研究蛋白质的质量控制体系Ð。菌使用温控活细胞成像

摘要

社会变形虫 Dictyostelium disccoideum 最近被建立为研究蛋白质错误折叠和蛋白质稳态的系统。在这里，我们描述了一种新的基于成像的方法，用于研究温度诱导的蛋白质聚集和盘状芽孢杆菌中的细胞应激反应。

摘要

社会变形虫 Dictyostelium disccoideum 的复杂生活方式使其成为研究各种生物过程的宝贵模型。最近，我们表明 D. discoideum 对蛋白质聚集具有显着的弹性，可用于深入了解细胞蛋白质质量控制系统。然而，使用盘状芽孢杆菌作为模型系统对基于显微镜的实验方法提出了一些挑战，例如细胞的高运动性和它们对光毒性的敏感性。在研究蛋白质稳态时，后者被证明特别具有挑战性，因为光毒性作用可以诱导细胞应激反应，从而改变蛋白质质量控制系统的行为。

温度升高是诱导细胞应激的常用方法。在这里，我们描述了一种温度可控的成像方案，该方案允许在 D. disccoideum 中观察温度诱导的扰动。此外，当在正常生长温度下应用时，该成像方案还可以显着降低光毒性，从而允许以更高的强度进行成像。这在对表达水平非常低的蛋白质进行成像时特别有用。 此外，细胞的高迁移率通常需要采集多个视场以跟踪单个细胞，并且需要根据所需的时间间隔和曝光时间平衡视场的数量。

引言

粘菌是独居生活的土壤变形虫，关于细菌和其他微生物，这是由吞噬占用饲料。它具有独特和卓越的生命周期，因为它的发现¹已成为研究的主要领域。在多细胞发展²和趋³的分子基础早期兴趣很快被研究集中于细胞运动性，细胞极性，先天免疫补充。此外，D。菌是作为生物医学研究^4,5模型系统。

最近，我们成立D.菌作为一个新的系统来研究蛋白质的质量控制（PQC）系统^6,7。其蛋白质在聚集倾向朊状蛋白质，这对以蛋白质量控制⁸个挑战富集。调查是否D.菌开发了特殊的分子机制，以控制其高度股份公司gregation容易发生蛋白质组，我们研究了两个在正常生长条件和应力期间聚集倾向标记蛋白的行为。应力的条件下，如热应力，可用于增加蛋白质错误折叠⁹的速率。因此，我们寻求的系统，其中，我们能诱导的温度变化，同时按照标记蛋白的行为。为了这个目的，我们结合使用热阶段插入件（冷却室）珀耳帖控制的加热活细胞成像。该方法使我们能够保持恒定和均匀的温度，以及以诱导快速而精确的温度变化。

活细胞成像是用于研究各种D中的生物过程的菌 。然而，这种方法面临两个主要限制。首先，将细胞显示高运动性和倾向于迁移出的视场，从而跟踪单个细胞通常需要大面积成像。细胞迁移率可以通过琼脂覆盖¹⁰被降低，然而，在这些条件不适合长期成像由于存活率下降。其次，D.菌细胞显示到光毒性，这导致细胞变圆和有丝分裂停滞¹¹特别高的灵敏度。以前的协议通过加入抗坏血酸作为自由基清除剂和减少曝光时间¹²解决了这个问题。如果感兴趣的蛋白以低水平表达，并显示弱荧光信号，后者可以是至关重要的。作者还建议要么通过在空调房间成像或通过使用温度控制孵化箱，覆盖的目标和显微镜载物台^12，以提供21℃的恒定温度。

这里，我们通过使用冷却室设置在23℃下描述了具有改进的温度控制的方法。在成像过程中我们设置了显著增强了光毒性的阻力。它允许更高的曝光时间和更高的激励光强度的用法。这是特别重要的时间推移成像过程中，当时间间隔需要针对成像位置的数量和所使用的曝光时间仔细地平衡。增加成像位置的数量的可能性还允许更宽成像区域的覆盖范围，并促进个体细胞的跟踪在一段较长的时间。

方案

1.细胞的制备

1. 生长的细胞
   1. D.成长菌细胞在组织培养板在光照下在23℃的AX介质。避免将电池在高密度的75％以上汇合。
      注意:为获得最佳的反应热应力，细胞需要在指数生长期和不应该达到稳定期。
   2. 成像前一天，分裂细胞进入低荧光介质（LFM）至1×10 ^4个细胞/ ml。
      注:该步骤是必要的，以减少所造成的对AX介质背景荧光。培养时间可以减少到最低限度2小时。然而，在AX中占据囊泡仍然可以产生2小时后的背景信号。
2. 准备细胞显微镜
   1. 成像前，从在LFM组织板收获细胞并转移细胞的足够数量的成玻璃底菜。
      注:通常情况下，1×10 ^5个细胞/ ml就足够了;然而，如果该实验装置需要长的摄像周期（超过8小时以上），细胞数需要仔细调整，如D.菌细胞将过渡到发育周期，并开始流和聚集体，如果细胞数是高而营养素是低的。
   2. 使细胞沉降20分钟。通过用新鲜培养基小心替换使用介质去除未结算的细胞。

2.影像学检查

注:该协议可在宽视场的系统，以及在共聚焦显微镜的设置中使用。覆盖的目标温度控制的培育箱和显微镜载物台的使用是有益的，但对于温度控制不是必须的。如果进行热应力孵育箱的温度设置为在实验中， 例如 ，所使用的最高温度，以40℃。否则，将温度设定为256℃。温度的变化，应提前作出允许系统适应，作为成像期间的温度变化可影响焦点。
注意:在成像时，温度是使用冷却室进行控制。用于成像非应激细胞默认的温度为23℃。对热应力的条件下，将温度相应地增加至期望的水平。在冷却室中的压电元件可以非常快速响应温度变化。然而，图像的焦点会略微改变（它可以偏离到最多20微米的取决于温度移）。因而手动重聚焦是图像采集的第一分钟内需要，除非所使用的显微镜​​配备有硬件自动对焦。

1. 图像无压力条件下采集
   1. 在23℃下非胁迫条件下的图像的细胞，获得最小的视图6字段（视场）的。
      注:非应激条件可以是visualiz编辑或者通过记录代表剧照很短的时间推移（5-30分钟）或收购。对于每一个条件或细胞系获得最低的视图6场（视场）的。
      注:如果单个细胞是感兴趣，定位各个单元中的视场的中部，并记录一个3×3瓦系列用含有感兴趣的细胞在中间视场D.。菌细胞是能动的，并可能迁移出FOV的。然而，3×3瓦系列增加了由感兴趣的细胞潜在的探索区域，并为〜6小时的时间推移周期保持追踪。
   2. 获得的最大为7μm的z堆叠在1-0.25微米步骤，捕获细胞的整个体积。
   3. 获得一个基准亮场图像，以评估细胞的总数。
2. 图像采集热压力
   1. 根据制造商的说明调整冷却室的温度升高到30℃。
   2. 温度显示已达到所需的值后，手动重新聚焦在明场通道和启动时间推移前检查所有记录的视场。
   3. 开始的时间推移对于具有5-10分钟的时间点之间的时间间隔的热应力的4小时。检查收购前两个时间点的过程中正确的对焦。
3. 恢复过程中图像采集
   1. 热应激后，降低温度回到23°C，等待温度显示调节和手动重新调整。
   2. 记录时间推移电影在10-20分钟的时间间隔8-10个小时的恢复阶段。检查收购第一时间点的过程中正确的对焦。

3.图像分析

注意:为了量化细胞窝藏胞质灶的数目，评估细胞的总数和细胞与每次在胞质灶的数目帧。由于来自亮场图像分割细胞的难度，量化需要手动完成。在下文中，数据分析是针对游离的图像处理包（（http://fiji.sc/Fiji），它需要的插件"细胞计数"（http://fiji.sc/Cell_Counter）中所述。

1. 评估细胞总数
   1. 通过点击"文件"和"打开"加载亮场图像堆栈（XYT）。
   2. 打开"细胞计数"插件（"插件" - "细胞计数"）。通过点击"初始化"加载图像堆栈。
   3. 勾选相应的方框选择合适的类型计数器。
      注:作为计数器细胞总数和2型作为计数器与胞浆灶细胞利用类型1。算上所有的细胞。
   4. 通过点击"保存标记"保存标记。
2. 评估细胞的胞浆与病灶数
   <李>加载荧光图像hyperstack（XZYT）（"文件" - "打开"），并使用"Z-投影机"（图/堆栈）的最大强度投影。
   1. 打开"细胞计数"插件。通过点击"初始化"加载生成的图像堆栈（XYT）。
   2. 通过点击"加载标记"加载标记。
      注意:参考图像和荧光栈的文件名必须相同。如果有必要，初始化图像堆栈前据此命名。
   3. 选择适当的标记类型（参见3.1.3节）和计数与胞浆灶细胞。现有的标记物可以用作单个单元的位置的引导。
   4. 通过点击"结果"检索每片计数的数量和其他地方保存的计数进一步计算。

结果

所描述的成像协议可以用于分析在变形虫D.聚集倾向朊状蛋白质的行为热应激菌 。 图1示出了GFP标记多聚蛋白Q103的细胞正常生长条件（ 图1A）根据在30℃（ 图1B）和6小时应力恢复之后和分配2小时热胁迫之后生长在正常生长条件（ 图1C）。在从23°C的温度上升到30℃时，Q103-GFP标记从弥漫性分布聚结，点状结构。在应力释放和生长在常温下，这些结构溶解。 Q103-GFP的再分配和形成热应力诱发的胞质灶可以利用图像分析来定量。 图2A示出了使用斐济和插件"C个人视场的分析。埃尔计数器" 图2B显示了热应激反应的量化。这表明在数量胞质Q103-GFP疫源地增加与持续热应激。在热应激，蛋白质的质量控制（PQC）系统不堪重负，从而在一起的汇聚易发生蛋白如朊状蛋白质Q103不能以可溶状态在细胞内病灶进行维护和日益集合体。细胞也展现出特征性修圆， 如图1B中所示胞质灶的应力除去后的减少表明，聚集蛋白质溶解。

成像质量是对初始细胞密度敏感。 图3示出了应力恢复后的细胞的一个例子，比较合适的初始细胞密度（ 图3A）和高的初始细胞密度（ 图3B）。如果初始细胞密度过高，将细胞星如在图3b中描绘泰德以形成流。这其中规定对后续量化的细胞困难移出焦平面。

所描述的方法可以用作上述监测温度引起的变化。它也可用于在生理生长温度成像时降低光毒性。 图4显示细胞在冷却室（ 图4A），在23℃成像和细胞在空调房间没有温度控制成像的对比，设置至25℃（ 图4B）。在恒定暴露于激发光，将细胞围捕时温度控制的条件下不成像。这种改变细胞形状正指示应力。

图1: D.组成型表达菌细胞（在倒灰度查询表中描绘的GFP信号）。 （a）根据在23℃，Q103-GFP正常生长条件被漫分布在细胞质中。 （B）后在30℃下2小时的热应力，Q103-GFP凝聚成胞质灶（红色箭头）。这些细胞表现出典型的形状变化和围捕。 （c）在应力释放和增长在23°C，胞浆灶溶解。 6小时后，没有胞质灶可以观察到。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2: 热诱导细胞内病灶形成的定量 （A）使用免费的图像处理包斐济和插件"细胞计数"细胞分析。细胞的总金额（类型1，蓝计数器标记）在亮场图像来确定。标记被加载在GFP通道，并与细胞质灶的细胞（2型，红色计数器标记）被确定的数目。 （B）灶的量化后在30℃热应激3小时，并在23℃搅拌3小时紧张的恢复。（N =来看，误差棒= SD 4场）， 请点击这里查看这个大版本数字。

g>的图3: 在长期的时间推移成像单元密度的影响初始细胞密度<10 ^5个细胞/毫升成像（A）细胞。在30℃热应激3小时，并在23℃，压力恢复6小时后，细胞仍然停留在生长周期和鸿沟。只有少数细胞退出焦平面。 （B）中的细胞以初始细胞密度> 10 ^6个细胞/ ml的成像。成像（设置在A）的9小时后，将细胞已进入发育周期，并开始流和聚集。在聚集体的细胞不能明确区分。细胞的很大一部分离开焦平面，不能进行分析。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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成像影响光毒作用的温度控制（A）的细胞10分钟，用温度控制在23℃:图4。图，Z堆叠（间距0.5微米，样品厚度8微米），时间推移的6个字段（总时间10分钟，经过1分钟），使用GFP通道（0.07毫秒的曝光时间，10％激光强度），RFP通道（0.1毫秒的曝光时间，10％激光强度）。细胞没有显示与光毒性应激相关的形态学改变的迹象。成像（B）的细胞为不带温度控制的10分钟（相同的条件A）。细胞表现出光毒性诱发的舍入的迹象，表明应力。比例尺= 10微米。将细胞成像基于与100×/ 1.4数值孔径（NA）物镜的显微镜的系统上。该图像用CCD照相机作为使用1×1像素合并1024x1024个像素文件中收集。4large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

讨论

这里所描述的协议可以用来研究响应于热诱导应力感兴趣的特定蛋白质的行为。温度上升至30℃已报道触发热应激反应和D的在这些条件下的生存能力菌被显着地降低了。

修改
该协议可以被修改，以比较同胁迫条件下不同的蛋白质的行为。为此，表达相同荧光标记不同的蛋白质细胞转移到多井菜肴，如四腔菜（第1.3.1节）。该协议也可以在细胞共表达不同的标记物，如GFP或RFP蛋白施加。这可以是例如用于监测蛋白质的质量控制（PQC）系统的不同组件的行为。表达GFP标记聚集的标记和不同的RFP标记PCQ组件细胞可以使用多井观察抛出成像。这确保相同的应力条件下（温度上升/下降，温度上升/下降的持续时间速度），并允许进行比较研究。

此外，该协议可以用于研究PQC系统对热应激反应的影响。各组分的活性可以通过改变使用的遗传工具，例如敲除或过度表达水平或通过使用商购的特异性抑制剂⁶进行调制。蛋白酶可以通过添加MG132（100μM）或乳胞素（10μM）的生长培养基中被抑制。伴侣Hsp90的可使用格尔德霉素（6微米）或根赤壳菌素（10μM）被抑制。伴侣热休克蛋白70可与VER-155088抑制，虽然我们无法证实抑制的功效在我们的实验设置为止。抑制剂应成像之前添加一天，将细胞温育14小时。

Criti该议定书内校准步骤
为热诱导扰动的评估关键步骤是先于成像实验的细胞的状态。在酵母中的研究表明，细胞在固定相¹³获得的各种环境胁迫的抵抗。我们还观察到最小响应施加热应激，如果D.菌细胞已经成像之前达到稳定期。因此，保持恒定的细胞数<5×10 ^5个细胞/ ml是至关重要的。

此外，高细胞数量可以从D的生长周期诱导转型菌的发育周期，从而引发饥饿的途径，这可能会导致不同的响应热应激。如果高细胞数在热应力，流后的恢复阶段达到和凝集细胞可以与数据分析干扰随着细胞移出焦点（ 见图4）。

内容">的技术限制
重点的损失是协议的瓶颈。在温度改变期间，焦平面可以显着移位，这需要在一个时间周期手动再聚焦改变温度之后。在聚焦跳有时可能太极端通过软件自动聚焦可以克服，特别是如果时间点之间的时间是高的。但是，如果使用显微镜配备有硬件自动对焦，这个瓶颈可以规避。

相对于现有方法的技术意义
在与现有的设置，如使用的空调房，温度控制的培育箱覆盖的目标和显微镜载物台或温度控制的阶段和客观衣领比较，使用冷却室提供了环境的一个更精确的控制温度。在冷却室中的珀耳帖元件可以保持恒定和均匀的统023在整个实验装置。在古典设置中，局部温度差异可能导致不同的观察结果。此外，它可以迅速和快速响应的温度引起的变化，而经典的设置适应非常缓慢地引起的温度变化，特别是降低温度。在冷却室中的珀耳帖元件也可以覆盖一个更宽的温度范围（15-40℃）比传统的设置，与到达温度如15℃或40℃下是很困难的。

粘菌是光毒性特别敏感。以前的研究使用抗坏血酸作为清除剂，以减少光毒性。然而，长期的成像时间需要额外补充。此外，使用抗坏血酸限于其中感兴趣的机构不受抗氧化剂补充研究。我们建议，温度控制的成像可被用来作为一种替代APPRoach以最小化光毒性和可与加成抗坏血酸被组合以进一步减少毒性。

光毒性效果可以通过使用冷却室中提供的23℃的恒定和均匀的温度最小化。使用温度控制的成像细胞显示较少的光毒性，如细胞变圆的迹象，在较长的时间段。这也使得成像具有更高的强度，更小的时间间隔或视（视场）更多的领域。

一般应用
在更高温度下的热应力已经显示出触发不同热应激反应^14。因此，温度上升到34℃或37℃可能诱导不同的响应。除了所应用的温度应力，一个特定的压力的情况下的持续时间可以被修改以研究立即响应或长期适应热应力。

在一般情况下，所描述的协议可以是扩大到一系列广泛的应用。由于精确的温度控制大大降低光毒性作用，该协议可以在需要高的曝光时间和/或较高的激发光强度， 例如 ，对于具有低表达水平可视化蛋白设置来使用，或者在短的时间间隔组合成像， 例如 ，延时成像期间之间。它也可以是用于成像跨越整个细胞的对象是有利的， 例如 ，微管，因为这些设置需要大量的光学Z截面的。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AX培养基	用于中等	AXM0102
LoFlo	用于培养基	LF1001
MG132	Sigma	C2211
乳囊蛋白	Sigma	L6785
格尔达霉素	Santa Cruz	sc-200617
根治性	Santa Cruz	sc-200620
MatTek disch 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	玻璃底成像皿
CellViell 细胞培养皿	Greiner	627870	4 隔间玻璃底成像皿
热载物台加热器/冷却器插入	Warner Istruments	TB-3/CCD
双极温度控制器	Warner Istruments	CL-100
液体冷却系统	Warner仪器仪表	LCS-1