我们介绍一种使用滤膜筒过滤水样并提取环境DNA（eDNA）的方案，该方法无需切开滤膜筒外壳即可取出滤膜。本方案最初针对鱼类的eDNA宏条形码分析而开发，但也适用于其他生物的eDNA研究。
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本文内容
摘要
摘要
近期研究表明，鱼类的环境DNA（eDNA）可作为非侵入性监测工具，具有适用性。尽管多数此类研究采用圆盘状纤维滤膜从水样中收集eDNA，但许多水生环境中微生物相关研究已使用滤筒式滤器，因为滤筒在处理大体积水样以及整体操作便捷性方面具有优势。本文提供一种使用滤筒过滤水样并直接从滤膜中提取eDNA的实验方案，无需切开滤器外壳。本方案主要包括三个部分：（1）水样的过滤（水样体积 ≤4 L 或 >4 L）；（2）将滤膜置于预热的培养箱中，利用滚轴摇床进行DNA提取；（3）使用商业化试剂盒对DNA进行纯化。结合本方案与先前已使用的方案，我们对一个已知物种组成的大规模水族箱（7,500 m3）中的eDNA进行了宏条形码分析，并以两种方案各自检测到的物种数作为代表性结果进行展示。本方案虽为鱼类eDNA的宏条形码分析而开发，但也适用于其他生物来源的eDNA。
引言
水环境中的环境DNA（eDNA）是指存在于水体中的遗传物质。近期研究表明，eDNA可用于检测来自多种水生环境的鱼类，包括池塘1-3、河流4-8、溪流9和海水10-14。这些研究大多集中于检测单一或少数几种入侵物种1,4-6,8,14以及稀有或濒危物种3,9，而一些近期研究则尝试对局部鱼类群落7,9,12,13,15和中型生态系统11,12中的多个物种进行同步检测。
后一种方法称为"代谢条形码技术"，环境DNA代谢条形码技术利用一个或多个PCR引物组，对分类学上多样化的样本中的特定基因区域进行共扩增。随后进行文库构建，包括加接头和加索引，然后利用高通量并行测序平台分析带索引的文库。最近，Miya et al.12 开发了用于鱼类环境DNA代谢条形码分析的通用PCR引物（称为"MiFish"）。MiFish引物靶向线粒体12S rRNA基因的一个高变区（163–185 bp），该区域包含足够的信息，可将鱼类鉴定至科、属乃至物种水平，仅少数近缘种例外。Miya et al.12 在环境DNA代谢条形码分析中使用这些引物，从已知物种组成的水族箱及附近珊瑚礁中检测出超过230种亚热带海洋鱼类。
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方案
注意：本方案不涉及水样采集和 metabarcoding 方法。水样的采集方式可根据研究目的有所不同16，有关使用 MiFish 引物进行 metabarcoding 方法的详细信息，请参见 Miya et al.12。需注意，采集的水样应始终保持低温，并在数小时内完成过滤，以避免环境 DNA（eDNA）降解。此外，本方案涉及使用旋转摇床和培养箱，后者必须足够大以容纳前者。同时，还需要配备一台可容纳 15 ml 和 50 ml 两种锥形管的离心机，分别用于去除过滤后滤芯中残留的液体，以及收集滤芯内提取的 DNA。
1. 处理螺旋盖和1 L塑料袋
注意：如果过滤体积小于或等于4升，则跳过此步骤。 >4 L
- 使用与雄性鲁尔锁接头伸出管相同直径（4.8 mm）的钻头，在一次性1 L塑料袋附带的螺旋盖中心钻一个孔。使用斜口钳将雄性鲁尔锁接头的管部截短至适当长度（ca. 3 mm）以避免过滤后少量水在盖内堵塞。
- 使用专用于聚乙烯（PE）和聚丙烯（PP）的黏合剂，分别涂抹于雄性鲁尔锁接头的底部和螺帽的表面。静置数分钟以确保良好黏合（请参考制造商说明书）。
- 将公型鲁尔锁接头插入螺帽的孔中。等待两部分完全粘合（通常 >24 小时）。使用 10% 商用漂白剂对带有公端鲁尔锁接头的螺....
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结果
从提取的混合环境DNA（eDNA）中单独分离并定量鱼类eDNA在技术上具有挑战性，因为MiFish引物在PCR扩增中会同时扩增某些非鱼类脊椎动物（如鸟类和哺乳类）的靶区域，产生相同大小的扩增产物。ca. 170 bp12我们并未对鱼类环境DNA进行定量，而是利用两种不同的过滤和DNA提取方法，对已知物种组成的水族箱水样中的环境DNA进行MiFish宏条形码分析，并比较两种建库方案各自检测到的物种数量。该简单实验旨在展示本方案的可行性，作为“代表性结果”，而非严格证明其相对于其他方法的优越性。
我们从日本冲绳县冲绳美丽海水族馆（26˚41'39"N, 127˚52'41"E）的黑潮水槽中采集了共计30 L的海水样品。该黑潮水槽用于展示大型海洋生物，尺寸（长×宽×深）为35 m × 27 m × 10 m，总水体体积为7,500 m3。水槽中饲养了约60种具有黑潮区域特征的大型海洋鱼类，黑潮是沿.......
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讨论
在许多使用水和土壤等环境样本的 metabarcoding 研究中，滤膜 cartridge 过滤后的处理通常如下24,25：1）使用手动工具（如管子切割器或钳子）切开或撬开外壳；2）将滤膜从 cartridge 中取出；3）用剃刀将滤膜切割成小片以进行 DNA 提取。为了避免这些繁琐且耗时、并在实验室中容易造成污染的操作步骤，我们尝试了多种使用广泛、价格低廉的商业化试剂盒在滤膜 cartridge 外壳内直接提取 DNA 的方法，并成功建立了本实验方案，eDNA metabarcoding 分析结果良好（图1）。
当前方案中较为关键的步骤之一是在预热的培养箱中使用旋转摇床，该步骤能够为后续环境DNA宏条形码分析中的文库制备提供良好的DNA得率。在适宜温度下，对滤膜 housing 内的蛋白酶K溶液进行持续振荡，可能有助于从滤膜截留的颗粒物中提取DNA。但需注意，本方案需要同时使用旋转摇床和培养箱，且后者必须能够容纳前者。此外，一台可容纳15 ml和50 ml锥形离心管的离心机对于分别去除滤后滤膜中的残留液体以及在纯化柱中收集.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由日本科学技术振兴机构（JST）的CREST项目以及日本学术振兴会/文部科学省科研费（KAKENHI编号26291083）和佳能基金会向M.M.提供的资助支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 网状面板 | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| 金属齿 | Iris Ohyama | MR12F | |
| 网格板支架 | 无品牌 | 4184-9507 | 可从亚马逊日本购买 |
| 1 L 塑料袋，带螺旋盖 | 矢萩 | DP16-TN1000 | |
| 雄性鲁尔锁接头 | ISIS | 11620 | |
| 10 ml 移液器吸头 | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 带阀门的10 L书形瓶 | 作为一体 | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV 滤器 | Millipore | SVHVL10RC | 表示为 "滤芯" 贯穿全文并在实验方案中使用 |
| 雄性鲁尔接头 | 作为一体 | 1-7379-04 | |
| 雌性鲁尔接头 | 一如其名 | 5-1043-14 | |
| 入口鲁尔帽 | ISIS | VRMP6 | |
| 出口鲁尔帽 | ISIS | VRFP6 | |
| 高真空管路 | 作为一体 | 6-590-01 | |
| 真空连接器 | 作为一体 | 6-663-02 | |
| 硅胶塞 | 作为一体 | 1-7650-07 | |
| 多流道装置 | 作为一体 | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | 作为一体 | 1-7483-21 | |
| DNeasy 血液 & 组织试剂盒 (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA 分离试剂盒 | MO BIO | 14600-50-NF | 表示为 "可选试剂盒" 在质谱中 |
| 台式离心机 | 久保田 | Model 4000 | 最高转速 6,000 rpm |
| 固定角转子 | 久保田 | AT-508C | |
| 15 ml 锥形管适配器 | 久保田 | 055-1280 | |
| RNAlater 稳定溶液 | 赛默飞世尔科技 | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | 表示为 "自密封膜" |
参考文献
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584(2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE....
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重印与许可
