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使用滤芯过滤水样并提取环境DNA

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DOI：

10.3791/54741

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2016年11月25日

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1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

本文内容

摘要

我们介绍一种使用滤膜筒过滤水样并提取环境DNA（eDNA）的方案，该方法无需切开滤膜筒外壳即可取出滤膜。本方案最初针对鱼类的eDNA宏条形码分析而开发，但也适用于其他生物的eDNA研究。

摘要

近期研究表明，鱼类的环境DNA（eDNA）可作为非侵入性监测工具，具有适用性。尽管多数此类研究采用圆盘状纤维滤膜从水样中收集eDNA，但许多水生环境中微生物相关研究已使用滤筒式滤器，因为滤筒在处理大体积水样以及整体操作便捷性方面具有优势。本文提供一种使用滤筒过滤水样并直接从滤膜中提取eDNA的实验方案，无需切开滤器外壳。本方案主要包括三个部分：（1）水样的过滤（水样体积 ≤4 L 或 >4 L）；（2）将滤膜置于预热的培养箱中，利用滚轴摇床进行DNA提取；（3）使用商业化试剂盒对DNA进行纯化。结合本方案与先前已使用的方案，我们对一个已知物种组成的大规模水族箱（7,500 m3）中的eDNA进行了宏条形码分析，并以两种方案各自检测到的物种数作为代表性结果进行展示。本方案虽为鱼类eDNA的宏条形码分析而开发，但也适用于其他生物来源的eDNA。

引言

水环境中的环境DNA（eDNA）是指存在于水体中的遗传物质。近期研究表明，eDNA可用于检测来自多种水生环境的鱼类，包括池塘1-3、河流4-8、溪流9和海水10-14。这些研究大多集中于检测单一或少数几种入侵物种1,4-6,8,14以及稀有或濒危物种3,9，而一些近期研究则尝试对局部鱼类群落7,9,12,13,15和中型生态系统11,12中的多个物种进行同步检测。

后一种方法称为"代谢条形码技术"，环境DNA代谢条形码技术利用一个或多个PCR引物组，对分类学上多样化的样本中的特定基因区域进行共扩增。随后进行文库构建，包括加接头和加索引，然后利用高通量并行测序平台分析带索引的文库。最近，Miya et al.12 开发了用于鱼类环境DNA代谢条形码分析的通用PCR引物（称为"MiFish"）。MiFish引物靶向线粒体12S rRNA基因的一个高变区（163–185 bp），该区域包含足够的信息，可将鱼类鉴定至科、属乃至物种水平，仅少数近缘种例外。Miya et al.12 在环境DNA代谢条形码分析中使用这些引物，从已知物种组成的水族箱及附近珊瑚礁中检测出超过230种亚热带海洋鱼类。

在优化环境DNA宏条形码检测流程以适应含有不同鱼类eDNA浓度的天然海水样本时，我们发现MiFish引物有时无法扩增出目标片段，从而影响后续文库的构建。造成PCR扩增失败的一个较可能原因是过滤的水样体积较小（即 1–2 L），导致模板DNA量不足。尽管在扩增前无法预知特定分类群的eDNA浓度，但过滤较大体积的水样（>1–2 L）将是一种简单而有效的方法，可用于从鱼类丰度和生物量较低的水生环境中（如开阔大洋和深海生态系统）富集更多的eDNA。

与传统上在多种鱼类环境DNA（eDNA）研究中使用的圆盘式纤维滤膜相比16，滤芯具有在堵塞前可处理更大水样体积的优势17。事实上，最近一项研究已证明使用滤芯对近岸海水样品进行大体积（>20 L）过滤的可行性18。此外，滤芯为独立包装且无菌，实验流程中的多个步骤可在滤芯外壳内完成，从而降低实验室污染的风险19。这一特性对于eDNA宏条形码分析尤为重要，因为在该类实验中，污染风险仍是主要的技术挑战之一20,21。尽管滤芯具有上述技术优势，但在鱼类eDNA研究中，目前仅有两项研究例外地使用了该技术8,15。

本文提供了一种使用滤膜 cartridge 对水样进行过滤，并在不打开外壳的情况下从滤膜中提取环境DNA（eDNA）的实验方案。我们还根据水样体积（≤4 L 或 >4 L）提供了两种可选的水样过滤系统。为了比较本研究组新开发的方案与先前使用的玻璃纤维滤膜方案12,14,22,23的性能，我们对一个已知物种组成的大型水族箱（7,500 m3）中的海水进行了eDNA宏条形码分析，并展示了两种方案检测到的物种数量作为代表性结果。该方案最初是为鱼类eDNA的宏条形码分析而开发的，但也适用于其他生物的eDNA分析。

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方案

注意：本方案不涉及水样采集和 metabarcoding 方法。水样的采集方式可根据研究目的有所不同16，有关使用 MiFish 引物进行 metabarcoding 方法的详细信息，请参见 Miya et al.12。需注意，采集的水样应始终保持低温，并在数小时内完成过滤，以避免环境 DNA（eDNA）降解。此外，本方案涉及使用旋转摇床和培养箱，后者必须足够大以容纳前者。同时，还需要配备一台可容纳 15 ml 和 50 ml 两种锥形管的离心机，分别用于去除过滤后滤芯中残留的液体，以及收集滤芯内提取的 DNA。

1. 处理螺旋盖和1 L塑料袋

注意：如果过滤体积小于或等于4升，则跳过此步骤。 >4 L

  1. 使用与雄性鲁尔锁接头伸出管相同直径（4.8 mm）的钻头，在一次性1 L塑料袋附带的螺旋盖中心钻一个孔。使用斜口钳将雄性鲁尔锁接头的管部截短至适当长度（ca. 3 mm）以避免过滤后少量水在盖内堵塞。
  2. 使用专用于聚乙烯（PE）和聚丙烯（PP）的黏合剂，分别涂抹于雄性鲁尔锁接头的底部和螺帽的表面。静置数分钟以确保良好黏合（请参考制造商说明书）。
  3. 将公型鲁尔锁接头插入螺帽的孔中。等待两部分完全粘合（通常 >24 小时）。使用 10% 商用漂白剂对带有公端鲁尔锁接头的螺旋盖进行灭菌（ca使用前用 0.6% 次氯酸钠处理。
  4. 在1 L塑料袋底部的两个角上各打一个孔，以便将其悬挂在网格板上（步骤3）。确保孔的直径大于网格板上的插钉直径。

2. 过滤系统的组装

  1. 将高真空管路连接至抽吸泵的输入接口，并将管路的另一端连接至多通道分流装置。确保该多通道分流装置上的三个红色T型阀处于 "关闭位置" (即，水平放置。
  2. 佩戴一副干净的手套，将雌性鲁尔接头和真空连接器分别插入真空橡胶管的顶部和底部两端用于过滤。
  3. 小心地将雌性鲁尔接头连接到滤筒的出口端口，并将真空连接器连接到硅胶塞上。

3. 使用滤芯过滤水样（≤4 L）

注意：如果过滤体积小于或等于4 L，则跳过此步骤。 >4 L。该过滤系统需要一个独立的面板，用于悬挂装有1 L水的塑料袋。从网上商店可获取的网状面板、多齿支架及面板支架，均有助于组装此装置。使用前，需对滤筒的进水口和出水口鲁尔帽进行高压灭菌。

  1. 将1 L采集的水样倒入塑料袋中，并用带有鲁尔锁接头的公接头拧紧盖子。
  2. 小心地将组装好的滤筒进样口与塑料袋的鲁尔锁公接头连接。请勿过度拧紧鲁尔锁接头，否则在开始抽滤时装置会发生泄漏。在将塑料袋悬挂在网状面板上之前，务必确认所有连接处均已牢固。
  3. 小心地将装有滤筒的塑料袋挂在网状面板的两个挂钩上，并将硅胶塞插入多通阀的进样口。
  4. 打开真空抽滤装置，打开红色T型阀以开始过滤。持续运行多通阀系统直至滤筒完全干燥，然后将红色T型阀转至关闭位置。
  5. 重复步骤3.1–3.4，直至完成所需体积的水样过滤。
    注：对于取自亚热带珊瑚礁的1 L水样，过滤过程约需三分钟。
  6. 小心地将滤筒从塑料袋和真空连接装置上拆下。
  7. 使用进样口和出样口的鲁尔帽封闭滤筒两端。
  8. 使用快干、防晕染的耐溶剂记号笔，在滤筒及进样口鲁尔帽上做好适当标记。
  9. 在进行DNA提取前，将滤筒置于-20 ˚C保存。

4. 使用滤芯过滤水样（>4 L）

注意：如果水样过滤体积 ≤4 L，则跳过此步骤。该过滤系统需要配备阀门的 10 L 搁置瓶和一次性 10 ml 移液器吸头。10 ml 移液器吸头的内径（15.0 mm）和尖端锥度应分别与阀门的外径（15.0 mm）和滤筒的进样口匹配。两个连接处通过摩擦配合在过滤过程中保持牢固。使用前用 10% 商用漂白剂（ca. 0.6% 次氯酸钠）对移液器吸头进行灭菌。

  1. 在采水瓶中准备适量的水样。将10 ml移液器吸头紧密插入10 L采水瓶的阀门中。
  2. 将滤筒的出口端紧密插入移液器吸头末端，并将硅胶塞插入多通道过滤装置的入口端。打开真空泵，打开红色T型阀开始过滤。运行多通道过滤装置直至滤筒完全干燥，然后将红色T型阀转至关闭位置。
    注意：对于从亚热带外珊瑚礁采集的10 L海水，过滤过程大约需要30–40分钟。
  3. 小心地从塑料袋和真空连接器上取下滤筒。使用进样端和出样端的鲁尔帽封闭滤筒两端。使用快干、防晕染的耐溶剂记号笔，在滤筒及进样端鲁尔帽上做好相应标记。在进行DNA提取前，将滤筒保存于-20 °C环境中。

5. 从滤膜中提取环境DNA

注意：在步骤 4 和 5 中，我们使用一种商用试剂盒，基本遵循试剂盒提供的“有核血液”操作方案。为简化说明，我们描述的是处理单个滤芯的流程。实际操作中，建议每次处理 8 个（或离心机最大容量）或更少数量的滤膜。

  1. 将孵育箱预热至 56 ℃ °C.
  2. 通过从2.0 ml离心管上剪下铰链盖来准备一个2.0 ml离心管。丢弃管盖。
    注意：此试管用于收集滤器中残留的液体。
  3. 从滤筒上取下入口（非出口）鲁尔帽，并将入口端口插入收集管中。使用自封膜紧密封严滤筒与收集管之间的连接处。
  4. 将组合单元插入用于15 ml锥形管的离心机适配器中。以5,000 x g离心1分钟，以去除滤膜中残留的液体。
  5. 从滤筒中取出收集管并丢弃该管。重新盖上滤筒的进样口。
  6. 准备 20 的混合物 µl 蛋白酶-K 溶液，220 µl PBS（磷酸盐缓冲液；试剂盒未提供）和 200 µl 缓冲液 AL
    注意：滤 cartridge 可容纳混合物体积的四倍量ca1.8 ml
  7. 取下入口盖，加入混合液（440 µl）使用移液器吸头将液体加入滤筒中。将移液器完全插入进样口，使吸头末端在膜上方的滤筒内部可见。
  8. 重新盖上进样口，将滤筒置于旋转摇床上。
  9. 将旋转摇床置于预热的培养箱中，温度为 56 ℃ ˚C，并以20 rpm的速度开启摇床，持续20分钟。
  10. 孵育期间，准备一个新的2.0 ml离心管，使用耐溶剂笔在管上做好标记，并将其放入50 ml锥形离心管中。
    注意：前者（2.0 ml）试管用于收集提取的DNA，后者（50 ml）试管用于放置2.0 ml试管。
  11. 孵育结束后，取下进样端盖帽，将滤 cartridge 的进样端口（非出样端口）插入 50 ml 离心管内的 2.0 ml 离心管中，用螺旋盖封闭 50 ml 离心管。
  12. 将50 ml锥形管在5,000 × g离心1分钟，以收集从滤 cartridge 中提取的DNA。使用无菌镊子取出滤 cartridge 和2.0 ml离心管，并盖上管盖。弃去滤 cartridge。

6. 提取DNA的纯化

注意：我们使用 100 µl 缓冲液 AE 洗脱 eDNA，而不是商业试剂盒说明书中指定的 200 µl。

  1. 加入200 µ将l乙醇（96-100%）加入上一步骤中2.0 ml离心管内的提取DNA中约 440 µl），并通过涡旋振荡充分混匀。
  2. 将混合物移入置于2 ml收集管中的离心柱中。在5,000 x g离心1分钟。弃去穿流液和收集管。
  3. 将离心柱放入新的 2 ml 收集管中，加入 500 µ加入缓冲液AW1，于5,000 x g离心1分钟。弃去穿滤液和收集管。
  4. 将离心柱放入新的 2 ml 收集管中，加入 500–µ加入缓冲液AW2，于20,000 x g离心3分钟。弃去流出液和收集管。
  5. 准备一个新的1.5 ml离心管（试剂盒未提供），使用速干且不晕染的防水笔在管壁上做好标记。将离心柱转移至该1.5 ml离心管中。
  6. 通过加入 100 μL 洗脱缓冲液洗脱 DNA µ将缓冲液AE加入离心柱膜的中央。室温孵育1分钟，然后在6,000 x g离心1分钟。
  7. 弃去离心柱，盖紧管盖。将纯化的 DNA 储存在 -20 ℃ °C.

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结果

从提取的混合环境DNA（eDNA）中仅分离和定量鱼类eDNA在技术上具有挑战性，因为MiFish引物在PCR扩增中会同时扩增某些非鱼类脊椎动物（如鸟类和哺乳动物）的目标区域，产生相同大小的扩增产物（ca. 170 bp12. 本研究未对鱼类环境DNA进行定量，而是利用两种不同的过滤与DNA提取方法，对已知物种组成的水族箱水样中的环境DNA开展MiFish宏条形码分析，并比较两种建库方案各自检测到的物种数量。该简单实验旨在验证本方案的可行性 "代表性结果" 而非严格证明其优于其他方法。

我们从日本冲绳县冲绳美丽海水族馆（26˚41'39"N, 127˚52'41"E）的黑潮水族箱中采集了共计30 L的海水样品。该黑潮水族箱用于展示大型海洋动物，尺寸（长×宽×深）为35 m × 27 m × 10 m，总水体体积为7,500 m3。水族箱中饲养着约60种典型的大型...

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讨论

在许多使用水和土壤等环境样本的 metabarcoding 研究中，滤膜 cartridge 过滤后的处理通常如下24,25：1）使用手动工具（如管子切割器或钳子）切开或撬开外壳；2）将滤膜从 cartridge 中取出；3）用剃刀将滤膜切割成小片以进行 DNA 提取。为了避免这些繁琐且耗时、并在实验室中容易造成污染的操作步骤，我们尝试了多种使用广泛、价格低廉的商业化试剂盒在滤膜 cartridge 外壳内直接提取 DNA 的方法，并成功建立了本实验方案，eDNA metabarcoding 分析结果良好（图1）。

当前方案中较为关键的步骤之一是在预热的培养箱中使用旋转摇床，该步骤能够为后续环境DNA宏条形码分析中的文库制备提供良好的DNA得率。在适宜温度下，对滤膜 housing 内的蛋白酶K溶液进行持续振荡，可能有助于从滤膜截留的颗粒物中提取DNA。但需注意，本方案需要同时使用旋转摇床和培养箱，且后者必须能够容纳前者。此外，一台可容纳15 ml和50 ml锥形离心管的离心机对于分别去除滤后滤膜中的残留液体以及在纯化柱中收集...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由日本科学技术振兴机构（JST）的CREST项目以及日本学术振兴会/文部科学省科研费（KAKENHI编号26291083）和佳能基金会向M.M.提供的资助支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
网状面板Iris OhyamaMPP-3060-BE
金属齿Iris OhyamaMR12F
网格板支架无品牌4184-9507可从亚马逊日本购买
1 L 塑料袋，带螺旋盖矢萩DP16-TN1000
雄性鲁尔锁接头ISIS11620
10 ml 移液器吸头Eppendorf0030 000.765
带阀门的10 L书形瓶作为一体1-2169-01
Sterivex-HV 滤器MilliporeSVHVL10RC表示为 "滤芯" 贯穿全文并在实验方案中使用
雄性鲁尔接头作为一体1-7379-04
雌性鲁尔接头一如其名5-1043-14  
入口鲁尔帽ISISVRMP6
出口鲁尔帽ISISVRFP6
高真空管路作为一体6-590-01
真空连接器作为一体6-663-02
硅胶塞作为一体1-7650-07
多流道装置作为一体2-258-01
Aspirator-GAS-1作为一体1-7483-21
DNeasy 血液 & 组织试剂盒 (250)Qiagen69506
PowerWater Sterivex DNA 分离试剂盒MO BIO14600-50-NF表示为 "可选试剂盒" 在质谱中
台式离心机久保田Model 4000最高转速 6,000 rpm
固定角转子久保田AT-508C
15 ml 锥形管适配器久保田055-1280
RNAlater 稳定溶液赛默飞世尔科技AM7020
ParafilmPM992表示为 "自密封膜"

参考文献

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