用途是通过蛋白抗原免疫来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。一种与MOGtag蛋白兼容的小鼠EAE诱导方案可参见文献3。我们此前已证实，使用MOGtag或由MOGtag衍生的MOG1-125进行免疫，不仅能够诱导出比标准MOG35-55肽更强的中枢神经系统自身免疫性疾病，表现为更显著的脊髓炎症和脱髓鞘，而且还能激活识别MOG蛋白的致病性IgHMOG B细胞，使其针对MOGtag或MOG1-125产生生发中心反应，而MOG35-55则无法实现这一效应5...

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披露

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作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

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本研究工作获得了加拿大多发性硬化症协会的资助。RWJ 获得了加拿大多发性硬化症协会Waugh家族博士生奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BL21 E. coli- pet32-MOGtagKerfoot 实验室需要这些细菌来表达 MOGtag 蛋白。这些细菌的甘油菌种可根据要求提供。
LB 培养基（Miller 配方）BioshopLBL407.1
氨苄青霉素bio basicAB0028将粉末溶于 50% 乙醇/50% H2O，配制成 100 mg/ml 溶液。于 -20 °C 保存。
IPTGBioshopIPT002.5将粉末溶于 H2O，配制成 1 M 溶液，于 -20 °C 保存。
鸡卵溶菌酶BioshopLYS702.10将粉末溶于 H2O，配制成 50 mg/ml 溶液，于 -80 °C 保存。
吐温 X-100SigmaT-8532
磷酸盐缓冲液（PBS）life technologies20012-027无需使用商用磷酸盐缓冲液，任何实验室自制的标准 PBS 均可满足要求。
氯化钠BioshopSOD004.1
Tris-HClBioshopTRS002.1
咪唑BioshopIMD508.100
盐酸胍SigmaG3272纯度必须高于 98%。
0.5 M EDTAbioshopEDT111.500
硫酸镍(II)BioshopNIC700.500
His Bind 树脂EMD Millipore69670-3以 20% 乙醇/80% H2O 保存于 4 °C
无水乙醇Commercial AlcoholsP016EAAN根据需要用水稀释。
冰醋酸BioshopACE222.1
三水合乙酸钠BioshopSAA305.500
牛血清白蛋白标准品bio-rad500-0206
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液bio-rad500-0006
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Fisher scientificBP120-500
Tris 碱BioshopTRS001.1
7000 分子量截留蛇皮透析管Thermoscientific68700
2-巯基乙醇SigmaM3148-25ml该试剂不得在通风橱外操作。
AcTEV 蛋白酶lifetechnologies12575-015可使用（https://www.addgene.org/8827/）构建并表达 TEV 蛋白酶，并参照文献 17 进行纯化。
聚乙二醇 3350BioshopPEG335.1
聚乙二醇 8000BioshopPEG800.1
Nunc MaxiSorp 平底 96 孔板ebioscience44-2404-21
超声破碎仪Fisher scientificFB-120-110
Eon 微孔板分光光度计Biotek11-120-611该设备使用 Gen5 数据分析软件。
Gen5 数据分析软件BioTek
十二烷基硫酸钠BioshopSDS001
溴酚蓝BioshopBRO777
甘油BioshopGLY001
蛋白脱盐柱Thermoscientific89849
甘氨酸BioshopGLN001
预制 12% 聚丙烯酰胺凝胶bio-rad456-1045
快速染色试剂EMD Millipore553215
凝胶成像系统（Gel Dock EZ）bio-rad1708270
白光样品托盘bio-rad1708272 与凝胶成像系统（Gel Dock EZ）配合使用，用于考马斯亮蓝染色成像
蛋白分子量标准bio-rad1610375

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470(2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).

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B MOG

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