利用荧光相关光谱法测定原代淋巴细胞质膜中的分子扩散

摘要

本文介绍了一种利用荧光相关光谱法（FCS）测量原代免疫细胞膜中蛋白质扩散的方法。文中以抗体进行荧光标记的应用为例进行了说明。

摘要

荧光相关光谱法（FCS）是一种强大的技术，可用于高空间和时间分辨率下研究生物膜内分子的扩散行为。FCS能够定量测定细胞膜中荧光标记分子的分子浓度和扩散系数。该技术可用于探究免疫细胞质膜中分子在稳态条件下的分子扩散特性即， 无需担心在实际测量期间发生影响结果的干扰过程）。FCS适用于研究表达水平接近大多数内源性蛋白质的蛋白质扩散行为。本文展示了一种直接且稳健的方法，用于测定原代淋巴细胞细胞膜蛋白的扩散速率。文中描述了对经抗体标记的活细胞进行测量的有效方法，以及数据采集后常见的观察结果。近年来光稳定性荧光染料的发展成果可被充分利用，即将目标抗体与合适的荧光染料偶联，以确保测量过程中染料不易发生明显漂白。此外，该方法还可用于检测扩散较慢的分子实体，这在细胞膜表达的蛋白质中较为常见。本文重点介绍了从获得的自相关曲线中提取分子浓度和扩散参数的分析流程。总之，本文提供了一个FCS测量的基本实验方案，可供具备共聚焦显微镜知识但无分子扩散速率等动态参数测量技术经验的免疫学研究人员参考和实施。

引言

许多免疫细胞的功能依赖于膜内分子的扩散及其相互作用。生物膜结构复杂，多种可能对免疫细胞功能具有重要意义的因素均会影响细胞膜内蛋白质平移扩散的速度¹。我们近期研究表明，属于先天免疫系统的淋巴细胞——自然杀伤（NK）细胞，在细胞膜上两种被研究蛋白质的扩散行为会因NK细胞激活状态的不同而有所差异²。

荧光相关光谱法（FCS）是一种能够定量测定生物膜中分子扩散速率的技术。该技术可报告在固定体积内（通常为共聚焦显微镜的焦点）荧光标记分子的平均扩散速率，其原理基于检测处于稳态系统中分子运动所引起的荧光信号波动。FCS 已被广泛用于研究荧光染料和蛋白质在溶液及脂质膜中的扩散行为。此外，其他影响扩散速率的参数也可通过此方法间接进行研究。例如， 蛋白质的构象变化或细胞膜上分子间的相互作用^3,4与其他技术相比，FCS 具有高灵敏度，能够实现单分子检测。该技术适用于纳摩尔至毫摩尔浓度范围内的分子检测，这一浓度范围恰好对应大多数蛋白质内源性表达水平的典型范围。⁵此外，FCS 可以估算研究体积内蛋白质的绝对数量，而大多数其他技术仅能提供有关蛋白质表达水平的相对信息。测量膜内分子扩散速率的其他方法包括光漂白后荧光恢复（FRAP）....

方案

1. FCS 染色

1. 采用磁珠标记法，按照制造商说明书从脾脏淋巴细胞中分离小鼠NK细胞¹⁶. 使用 2-3 x 10⁵ 每个样品的细胞数用于后续步骤。
   注意：使用阴性筛选富集目标细胞群体，使目标细胞保持未受干扰状态，从而可仅使用一抗对细胞进行标记。参见参考文献² 有关从小鼠中分离细胞的更详细信息².
2. 对于表达 Fc 受体的小鼠细胞，使用抗体克隆 2.4G2 封闭 Fc 受体 5 µg/µl 在 25 μl 每份样品加入磷酸盐缓冲液（PBS）和1%胎牛血清（FBS）。室温孵育15分钟。
3. 抗体混合物的制备
   1. 使用直接偶联光稳定荧光染料的抗体。若同时使用两种针对不同蛋白的抗体，应选择发射光谱分离良好的荧光染料，以最大限度减少串色干扰例如， 由488和633激光器激发²，后续方案中分别称为“绿色”和“红色”激光及荧光染料。
      注意：如果所选生物标志物没有 commercially available（商品化）且标记有光稳定荧光染料的抗体，可根据制造商说明书将未标记抗体与荧光染料进行偶联。参见 材料表 本研究中所用抗体。
   2. ....

结果

典型结果将生成一条自相关曲线，膜蛋白的停留时间范围为10毫秒至400毫秒。每个检测区域内的分子数量可介于0.5到约200之间 μm² 对于内源性表达的蛋白质，需仔细检查每分钟计数（CPM）是否不低于预期值。CPM过低可能提示背景信号存在干扰。经验上，在相同激光功率下，用于分析的细胞表面信号的CPM值不应低于游离扩散抗体CPM值的33%。CPM应随激光功率呈线性变化。原代免疫细胞表面受体的自相关曲线应平滑，其最陡部分通常出现在0.001至1秒之间。参见 图2 用于代表性的自相关曲线及其时间轨迹。

如引言中简要提及，由于其他来源的荧光波动会影响信号，导致结果混淆，在某些情况下，荧光相关光谱（FCS）不适用于测量分子扩散。图3展示了应舍弃特定细胞或测量重复的几种示例情况。前文已提到，信号极低（CPM值非常低）是舍弃该细胞的原因之一。另一个舍弃单个细胞的原因是细胞发生移动.......

讨论

该FCS方案可用于评估各类免疫细胞（小鼠、人或其他物种）表面分子的分子动力学。FCS能够在活细胞中以单分子分辨率测量分子的空间-时间动力学。通过自相关曲线，可提取目标蛋白的分子密度、扩散速率以及聚集动力学等参数。

荧光标记对于成功的荧光相关光谱（FCS）实验至关重要。传统上，细胞膜上目标蛋白的标记采用抗体，而对于未经处理的免疫细胞表面蛋白，抗体通常是最为便捷的选择。未标记的抗体必须直接与光稳定性好、分子亮度高的荧光染料进行偶联。选择用于抗体偶联的荧光染料对测量质量具有重要影响。由于易发生快速漂白，不推荐使用流式细胞术中常用的标记物，如荧光素和藻红蛋白类染料。目前多家公司可提供适用于直接偶联抗体的光稳定染料。制造商通常会提供较为完善的偶联及纯化操作方案，整个过程可在数小时内完成。也可使用荧光蛋白进行FCS实验，但需特别注意尽量降低激光功率，因为荧光蛋白通常比最稳定的化学荧光染料更容易发生漂白。根据以往经验，蛋白的过表达常因空间拥挤效应导致扩散速率显著下降，因此不适合使用荧光蛋白标记。

在测量前进行针孔校准也是一个关键步骤。用于确.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MACS NK细胞分离试剂盒 小鼠II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	NK细胞的阴性筛选
胎牛血清	Sigma-Adlrich	F7524	热灭活
磷酸盐缓冲液	-	-	实验室自制
Roswell Park Memorial Institute 1640培养基	PAA The Cell Culture Company	E15-848	透明培养基
抗体克隆2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	用于阻断Fc受体
抗Ly49A抗体			实验室自制单克隆抗体，并在实验室中与Alexa fluor 647偶联
克隆JR9.318
抗H-2Dd抗体	BD Pharmingen	558915	在实验室中与MFP488偶联
克隆34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	用于抗体偶联的荧光染料
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P8920	用蒸馏水稀释（1.10）
聚乙二醇（2 kDa）接枝的聚-L-赖氨酸（20 kDa）	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	用PBS（pH 7.4）稀释至0.5 mg/ml
罗丹明110氯化物	Sigma-Aldrich	432202	已知扩散系数：3.3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	已知扩散系数：4.4 × 10−10 m2/sec 20
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM510
软件：Confocor 3	Zeiss
软件：Matlab（含曲线拟合工具箱）	Matlab	版本 R2013b
Nunc Lab-Tek 细胞培养腔室盖玻片	Thermo-scientific	155411	8孔，1.0硼硅酸盐底面