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传粉生态学的野外实验：以血红石蒜（Lycoris sanguinea var. sanguinea）为例

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DOI：

10.3791/54728

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2016年11月25日

 , 
1Department of Biology, Chiba University

本文内容

摘要

为了揭示某种植物物种的传粉者有效性，已开发出多种野外实验方法。本研究以红花石蒜（Lycoris sanguinea var. sanguinea）为例，展示了传粉生态学野外实验的基本方法，并介绍了一种新的传粉机制——花蕾破裂传粉（breaking-bud pollination）。

摘要

植物与传粉者之间的相互作用已有一百余年的研究历史。在此期间，人们发展出多种野外研究方法，以明确各类传粉者对所访问花朵的传粉有效性。观察传粉者活动是最常用的识别传粉者的方法之一，而套袋与笼控实验则被广泛用于验证特定传粉者的有效性。在对Lycoris sanguinea var. sanguinea的既往研究中，其有效传粉者、各类访花者的访花频率以及繁殖策略均尚未明确。本研究报道了小型蜜蜂访问部分开放花朵（破苞期花）的现象。据我们所知，该现象此前未见报道。此外，本研究还检验了小型蜜蜂在该开花阶段是否能够完成传粉的假设。本研究以L. sanguinea var. sanguinea为例，展示了传粉生态学野外实验的基本方法。通过传粉者观察与数码录像，记录了各类访花者的访花频率。套袋与笼控实验结果表明，这些花朵能够实现完全传粉，且破苞期传粉可能对该植物物种的传粉具有重要意义。本文还讨论了每种方法的优缺点，并介绍了包括实验室实验在内的最新研究进展。

引言

植物与传粉者之间的相互作用是研究进化生物学和生态学的典型范例。花与传粉者之间的互利关系被认为通过自然选择促进了被子植物的多样化1,2，尽管其他生物和非生物因素也产生了影响3,4,5。人们还认为， floral traits（花部性状）已发生改变，以适应最有效的传粉者，从而产生更多的果实和种子6。这些观点是通过基于不同指数（如传粉有效性）的大规模研究并结合多种解释而建立起来的7。

具有泛化传粉系统的开花植物会受到多种类型的传粉者访问8。本文中，将访花者定义为访问花朵以获取花部报酬的动物物种，而传粉者则定义为能够完成授粉的访花者。这些访花者中，部分个体可将同种花粉粒携带至所访问花朵的柱头，因而可被归类为传粉者。其他访花者也可能携带一定量的种内花粉，但由于访花者与花朵之间存在行为或形态上的不匹配，其传粉作用可能较弱。这种在促进植物繁殖方面贡献程度的差异，可能导致对花部性状不同程度的选择压力9，并进而引起开花植物的适应性分化。因此，尽管传粉者群落的组成及各物种的相对多度具有重要意义10，准确评估每种访花者的传粉有效性对于阐明植物的适应性和（或）进化过程同样至关重要。

本研究中，对传粉者效率进行了定量估算，传粉者效率定义为每次访问所产生的果实和种子数量11。观察了每种访花者的种类及其访问频率，并估算了其对被访问花朵的繁殖影响。通过人工观察记录访花行为是传粉生态学中的经典方法。然而，该方法给观察者带来较大负担，要求其长时间停留在植物前方并进行细致、长期的测量。近年来，摄像与记录技术迅速发展，低成本的数码摄像机使得视频记录技术得以应用于传粉者观察12,13。这些方法有助于获取访花者的基本信息，并推动对目标植物物种传粉生态学的理解。

然而，传粉者的访问频率并不一定与其传粉效果相关7,14，因此评估每种传粉者对花朵适合度的定性影响非常重要。传粉效果通常通过柱头上的花粉粒数量15,16、花粉管生长情况17,18以及果实和/或种子产量19,20来估算。使用仅允许特定访花者进入的套袋进行的套袋实验，是检测自交亲和性、自花授粉21,22以及无融合生殖存在与否的常用方法23。此外，针对访花者群落中某一特定传粉者的传粉效果评估，通常在限制其他访花者的环境中进行（即在开花植株上设置网眼足够小的金属笼、网罩或套袋，以排除较大的传粉者）。例如，通过使用小网眼套袋的实验揭示了蚂蚁或蓟马的传粉能力24,25。此外，利用金属笼或网罩排除鸟类的实验已证实了Aloe类群中的有效传粉者26–28。

本研究的目标是：1）介绍先前论文中使用的方法；2）改进这些方法，以便在其他关于访花昆虫、访花频率及其对植物适合度影响的研究中普遍应用。Lycoris sanguinea var. sanguinea 是石蒜属（Lycoris）的一个物种，广泛分布于日本，在韩国分布范围较窄29，具有漏斗状的红橙色花朵（图1a）。先前的研究发现，L. sanguinea var. sanguinea 会受到多种昆虫的访问，包括一种未鉴定的小型蜜蜂以及体型较大的 Amegilla florea29。然而，这些访花者的访花频率和传粉效率尚未明确。为鉴定访花者，首先开展了传粉者观察。观察发现，小型蜜蜂会在花朵尚未完全开放时（即破苞期花蕾；图1b、1c）进行访花活动。这些小型蜜蜂在破苞花蕾中未开裂的花药周围快速移动，并用其上颚采集花粉。我们推测，在破苞期阶段，小型蜜蜂可能具有传粉功能，因为此时花朵中花药与柱头之间的间隙小于蜜蜂的体长。因此，开展了套袋实验，以检验小型蜜蜂在破苞期阶段的传粉能力，并进一步探究 L. sanguinea var. sanguinea 的繁殖策略。在小型蜜蜂访花后对花蕾进行套袋处理，从而评估其传粉能力。实验个体被置于笼中，笼内包含未开放的花蕾。使用细网眼的笼子，仅允许小型蜜蜂通过，从而可在整个开花阶段评估小型蜜蜂的传粉效率。

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方案

注意：本文基于我们之前的工作30。部分内容经日本植物学会和施普林格·日本公司许可重新使用。

1 . 观察访花者

  1. 观察区域的选择
    1. 搜索植物材料分布的区域，并利用可靠的资源（如图鉴、学术期刊）选择候选研究地点， 等等。 根据研究目标调整研究地点的数量（例如， 日本各地多种地点的传粉昆虫比较研究。
    2. 检查所选候选人群的位置及其与相关起点（如研究机构和住宿地）的距离，若需开展长期研究。
    3. 通过计算单位面积内的植物个体数量，粗略估算每个种群的大小。选择个体数量较多的种群，用于需要大量植物个体的操纵性实验。
    4. 开花访花者观察前准备
      1. 根据种群密度，确定每个区域内将在相同时间间隔内被观察的目标个体。选择5-10朵刚开放的花朵或即将开放的花蕾作为目标花，剔除已经衰败或完全开放的花朵。
      2. 开始全天的视觉观察，因为不同时间段可能有不同种类的传粉者访问花朵31,32.
      3. 在记录表上，记录每小时每朵花的访花者物种名称及每次访问的时间。
      4. 仔细观察访花者是否触碰到花药和/或柱头；若触碰，则记录为传粉者。若访花者仅访问花朵而未接触生殖器官，则记录为访花者。
      5. 使用昆虫网或手工制作的吸虫器捕捉访花昆虫，以鉴定并制成标本保存（图1f用乙酸乙酯或手指按压胸部迅速杀死捕获的访花昆虫，并将其保存在软袋中，或用100%乙醇保存于塑料管或容器中。
      6. 观察结束后，根据形态特征确定标本的具体名称；若鉴定存在困难，应针对每个分类群寻求相关专家协助。
  2. 野外观察
    1. 根据研究地点的可及性、种群规模以及传粉访花者数量来选择研究样地。选择涵盖花期中具有代表性的传粉访花者类群的时间段，并根据研究目标确定观察时段。例如， 对于关于访花者访花频率波动的研究，应设置较长的时间段。
    2. 准备合适的录像设备，例如数字摄像机（例如， 用于夜间记录时，应使用具备红外功能的摄像机。
    3. 以与1.1.4节相同的方式选择目标花朵。
    4. 将摄像机固定在铝制三脚架上。将装有摄像机的三脚架置于目标个体前方，距离约50 cm。
    5. 拍摄前检查并调整屏幕显示中材料的光照强度和聚焦。
    6. 同时开始视觉观察和视频拍摄，观察时段根据前期预观察所估算的合适时间区间确定（本研究中，平均观察时长超过六小时，约为上午05:00至下午13:00）。
    7. 确定访花者和传粉者的物种名称，并在记录表上记录其名称及访问时间。
    8. 以与1.1.4.5节相同的方法捕获并鉴定访花者和传粉者。
    9. 根据研究目标和预观察数据确定观察周期，并针对每个观察周期重复步骤 1.2.1 至 1.2.7。
  3. 观察后的数据分析
    1. 在完成传粉者观察后，以与1.1.4.6节相同的方法鉴定所捕获标本的物种名称。
    2. 查看视频片段，并以与目视观察相同的方式记录物种名称及其访问时间。
    3. 根据视觉观察和视频记录数据，计算每种访花者单位时间内每朵花的访问频率。利用基础统计学方法及适当的软件（如 R、SPSS 和/或 SAS），在不同地点和年份之间对各类访花者的访问频率进行统计比较。33-35 (例如， 使用R软件进行双因素方差分析（ANOVA）及Tukey显著性差异检验（HSD）

2 . 套袋与罩笼实验

  1. 套袋与笼式实验的准备工作
    1. 对于套袋实验，准备网眼较小（约0.5–1 mm）的袋子，以完全阻止访花行为例如， 非织造布袋用于2011年和2012年的套袋实验。
    2. 对于笼式实验，准备直径允许目标小型访花者通过但排除较大型访花者的金属丝或塑料网板，并将这些网板连接形成笼子。确保笼体无大于网孔直径的缝隙。根据目标植物种类及个体数量调整笼子的大小和形状。
  2. 装袋实验
    1. 每个处理组选择30株未受食草动物或严苛环境损害的个体。在处理时，从每株个体植株上选取一朵花，或在同一植株上使用单独的花朵。
    2. 在田间用标签带（序列号和字母）标记目标花朵后，将其套袋。 图1g）。注意不要触碰袋内的花药和柱头，以免发生自花授粉。
    3. 使用柔软的细绳或金属丝小心地将袋子固定在花朵上（图1d).
    4. 必要时，使用软绳或金属丝作为支撑，将单朵花直立固定，以防花朵因套袋或风吹导致倾斜或倒伏。将软绳或金属丝轻轻缠绕在目标个体的花梗上，注意避免造成损伤。
    5. 套袋实验中的处理方法
      1. 对于 "对照" 处理时，将标签贴在目标花朵上，不进行任何处理，允许传粉者自由访问。
      2. 对于 "异交" 处理时用袋子罩住花芽直至开花，然后去除套袋花朵的花药。将多个个体的花粉粒涂抹到柱头上。
      3. 对于 "自交" 处理时覆盖花芽直至花朵开放，将同一花朵的花粉授到其柱头上，然后再次覆盖处理过的花朵。
      4. 对于 "自动自体" 处理后，用袋子将花芽覆盖，直至开花季节结束。
      5. 对于 "打破芽休眠" 处理，识别已被访问的萌发芽，并观察小型蜜蜂的进入或离开图1b, c). 去除即将开放花蕾的雄蕊，以防止小型蜜蜂访问后再次将花粉沉积到同一朵花上，并迅速套袋以避免后续访问。
      6. 对于 "开花" 处理时，在花蕾开放前将其套袋，以避免在花蕾破开阶段受到访花者的影响。之后，去除套袋，允许访花者采集花蜜和花粉。
      7. 对于 "芽" 处理时，从未开放的花蕾中去除雄蕊，并进行人工异花授粉。迅速套袋以防止花朵被访问。
  3. 笼养实验
    1. 用准备好的罩笼覆盖目标植株个体。手动调整罩内花朵的位置，防止不同柱头之间的接触及花粉沉积。图1e).
    2. 对于 "笼" 处理时，选择具有未开放花蕾的个体，并为其贴上标签以标识所选花朵。用笼子罩住带有标签花蕾的个体，以排除笼子建立之前的影响。即， 传粉昆虫无法访问未开放的花蕾，因此只能评估在放置笼子后前来访问的昆虫的影响。
    3. 使用铁杆将笼子牢固地固定在地面上，以防止人员从笼子底部与地面之间的缝隙进入。
  4. 袋装与笼养实验后的数据分析
    1. 在开花季节结束时，收集所有已标记的花朵（图1g通过切割并从母体个体上分离来获取样本。将每个标记的样本单独保存，以防止交叉污染。
    2. 检查每个标记花朵的坐果情况，记录成功坐果果实的种子数量。
    3. 根据所有记录的数据，计算每朵花的果实数量比例（坐果率，定义为果实数量除以花朵数量）以及每个成熟果实中的种子数量比例（结实率，定义为种子数量除以胚珠数量）。
    4. 使用适当的方法和软件（如 1.3.3 中所列）对不同处理间的坐果率和结实率进行统计学比较例如， 使用 R 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）与 Tukey's HSD 检验或 Fisher 精确检验33).
    5. 利用装袋实验结果对材料进行研究
      1. 为了检验动物传粉者的必要性，对以下结果进行统计学比较 "对照" 和 "自动自体" 处理
      2. 为了估算花粉限制的程度，比较 "对照" 和 "异交" 处理
      3. 为了检测自交亲和性，比较 "异交" 和 "自交" 处理
    6. 破芽授粉影响的评估
      1. 比较 "对照" 和 "芽" 处理以确定萌发芽的柱头是否具有生殖成熟性，以及该值 "对照" 在破芽期可使用该处理作为对照。
      2. 比较 "自动自体" 和 "打破芽休眠" 处理以确定在花蕾破裂阶段由小型蜜蜂授粉的花朵的繁殖成功率是否在统计学上高于进行自花授粉的植株即， 测试破芽授粉是否存在）。随后，将这两种处理方式与 "对照" 评估花蕾破裂授粉的授粉效率。
      3. 比较 "打破芽休眠" "笼具，" 和 "开花" 通过破芽授粉处理来评估其对繁殖的影响。

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结果

选择了五个种群进行传粉者观察。在观察前阶段，确认了多种昆虫对开放花朵的访问以及小型蜜蜂对破苞花蕾的访问。对访花者的观察显示，所有五个研究地点的大多数访花者均为小型蜜蜂物种Lasioglossum japonicum的个体。图2显示，该物种在这三个地点的访问比例均超过90%。相比之下，第二常见访花者Amegilla florea在这些田块中的访问比例均低于10%。这些蜂类在访问花朵时接触了柱头，因此被记录为传粉者。其他较常见的访花者，如Episyrphus balteatus，在采集花粉时未接触柱头，因此仅被认定为访花者而非传粉者。在一个地点的数据分析表明，通过目视观察记录的小型蜜蜂访问频率显著高于视频记录的结果（表1：单因素方差分析：地点2：df = 1，F = 0.471，P = 0.50；地点3：df = 1，F = 12.12，P <...

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讨论

本研究采用花朵观察和套袋实验，分别揭示访花频率和植物的雌性繁殖成功率。根据 Dafni（1992）38 的记载，录像法具有有效性，因其可记录访花者出现的时间和持续时长以供分析，并避免观察者偏差。然而，当时该方法需要昂贵的设备，且观测时间受限于电池寿命。近年来，用于录制视频的设备成本已下降，这种技术手段可应用于其他传粉者研究中。本研究中，在3号地点，目视观察与视频观察所记录的访花频率存在显著差异（表2）。这可能是由于对访花者的过度观察所致，而此类人为误差可通过该方法予以排除。Dafni（1992）还提到使用套袋或网罩实验来研究植物的繁殖系统38。本研究采用了无纺布袋，但此类袋子不具备防花粉或防水功能。L. sanguinea var. sanguinea 并非风媒传粉物种，但雨水可能影响套袋花朵的繁殖成功率。研究中使用铁制支架支撑因袋子湿润而负重增加的植株，但这些因素仍可能影响花朵的繁殖能力。使用支架配合防虫网罩覆盖整株植物，可能是消除此类方法学问题的最佳选择。此外，本研究还采用笼隔方法实现不同蜂类物种的分离，这是植物研究中首...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢三位匿名审稿人对稿件提出的有益意见。本工作部分得到了日本学术振兴会（JSPS）博士后基金（26.11613）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
记录表任意NA
昆虫网任意NA
吸虫管任意NA
乙酸乙酯任意NA
100% 乙醇任意NA
塑料管任意NA
塑料盒任意NA
软质袋任意NA
数码摄像机任意NA
三脚架任意NA
袋子任意NA
金属或塑料网板任意NA
铁丝任意NA
标签胶带任意NA
支撑杆任意NA
软绳或金属丝任意NA
镊子任意NA

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