利用流式细胞术测定重组离子通道的细胞表面相对表达量与总表达量

摘要

遗传性心律失常通常由突变引起，这些突变会改变一种或多种离子通道在细胞表面的递送。本文中，我们改进了流式细胞术检测方法，用于定量分析在tsA-201细胞中表达的重组离子通道的总蛋白和细胞表面蛋白的相对表达水平。

摘要

遗传性或 从头合成 阳离子选择性通道的突变可能导致心源性猝死。这些多跨膜蛋白在细胞质膜上的转运异常，无论是否伴随通道门控行为的改变，通常被认为在此过程中起着重要作用。因此，建立一种能够大规模定量分析心脏离子通道相对细胞表面表达水平变化的方法变得至关重要。本文提供了一种详细方案，用于测定心脏L型钙通道Ca_V1.2 及膜相关亚基在 tsA-201 细胞中的表达，采用双色荧光流式细胞术检测。与基于显微镜或免疫印迹的定性方法相比，流式细胞术实验具有快速、可重复和高通量的特点，可对大量活细胞样本（数量范围从 10⁴ 至 10⁶ 具有相似细胞特性的细胞）在单次流式检测中进行分析。构建的质粒设计为在细胞内C末端组成型表达mCherry（从而可快速评估总蛋白表达水平），同时在胞外区域表达血凝素（hemagglutinin, HA）表位，以便利用抗HA荧光标记抗体评估膜蛋白的细胞表面表达。为避免假阴性结果，还对透化处理的细胞进行实验，以确认HA表位的可及性及正确表达。本方法详细介绍了以下步骤：（1）带标签DNA（脱氧核糖核酸）质粒的构建设计，（2）通过脂质体介导将质粒转染至tsA-201细胞，（3）非透化与透化细胞的培养、收集及染色，（4）荧光信号的采集与分析。此外，文中还解释了流式细胞术的基本原理，并深入讨论了实验设计，包括荧光染料的选择、HA抗体的滴定以及对照实验的设置。该方法可对离子通道的总表达量及细胞表面表达量进行客观的相对定量，且可拓展应用于离子泵和质膜转运蛋白的研究。

引言

本文提供了一种可靠的检测方法，利用现有的流式细胞术技术，报告在重组细胞中表达的膜蛋白（如离子通道）的相对细胞表面表达水平。离子通道是一类形成孔道的膜蛋白，通过调控离子跨细胞膜的流动来控制电信号。根据其激活机制、通过孔道的离子种类的性质及选择性，可对离子通道进行分类。在细胞和组织水平上，离子通道介导的宏观离子流是其生物物理特性（门控与通透）、生化特性（磷酸化）以及生物合成特性（合成、糖基化、转运和降解）共同作用的结果¹。这些过程对每种离子通道具有特异性，并经过优化以实现其特定的生理功能。因此，任何这些精细调控过程因遗传或基因突变而发生改变——通常称为“通道病”——都可能破坏细胞稳态。需要特别强调的是，将适量的离子通道递送至细胞表面对于维持细胞稳态至关重要。离子通道功能的轻微增强（功能获得）或轻微减弱（功能丧失）均有可能在一生中引发严重的病理后果。成熟离子通道向细胞表面递送的缺陷是多种通道病的重要决定因素，例如囊性纤维化（CFTR离子通道）² 和长QT综合征型心律失常（心脏钾离子通道）³。

通道病与心脏性猝死相关⁴目前全球范围内所有心脏离子通道病的患病率估计至少为1:2,000至1:3,000。⁵ 并导致约一半的突发性心律失常性心脏死亡病例⁶心脏电压门控钠离子、钾离子和钙离子选择性离子通道的功能障碍已知在此过程中起关键作用。L型Ca_V

方案

1. 双标记DNA构建体

1. 通过定点突变法将HA表位（YPYDVPDYA）插入Ca_Vα2δ1胞外连接区D676与R677之间（图3B）²⁰。使用正向引物gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC和反向引物acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC。
2. 将标记HA的Ca_Vα2δ1 cDNA序列亚克隆至哺乳动物表达载体pmCherry-N1中，使蛋白在SacI和SalI位点之间与mCherry的N端融合表达（图3B）²⁰。
   注意：需使用对照质粒并通过标准电生理方法检测通道功能是否正常²⁴。

2. 脂质体介导的瞬时转染（30 分钟，所有步骤均在层流罩内进行）

1. 第1天：在35 mm培养皿中接种50万个tsA-201细胞（或HEKT细胞），加入2 mL添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（PS）的高糖Dulbecco改良必需培养基（DMEM-HG）。使用标准血细胞计数板对细胞进行计数，并用台盼蓝染色法检测部分细胞样本的活力。接种足够数量的细胞，以确保转染时细胞融合度达到90%。
2. 第2天：更换培养基，加入2 mL新鲜预热（3....

结果

本文介绍了一种通过双色流式细胞术检测在tsA-201细胞中表达的重组离子通道的总蛋白及细胞表面蛋白含量的可靠方案。以Ca_Vα2δ1亚基为例，对其细胞表面与总蛋白的相对表达水平进行了定量分析。为实现双色流式细胞术检测，Ca_Vα2δ1被双重标记，表达一个位于细胞外的非荧光HA表位，该表位可被抗HA-FITC偶联抗体识别，同时表达一个持续性细胞内荧光蛋白mCherry。FITC与mCherry的激发和发射光谱显示，FITC在488 nm激光激发下效率达88%，而在561 nm激光激发下效率降至0%；mCherry在561 nm激光激发下可达到其最大荧光强度的63.9%，而在488 nm激光激发下仅为7.6%（图3）。两种荧光染料的激发与发射光谱均表现出最佳的光信号收集效率，并与所选激光器和滤光片组合之间的信号重叠最小。只要特定荧光染料的MFI与每个细胞中Ca_Vα2δ1蛋白的表达量成正比，而非仅反映荧光阳性细胞的数量，流式细胞术即可提供来自大量细胞群体的膜蛋白相对表达的定量信息。这.......

讨论

该基于流式细胞术的检测方法已成功应用于测量荧光标记的电压门控钙通道孔形成亚基及其相关亚基的相对总量和细胞表面水平^14,22,26。该方法最适合用于研究基因突变的影响，因此要求荧光标记的野生型带标签构建体的本征荧光强度至少比荧光标记的无标签构建体的荧光强度高10至100倍。在本实例中，本文所述的mCherry-Ca_Vα2δ1-HA构建体所产生的信噪比和动态范围均大于先前发表的Ca_V1.2-HA和Ca_V2.3-HA构建体所测得的结果。造成这一现象的原因可能有多种。可以推测，Ca_Vα2δ1蛋白胞外域中HA表位的局部环境优化了FITC偶联抗HA抗体的信噪比。

此外，需要注意的是，该方法无法提供细胞表面蛋白质数量的绝对值。然而，通过在相同条件下平行进行膜片钳和流式细胞术实验（如参考文献²²的图7所示），仍可获得为实现功能性通道表达所需的标记构建体的相对表达水平。根据这些数据可以估计，峰值电流密度（离子通道活性的整体性指标）通常随.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Q5 定点突变试剂盒	New England Biolabs	E0554S	可用 QuickChange 定点突变试剂盒（Agilent，#200523）替代。
1.5 ml 离心管	Sarstedt	72-690-001
15 ml 离心管	Sarstedt	62-554-002
一次性刻度移液管	VWR	160001-192
100 mm 培养皿	Corning	430167	用于 HEKT 细胞的常规培养。
35 mm 培养皿	Falcon	353001	用于 HEKT 细胞的常规培养。
1 ml 血清移液管	Sarstedt	86.1251.001
5 ml 血清移液管	Sarstedt	86.1253.001
10 ml 血清移液管	Sarstedt	86.1254.001
25 ml 血清移液管	Sarstedt	86.1285.001
DMEM 高糖培养基	Life Technologies	12100-046	使用前于 37 °C 水浴中预热。
胎牛血清，经鉴定，热灭活，美国来源	Life Technologies	16140-071
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-122
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019	用于脂质体转染。可用磷酸钙转染法替代。
Opti-MEM I 低血清培养基	Life Technologies	31985-070	使用前于 37 °C 水浴中预热。
胰蛋白酶-EDTA（1×）0.05%，含酚红	Life Technologies	25300-062
1.5 ml 微量离心管	Sarstedt	72.690.001
磷酸盐缓冲液（1×）	Fisher	BP661-10	可自行配制""。
抗 HA-FITC 标记抗体	Sigma	H7411
IgG1−FITC 同型对照抗体	Sigma	F6397
BD Cytofix/Cytoperm 固定/通透试剂盒	BD Biosciences	554714	用于固定/通透处理。通透/洗涤液需在 4 °C 保存。
血细胞计数板	Fisher	49105161
台盼蓝	Fisher	15250061	用于检测细胞活力。
制冷型微量离心机，5430R	Eppendorf	A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 培养箱	Fisher	370
实验室平台摇床	Fisher	545034
水浴锅	VWR	89032-216
BD FACSARIA III	BD Biosciences	648282	流式细胞仪。
FlowJo 软件 v10	FlowJo	FlowJo v10 Dongle	用于数据分析。