利用荧光相关光谱法测定原代淋巴细胞质膜中的分子扩散

摘要

本文介绍了一种利用荧光相关光谱法（FCS）测量原代免疫细胞膜中蛋白质扩散的方法。文中以抗体进行荧光标记的应用为例进行了说明。

摘要

荧光相关光谱法（FCS）是一种强大的技术，可用于高空间和时间分辨率下研究生物膜内分子的扩散行为。FCS能够定量测定细胞膜中荧光标记分子的分子浓度和扩散系数。该技术可用于探究免疫细胞质膜中分子在稳态条件下的分子扩散特性即， 无需担心在实际测量期间发生影响结果的干扰过程）。FCS适用于研究表达水平接近大多数内源性蛋白质的蛋白质扩散行为。本文展示了一种直接且稳健的方法，用于测定原代淋巴细胞细胞膜蛋白的扩散速率。文中描述了对经抗体标记的活细胞进行测量的有效方法，以及数据采集后常见的观察结果。近年来光稳定性荧光染料的发展成果可被充分利用，即将目标抗体与合适的荧光染料偶联，以确保测量过程中染料不易发生明显漂白。此外，该方法还可用于检测扩散较慢的分子实体，这在细胞膜表达的蛋白质中较为常见。本文重点介绍了从获得的自相关曲线中提取分子浓度和扩散参数的分析流程。总之，本文提供了一个FCS测量的基本实验方案，可供具备共聚焦显微镜知识但无分子扩散速率等动态参数测量技术经验的免疫学研究人员参考和实施。

引言

许多免疫细胞的功能依赖于膜内分子的扩散及其相互作用。生物膜结构复杂，多种可能对免疫细胞功能具有重要意义的因素均会影响细胞膜内蛋白质平移扩散的速度¹。我们近期研究表明，属于先天免疫系统的淋巴细胞——自然杀伤（NK）细胞，在细胞膜上两种被研究蛋白质的扩散行为会因NK细胞激活状态的不同而有所差异²。

荧光相关光谱法（FCS）是一种能够定量测定生物膜中分子扩散速率的技术。该技术可报告在固定体积内（通常为共聚焦显微镜的焦点）荧光标记分子的平均扩散速率，其原理基于检测处于稳态系统中分子运动所引起的荧光信号波动。FCS 已被广泛用于研究荧光染料和蛋白质在溶液及脂质膜中的扩散行为。此外，其他影响扩散速率的参数也可通过此方法间接进行研究。例如， 蛋白质的构象变化或细胞膜上分子间的相互作用^3,4与其他技术相比，FCS 具有高灵敏度，能够实现单分子检测。该技术适用于纳摩尔至毫摩尔浓度范围内的分子检测，这一浓度范围恰好对应大多数蛋白质内源性表达水平的典型范围。⁵此外，FCS 可以估算研究体积内蛋白质的绝对数量，而大多数其他技术仅能提供有关蛋白质表达水平的相对信息。测量膜内分子扩散速率的其他方法包括光漂白后荧光恢复（FRAP）、单粒子追踪（SPT）、多针孔 FCS 和图像相关方法。FRAP 和图像相关方法属于集合测量技术，通常无法提供有关分子绝对数量的信息。¹⁰与单粒子追踪（SPT）相比，荧光相关光谱（FCS）在表征群体平均特性方面具有更高的通量。其分析要求也较低，因为测量的是激光焦点区域内分子的平均扩散速率，而非单个分子的扩散速率。此外，除非具备专用显微镜¹¹SPT 无法提供关于浓度的信息，因为标准的 SPT 标记必须非常稀疏，以便识别单个分子。另一方面，FCS 要求被研究的分子具有移动性，因此它完全无法检测任何可能存在的不移动组分或移动极其缓慢的分子。在焦点中停留时间超过约十分之一采集时间的分子，其扩散速率在 FCS 测量中将无法被准确反映。^3,12因此，FCS测得的扩散系数通常比FRAP和SPT等技术报告的扩散速率更快，因为后者同时考虑了接近静止和极慢扩散的组分。此外，SPT相较于FCS能更详细地描述分子群体内扩散速率的变异性。

FCS通过测量激发体积内荧光强度随时间的波动来对其进行量化。在膜测量的情况下，这对应于膜的被照明区域。本文利用了这样一个事实：此类波动由表现出布朗扩散的分子引起，这些分子不断进出激发体积。此外，荧光信号的波动还可能来源于其他多种因素，例如荧光团的闪烁或三重态的存在、环境效应、配体的结合与解离，或整个细胞膜的运动。在设计FCS实验时，必须考虑这些潜在的误差来源，以便准确解读实验结果^12,13。通常情况下，由于拥挤效应以及膜蛋白之间、蛋白质与细胞骨架之间的相互作用，生物膜中的侧向扩散速率较低。历史上，FCS在膜研究中的应用一直受到缺乏光稳定荧光团的限制，因为在较长的通过激发焦点的时间内必须避免光漂白¹⁴。然而，如今已有大量适合的光稳定染料可供选择。探测器及其他硬件的显著改进也使得能够检测亮度较低的荧光蛋白和染料。本文描述了一种使用小鼠原代淋巴细胞进行FCS分析的基本实验方案，其中目标蛋白通过荧光标记抗体进行标记。同时展示了拟合自相关曲线以提取扩散系数和分子密度的方法。本方案旨在为无分子扩散研究技术经验的免疫学家提供易于遵循的操作流程。但要求使用者具备共聚焦显微镜的基本知识（如需获得此基础知识，请参见参考文献¹⁵）。该方案可相对容易地适用于其他悬浮细胞，包括细胞系和原代细胞。对于经验更丰富的FCS使用者，存在更为精细的分析方法，其中一些将在讨论部分中介绍。

方案

1. FCS 染色

1. 根据制造商说明书，使用磁珠标记法从脾脏淋巴细胞中分离小鼠NK细胞¹⁶. 使用 2-3 x 10⁵ 每个样本的细胞数用于后续步骤。
   注意：使用阴性筛选富集目标细胞群体，使目标细胞不受影响，从而仅需使用一抗即可对细胞进行标记。参见参考文献² 有关从小鼠中分离细胞的更详细信息².
2. 对于表达 Fc 受体的小鼠细胞，使用抗体克隆 2.4G2 在每份样本 25 μl 含 1% 胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中以 5 µg/µl 的浓度阻断 Fc 受体。室温孵育 15 分钟。
3. 抗体混合物的制备
   1. 使用直接偶联光稳定荧光染料的抗体。若同时使用针对两种不同蛋白的两种抗体，应选择发射光谱分离良好的荧光染料，以最大限度减少串扰（例如， 由488和633激光器激发²，后续方案中分别简称为“绿色”和“红色”激光及荧光染料。
      注意：如果所选生物标志物没有可获得的、带有光稳定荧光染料的商用抗体，则根据制造商说明书将未标记抗体与荧光染料进行偶联。参见 材料表 本研究中所用抗体。
   2. 用 PBS 加 1% FBS 稀释针对目标蛋白的荧光标记抗体，配制抗体混合液。将抗体混合液加入各样品中，每份样品终体积为 50 μl。冰上避光孵育 45 分钟。
      注意：预先优化抗体浓度，以确保抗体在饱和浓度下使用，通常为1-10 μg/ml。
4. 孵育后，加入 250 μl PBS 洗涤细胞，于 150 × g 离心 3 min，弃去上清液。
5. 重复步骤 1.4。
6. 将细胞重悬于 200 μl PBS + 1% FBS 中。避光并置于冰上，直至上机检测。
   注意：小鼠NK细胞可在冰上保存长达10小时。

2. 显微镜腔室盖玻片的制备

注意：使用带腔室的盖玻片载玻片或培养皿时，应选择显微镜已优化适配的盖玻片厚度，通常为 #1 或 #1.5。如果显微镜未针对特定厚度进行校准，或厚度未知，则需要调整显微镜的物镜校正环，以匹配当前所用盖玻片的厚度¹⁷。

1. 按1:10的比例将聚-L-赖氨酸用蒸馏水稀释。向培养腔中加入200 μl稀释后的聚-L-赖氨酸，孵育20分钟。
2. 用抽吸法去除聚-L-赖氨酸，将培养腔在室温下敞口放置至少20-30分钟，使其自然风干。

3. 启动FCS系统

注意：本方案涉及特定的显微镜系统和软件（参见材料/试剂表），尽管也可使用其他显微镜设备和软件程序。

1. 开启配备FCS相关器的共聚焦激光扫描显微镜，以“专家模式”打开软件，选择40倍水浸物镜。
2. 在“采集”选项卡下，点击“配置”和“扫描”按钮，打开“配置控制”窗口和“扫描控制”窗口（分别为图1中的窗口A和B）；在“Confocor”选项卡下，点击“测量”按钮，打开“测量”窗口（图1中的窗口C）。
3. 创建一个文件夹用于保存FCS测量数据。在“文件”选项卡下点击“新建”，创建一个新的图像数据库。
4. 使用“激光”按钮，打开卤素灯以及用于激发荧光染料的相关激光器（例如，488 nm用于“绿色”激发激光，633 nm用于“红色”激发激光）。
5. 选择合适的激发和发射滤光片，并激活相应的探测器。
   1. 在“配置控制”窗口中设置图像采集参数，包括激发激光、激发和发射滤光片、光路以及将要使用的探测器。
   2. 同样，在“测量”窗口的“系统配置”选项卡下，设置FCS测量的相应参数。成像与FCS测量应尽可能使用相同的设置。
   3. 在“测量”窗口中，勾选“Ch1”框以激活绿色通道，勾选“Ch2”框以激活红色通道，用于FCS记录。
      注意：设置应针对所使用的荧光染料进行优化，如同标准共聚焦成像实验中的做法。在后续实验中，可通过用户界面顶部的“Confocor”下拉菜单选择“打开文件”，打开之前的FCS文件，然后在弹出的采集窗口中点击“重用”，即可重复使用相同的FCS设置。类似地，通过打开已保存的图像并点击“重用”，可加载图像采集设置。
6. 在进行FCS测量前，需等待激光器稳定。气体激光器可能需要长达30分钟才能稳定，而二极管激光器稳定时间较短。等待期间可调整针孔大小。

4. 针孔调节

1. 配制浓度为 0.2–0.5 μM 的荧光染料或荧光探针溶液，其激发和发射光谱需与抗体标记物的光谱相匹配。所用荧光染料必须具有已知的扩散系数。^18,19.
2. 在腔室盖玻片的孔中央滴加50 μl可被绿光激光激发的荧光染料溶液。在40倍水镜物镜上滴加一滴蒸馏水，并放置玻片。按下“Vis”按钮以开启可见光，通过目镜找到荧光染料液滴并调焦。
   注意：请使用与后续细胞测量相同的载玻片，因为不同载玻片之间玻璃厚度可能存在细微差异，从而影响显微镜的对焦。
3. 将焦点置于液滴内部（距底部10-100 μm处）。
4. 在“测量”窗口中，选择“采集”选项卡。在“位置”下方点击“当前位置”（C窗口） 图1).
5. 返回同一窗口中的“系统配置”选项卡。将绿色激光器的功率设置为较高值。
   注意：高激光功率指的是饱和功率（即， 荧光信号不会随激光功率的进一步增加而线性增强。系统设置功率约为1 mW，或最大激光功率的5-10%，通常已足够。
6. 通过点击“开始”来测试信号的稳定性。这将打开一个独立窗口，显示当前测量的时间轨迹和自相关曲线。检查荧光信号是否强度高、随时间保持稳定，并且波动频率在kHz范围而非Hz范围。
7. 在“测量”窗口中选择“O 调整”按钮。检查是否已选择正确的检测通道（Ch1 或 Ch2）。按下“AutoAdjust X”。如果得到的曲线未显示清晰的峰值，或峰值位于边缘位置，请勾选“coarse”选项，然后再次按下“AutoAdjust X”。当 X 方向的调整完成后，按下“AutoAdjust Y”对 Y 方向执行相同操作。
8. 取消选择“粗调”，然后交替调节X和Y，每次按下“AutoAdjust”，直至两者均出现清晰的峰值，且测量值在连续测量间不再变化。
9. 如果细胞用两种不同的荧光染料标记，则转移至已加入红色荧光染料溶液的腔室。选择较高的红色激光功率，并对红色激发和检测通道重复步骤4.6–4.8。
   注意：在仅使用一个针孔同时检测两个通道的系统中，如果X和Y值在各通道间存在偏差，请选择中间值，然后点击“确定”以接受更改。此处，488 nm激光的最大值位于X = 79、Y = 189，633 nm激光的最大值位于X = 80、Y = 188，因此选择X = 80、Y = 189。选用488 nm和633 nm激光分别激发被488 nm或633 nm激发的荧光染料标记的两种抗体是一种理想方案，因为当发射光谱无重叠时，串扰风险最小².

5. 测定游离荧光染料的通过时间

注意：通过测定已知扩散系数的荧光标记物穿过焦点的停留时间（TauD），可计算出检测体积的大小，进而确定位于焦点内的细胞膜区域面积。TauD 的计算方法见步骤 7.2。

1. 使用用于针孔调整的相同溶液，在“测量”窗口的“采集”选项卡下，将采集时间设置为30秒×2次重复。图1，窗口 C）。
2. 在“测量”窗口中点击“开始”以启动测量（图1，窗口B）。
   1. 对每种激发激光及其对应的溶液中荧光染料，进行激光功率梯度实验，起始功率为达到或接近饱和功率，之后每次测量时将功率减半。在“测量”窗口的“系统配置”选项卡中调整激光功率。图1，窗口 C）。按下“开始”按钮以启动测量。
      注意：在接下来的细胞测量中，应将激光功率设置在较低范围内（例如， 在物镜前以 16、8、4 和 2 μW 的功率进行测量²⁰系统激光设置通常高于输出激发光强度，且会因显微镜型号及光路准直质量的不同而有较大差异。在本系统中，上述功率范围对应约60–500 μW的系统设置功率。建议在首次使用新的显微镜时，使用功率计测量物镜前的激光输出功率。当前激光的最大输出功率可在“测量”窗口的“信息”按钮下查看。
   2. 记录每次激光功率测量中每分子的计数（CPM，单位：kHZ）。
   3. 若使用两个检测通道，需检查自相关曲线显示窗口是否存在串扰。使用仅含绿色荧光染料的溶液测量红色检测通道中的FCS自相关信号，使用仅含红色荧光染料的溶液评估绿色检测通道中的检测信号。一般原则是，来自“错误”荧光染料的每秒计数（CPM）应低于正确荧光染料特异性信号的5%。
   4. 检查数值是否随所用激光功率呈线性变化。在最高激光功率下，CPM 出现饱和现象（即， 略低于线性关系预期值的情况是可以接受的。
      注意：对于几乎所有显微镜系统和常见荧光染料，在最高激光功率下，每分子计数（CPM）应远高于10；对于高灵敏度系统，CPM值可显著更高。首次使用新标记的荧光抗体时，应通过荧光相关光谱（FCS）测量该抗体在溶液中自由扩散时的CPM值以量化预期信号。测量前，将200 μl聚-L-赖氨酸接枝聚乙二醇（用PBS稀释至0.5 mg/ml）加入测量腔室，室温孵育1小时。用移液器吸除液体后，使腔室自然风干。储存备用：母液置于冰箱（最多2周），粉末储备液置于冷冻保存。在显微镜实验中，将抗体用PBS稀释至1–10 µg/ml。按照本实验方案中的步骤4.2–4.4和6.7进行操作。若未使用防粘附溶液包被表面，抗体将与玻璃表面发生相互作用并迅速从溶液中耗尽。

6. 细胞测量

1. 从抗体标记的细胞悬液（步骤 1.5）中取 125 μl 细胞（溶于 PBS + 1% FCS），加入 150 μl 透明的 RPMI 1640 培养基（Roswell Park Memorial Institute medium 1640），混匀后加入 8 孔腔室载玻片的一个孔中。在开始 FCS 测量前，将细胞置于暗处、在测量温度下静置至少 20 分钟。
   注意：此步骤旨在使细胞沉降并贴附于孔底，同时使细胞和溶液达到测量温度的平衡状态。
2. 在“Scan Control”窗口（图 1，窗口 B）中设置放大倍数为 1，按下“Fast XY”按钮开始快速 X-Y 扫描。调节激光功率，使其尽可能低的同时仍能清晰观察到细胞。将图像中心对准一个亮度适中、呈圆形的细胞，其细胞膜边界清晰，且胞质内无荧光信号。逐步放大，直至细胞占据图像的大部分区域。
3. 若当前细胞正在移动，或出现须状突起、膜突或异常亮斑，则更换另一个细胞。同一实验中所有细胞的放大倍数和激光功率应保持一致。
   注意：细胞膜起皱也可能是即将发生凋亡的征兆。
4. 将焦平面聚焦于细胞膜顶部。在“Measurement”窗口的“Acquisition”选项卡中（图 1，窗口 C），通过激活“Crosshair”功能选择 FCS 测量位置。或者，切换至“LSM Image”选项卡，在 LSM 图像中标记所需的测量点，然后点击“Add position”。
   注意：细胞膜顶部不会受到非特异性结合于聚-L-赖氨酸的荧光抗体或荧光染料的影响。然而，必须确保细胞在测量过程中未发生移动（参见结果部分）。
5. 在“Measurement”窗口的“Acquisition”选项卡中（图 1，窗口 C），设置重复次数为 6–10 次，每次“Measure Time”设为 10 秒。
6. 返回“Measurement”窗口的“System Configuration”选项卡。在“Laser”按钮下调整 FCS 测量所用的激光功率。物镜前的激光功率应保持较低，用于细胞测量时建议在 1 至 10 μW²⁰ 范围内。
   注意：推荐值是在信号检测能力与细胞光损伤之间权衡的结果。参见步骤 5.2.1，并记录这些功率值对应的激光功率百分比。
7. 在“Measurement”窗口（窗口 C）中点击“Start”开始 FCS 测量。若在测量初期细胞发生明显漂白，表现为前 10 秒内荧光强度下降超过 30%（示例见 图 3A 下图），则更换细胞，并在后续测量中降低激光功率。
   1. 若信号丢失，需在 Z 方向上重新调节焦距。测量完成后，使用“Scan Control”窗口（图 1，窗口 B）检查细胞是否仍居中，以及是否正确测量了细胞膜区域。若细胞已移动，则舍弃该次测量数据。
   2. 在显示测量结果的自相关窗口中，手动删除包含缩放操作、漂白、大颗粒聚集体或其他伪影的单次重复数据（参见 图 3 中的示例）。方法为选中对应重复数据，右键点击并选择“Delete”。将最终文件保存为 .fcs 格式，每个细胞至少保留四次有效重复。
8. 可选步骤：使用“Scan Control”窗口获取细胞中段平面的图像（应能完整观察到细胞膜周长）。为避免漂白，应在 FCS 测量完成后进行成像。点击“Single”按钮开始图像采集。
9. 若使用“Add position”进行 FCS 焦点定位，在切换至下一个细胞前，请先点击“Remove position”。
10. 为保持细胞在整个实验过程中的活性，每次测量持续时间最长不超过 2 小时，之后应更换新的细胞悬液等分试样。

7. FCS 分析

1. 使用具有曲线拟合功能的软件打开 .fcs 文件（参见 材料/试剂表 用于本实验方案的软件）。
   注意：显微镜配套的 FCS 软件适用于熟悉基本拟合操作，但拟合二维膜扩散还需使用其他附加软件。
2. 首先，通过分析游离荧光团的测量结果确定激发体积的大小。将三维自由扩散曲线拟合到自相关曲线上²¹.
   (公式 1)
   注意：参数定义：N：焦体积内荧光单元的平均数量，τ（Tau）：相关时间，τ_D （TauD）：分子在焦点体积内的平均停留时间， T1：荧光团处于三重态的概率，τ_T：单重态-三重态跃迁的弛豫时间，S：焦斑体积的高度与宽度直径之比。
   1. 提取 TauD，即分子穿过焦点的传输时间。
   2. 使用观测到的TauD值以及用于校准的荧光染料的已发表扩散系数（D）^18,19 用于计算针孔半径（ω）。
      (公式 2)
3. 细胞膜上自相关曲线的分析
   1. 为了可视化代表分子扩散的曲线部分，选择自相关曲线最陡斜率之前开始、在曲线收敛于1之后结束的时间段例如， 0.001 至 5 秒，用于小鼠表面受体；参见 图4).
   2. 生成第6.7.2步中保存的各重复样本的平均自相关曲线。
   3. 使用公式3对每个平均自相关曲线拟合二维膜扩散曲线³.
      （公式 3）
      注意：重要的输出参数如下：N 是指位于激发膜区域内的分子平均数量。重新计算为密度（N/μm²τ_D （TauD）：分子在焦点区域的平均停留时间，受膜的二维性限制（s）。将平均停留时间重新计算为扩散系数（μm²/s）。²通过已确定的针孔半径（ω）和公式2计算（/sec）。T1是荧光分子处于三重态的概率。亮度（CPM）通过将测量的平均总强度除以N得到。
   4. 如果首次尝试未能获得良好拟合，请调整变量的初始值和/或上下限，直至达到良好拟合。
      注意：在原代细胞膜中，蛋白质扩散速率的典型上下限为：TauD 的范围是 10–500 毫秒，T1 的范围是 0–100%，TauT1 的范围是 0.1–5 毫秒。拟合时的初始值应选择这些区间中的中间值。代表由扩散引起的荧光波动的曲线部分通常位于 1 毫秒至 1 秒之间（参见 图4）。根据荧光团的不同，有时可能存在第二个过程，导致在比扩散参数更短的时间尺度上出现自相关。这通常由瞬时暗态（三重态）或闪烁现象引起（荧光蛋白常出现此类情况）。方程3已将三重态考虑在内，因此在这些情况下，所采用的模型仍能提供良好的拟合结果。

结果

典型结果将生成一条自相关曲线，膜蛋白的停留时间范围为 10 毫秒至 400 毫秒。每微米范围内的分子数可在 0.5 至约 200 之间变化² 用于内源性表达的蛋白质。请仔细检查CPM值是否不低于预期水平，这可能意味着背景信号存在干扰。经验法则是，在相同激光功率下，用于分析的细胞上的CPM信号不应低于游离扩散抗体CPM值的33%。CPM应随激光功率呈线性变化。初级免疫细胞表面受体的自相关曲线应平滑，最陡部分出现在0.001至1秒之间。参见 图2 代表性自相关曲线及其时间轨迹。

如引言中简要提及，由于其他来源的荧光波动会影响信号，导致结果混淆，在某些情况下，荧光相关光谱法（FCS）不适用于测量分子扩散。图3展示了应舍弃特定细胞或测量重复的几种示例情况。前文已提到，信号极低（CPM值非常低）是舍弃该细胞的原因之一。另一个舍弃单个细胞的原因是细胞发生移动（...

讨论

该FCS方案可用于评估各类免疫细胞（小鼠、人或其他物种）表面分子的分子动力学。FCS能够在活细胞中以单分子分辨率测量分子的空间-时间动力学。通过自相关曲线，可提取目标蛋白的分子密度、扩散速率以及聚集动力学等参数。

荧光标记对于成功的荧光相关光谱（FCS）实验至关重要。传统上，细胞膜上目标蛋白的标记采用抗体，而对于未经处理的免疫细胞表面蛋白，抗体通常是最为便捷的选择。未标记的抗体必须直接与光稳定性好、分子亮度高的荧光染料进行偶联。选择用于抗体偶联的荧光染料对测量质量具有重要影响。由于易发生快速漂白，不推荐使用流式细胞术中常用的标记物，如荧光素和藻红蛋白类染料。目前多家公司可提供适用于直接偶联抗体的光稳定染料。制造商通常会提供较为完善的偶联及纯化操作方案，整个过程可在数小时内完成。也可使用荧光蛋白进行FCS实验，但需特别注意尽量降低激光功率，因为荧光蛋白通常比最稳定的化学荧光染料更容易发生漂白。根据以往经验，蛋白的过表达常因空间拥挤效应导致扩散速率显著下降，因此不适合使用荧光蛋白标记。

在测量前进行针孔校准也是一个关键步骤。用于确...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MACS NK细胞分离试剂盒 小鼠II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	NK细胞的阴性筛选
胎牛血清	Sigma-Adlrich	F7524	热灭活
磷酸盐缓冲液	-	-	实验室自制
Roswell Park Memorial Institute 1640培养基	PAA The Cell Culture Company	E15-848	透明培养基
抗体克隆2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	用于阻断Fc受体
抗Ly49A抗体			实验室自制单克隆抗体，并在实验室中与Alexa fluor 647偶联
克隆JR9.318
抗H-2Dd抗体	BD Pharmingen	558915	在实验室中与MFP488偶联
克隆34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	用于抗体偶联的荧光染料
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P8920	用蒸馏水稀释（1.10）
聚乙二醇（2 kDa）接枝的聚-L-赖氨酸（20 kDa）	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	用PBS（pH 7.4）稀释至0.5 mg/ml
罗丹明110氯化物	Sigma-Aldrich	432202	已知扩散系数：3.3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	已知扩散系数：4.4 × 10−10 m2/sec 20
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM510
软件：Confocor 3	Zeiss
软件：Matlab（含曲线拟合工具箱）	Matlab	版本 R2013b
Nunc Lab-Tek 细胞培养腔室盖玻片	Thermo-scientific	155411	8孔，1.0硼硅酸盐底面