动态核极化结合后续样品溶解技术已实现对生物系统中代谢过程的实时研究。超极化[1-13C]丙酮酸用于研究前列腺癌细胞系中的乳酸脱氢酶活性 体外.
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摘要
摘要
在过去的几十年中，随着先进的正电子发射断层扫描技术的发展，多种癌症的肿瘤分期、再分期、治疗反应监测及复发检测的新方法相继出现 18F-氟脱氧葡萄糖（[18F]-FDG PET 13C磁共振波谱成像（13CMRSI 是一种微创成像方法，可实现对代谢的监测 体内 并且是实时的。与任何其他基于 13碳核磁共振（NMR）由于碳原子相对较低的旋磁比，面临热极化程度低以及随之而来的信噪比低的挑战。 13C及其在生物样本中较低的天然丰度。通过克服这些限制，近年来动态核极化（DNP）结合后续样品溶解技术，使得常规使用的核磁共振（NMR）和磁共振成像（MRI）系统能够测量、研究和成像多种生物系统中的关键代谢途径。一种特别有趣且具有前景的分子被用于 13CMRSI 是 [1-13C]丙酮酸，在过去十年中已被广泛用于 体外，临床前以及最近的临床研究，用于探究癌症及其他疾病的细胞能量代谢。本文中，我们概述了使用3.35 T临床前DNP超极化仪进行溶解态DNP的技术，并展示了其应用方法 体外 研究. 超极化的一种类似方案在很大程度上可被应用 体内 研究中也采用了乳酸脱氢酶（LDH），并催化了[1-13C]丙酮酸钠到[1-13C]乳酸在前列腺癌细胞系PC3中的研究 体外 使用 13CMRSI
引言
目前，临床上最广泛用于多种癌症的肿瘤分期、再分期、治疗反应监测及复发检测的方法是[18F]-FDG PET1 然而，近年来出现了几种新颖且替代性的方法。其中一种方法是 13CMRSI。该技术涉及引入 13将C分子引入生物样本，随后通过微创MRI评估其代谢情况 体外 或 体内 实时。然而，最大的挑战在于 13CMRSI 与其他方法（如[18其信噪比较低。
核磁共振信号与极化程度成正比，极化程度是指两种能态下自旋½核的布居数之差与总布居数的比值图1A）。极化程度是核的旋磁比（γ）、外加磁场强度与温度之比的乘积。典型的极化度为 1H核在3 T条件下的浓度约为0.001%至0.005%，导致信噪比较低。当今先进的MRI技术之所以成为成功的成像方法，仅得益于H核的高丰度 1H 在生物样本中的含量及其高旋磁比 1H (γ1H = 42.576 MHz/T）。然而，观测其他原子核（如碳）则更具挑战性。唯一稳定的、具有磁活性的碳同位素是 13C，仅占所有碳原子的1.1%。此外，其陀磁比 13C (γ13C = 10.705 MHz/T）是前者....
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方案
1. 样品储备液的制备
- 向浓缩的[1-13C]丙酮酸中加入钆特酸葡胺（GadM，0.5 mol/L），使GadM的终浓度为1 mmol/L。向该混合物中加入三苯甲基自由基三（8-羧基-2,2,6,6-四（羟乙基）-苯并[1,2-4,5]双（1,3）二硫杂环-4-基）甲基钠盐（OX063），使其终浓度为15 mmol/L。涡旋振荡至完全溶解。
注意：该储备液的配制适用于3.35 T的临床前DNP超极化仪。当使用7 T的临床超极化仪时，无需添加钆特酸葡胺，因为在较高磁场下其作用可忽略不计。添加基于钆的对比剂可提高固态下的极化度及极化速率；然而，在液态下，该对比剂会缩短T1弛豫时间。
2. 培养细胞
- 在具有125 cm2生长面积的培养瓶中培养PC3细胞。使用含10%胎牛血清（FCS）的F-12K培养基，在37 °C、5% CO2的湿化气氛中维持细胞生长。在溶解步骤前，从培养瓶中移除培养基。
注意：每种细胞系均需要特定的传代培养方案。请咨询细胞系供应商以获取相关要求。
3. 实验用细胞的制备
- 移除细胞培养基，并用约 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
- 向培养瓶中加入5 mL胰蛋白酶，将细胞培养瓶....
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结果
“微波扫描”结果如图3所示。结果显示，对于该[1-13C]丙酮酸样品，在本地3.35 T的超极化装置中，最佳微波频率为94.156 GHz。所有后续的超极化实验（n = 14）均采用该微波频率，并以100 mW的功率进行。微波照射持续60至80分钟，获得的固态超极化度高于90%。结果如图4所示。将超极化的[13C]丙酮酸与5 × 106 (n = 2)、107 (n = 2)、2 × 107 (n = 1)、3 × 107 (n = 2)、4 × 107 (n = 1)、6 × 107 (n = 2)、8 × 107 (n = 2)以及108 (n = 1)个前列腺癌细胞系PC3混合。
结果数据总结于图5和图6中。具有光谱和时间分辨.......
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讨论
13使用超极化探针的CMRSI是一种有望实时监测代谢的前沿方法 体外 和 体内采用该实验流程时，一个非常重要的方面是适当的标准化，尤其是在以下方面 体外 实验。首先，样品的制备必须正确且一致，以确保每次实验中获得相同浓度的超极化材料。这需要精确称量待超极化样品和缓冲液。如果浓度不准确，溶液的最终pH值将不精确，这可能会影响T1 以及细胞的反应。尽可能均匀地处理细胞也至关重要。细胞的制备应始终确保从收获细胞到后续实验之间的延迟时间最短，以尽量减少细胞处于高浓度、低体积状态的时间。细胞制备流程中的任何变化，例如不同的制备时间或温度，都可能导致实验数据出现显著差异。样本与细胞的混合过程也应标准化。必须记录示踪剂加入细胞悬液至测量开始之间的时间间隔，因为该时间可能有所变化；在数据分析过程中应考虑这一因素。
正确选择数据分析方法和动力学建模对于解释所获得的数据至关重要。简单模型适用于具有恒定交换速率的两个代谢物之间的单向线性反应。如引言中所述，丙酮酸会经历多个酶促反应，更重要的是，它还会与丙酮酸.......
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披露
Rolf F. Schulte 和 Marion I. Menzel 任职于 GE 全球研究公司。
致谢
E.K. 感谢慕尼黑工业大学生物工程研究生院（GSB）提供的支持。本工作得到了德国研究基金会（DFG）在合作研究中心 SFB 824 项目“癌症治疗的成像选择、监测与个体化”中的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HyperSense DNP 极化仪 | Oxford Instruments | 3.35 T 临床前 DNP 超极化仪 | |
| GE/Agilent MR901 | GE Healthcare/Agilent Technologies | 7 T 临床前 MRI 扫描仪，配备专为啮齿类动物实验设计的小孔径系统 | |
| Spinsolve Carbon | Magritek | 采用永磁体的 1 T NMR 波谱仪 | |
| 氧化氘 | Sigma Aldrich | 7789-20-0 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma Aldrich | 7558-80-7 | |
| 氢氧化钠 | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| 乙二胺四乙酸二钠 | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | |
| 丙酮酸 - 13C1 | Cambridge Isotopes Laboratories | CLM-8077-1 | |
| Dotarem (0.5 mmol/L) | Guerbet | 钆特酸葡胺 | |
| 三(8-羧基-2,2,6,6-四(羟乙基)-苯并[1,2–4,5]-双(1,3)-二硫杂环戊烯-4-基)甲基钠盐 (OX063) | GE Healthcare | 用作自由电子源的三苯甲基自由基 | |
| PC3 细胞系 | ATCC | CRL1435 | |
| F-12K 培养基 | ATCC | 30-2004 | |
| 胎牛血清 | ATCC | SCRR-30-2020 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液，1x | ATCC | 30-2101 | |
| 样品塑料杯 | Oxford Instruments | ||
| 台盼蓝 | Bio-Rad | 145-0013-MSDS |
参考文献
- Rohren, E. M., Turkington, T. G., Coleman, R. E. Clinical applications of PET in oncology. Radiology. 231 (2), 305-332 (2004).
- Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
- Carver, T. R., Slichter, C. P.
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重印与许可
