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方法文章

寨卡病毒感染性细胞培养系统及 体外 干扰素的预防作用

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DOI：

10.3791/54767

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2016年8月23日

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

寨卡病毒（ZIKV）是一种新发传染病病原体，与胎儿发育异常及小头症相关。建立有效的感染性细胞培养系统对于研究ZIKV复制以及疫苗和药物开发至关重要。本研究展示并讨论了与ZIKV相关的多种病毒学检测方法。

摘要

寨卡病毒（ZIKV）是一种新发传染病病原体，与胎儿发育异常相关，如小头畸形、眼部缺陷和生长受限。ZIKV 是一种属于黄病毒科的RNA病毒 黄病毒科 家族。ZIKV 主要通过蚊子传播，但也可能通过母婴垂直传播以及性接触传播。迄今为止，尚无可靠的治疗方法或疫苗可用于保护病毒感染者。建立可重复且有效的寨卡病毒（ZIKV）感染性细胞培养系统，对于研究 ZIKV 复制的分子机制以及药物和疫苗的开发至关重要。在这方面，本文描述了一种基于哺乳动物细胞的 体外 寨卡病毒培养系统用于病毒的增殖与生长分析，本文报道了寨卡病毒在细胞单层上形成蚀斑的详细过程，以及用于测定病毒滴度的蚀斑试验方法。同时，对病毒基因组复制动力学及双链RNA基因组复制中间体进行了检测。该培养平台被用于筛选一组小型细胞因子文库，结果鉴定出干扰素-α（IFN-α）、IFN-β和IFN-γ为抑制寨卡病毒生长的强效因子。综上所述，一个 体外 本研究展示了具有感染性的寨卡病毒培养系统及多种病毒学检测方法，有望为科研界进一步阐明病毒致病机制和病毒毒力进化提供重要支持。此外，抗病毒干扰素-α可进一步评估用于高风险人群（包括感染寨卡病毒的孕妇）的预防、暴露后预防及治疗方案。

引言

寨卡病毒（ZIKV）是一种与小头症及不良妊娠结局相关的重要人类病原体1,4。ZIKV 属于一组具有医学意义的黄病毒，这类病毒可引起登革热、西尼罗河病毒和圣路易斯脑炎病毒等神经系统缺陷。病毒主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）媒介传播，此外也有性传播的报道5,6。由于媒介蚊虫的地理分布不断扩展，且 ZIKV 与出生缺陷之间存在强烈关联，该病毒已成为全球重要的公共卫生问题。ZIKV 最早于 1947 年从乌干达寨卡森林的一只哨兵恒河猴体内分离获得，首例人类病例于 1952 年报道7,8。感染 ZIKV 的个体通常表现为轻度症状，如发热、皮疹、头痛、结膜炎以及肌肉/关节疼痛。感染 ZIKV 的孕妇可将病毒传播给发育中的胎儿1。ZIKV 感染还被发现与吉兰-巴雷综合征相关，后者是一种周围神经的自身免疫性脱髓鞘疾病9。

寨卡病毒基因组由一条正义单链RNA分子组成，长度约为10.8千碱基。其基因组结构排列为5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR，两端为非编码区（NCR），中间为编码蛋白质的区域6。该基因组翻译产生一条单一的多聚蛋白（3,419个氨基酸），随后在翻译过程中及翻译后被切割成10个较小的肽段。5'NCR和3'NCR的RNA茎环结构在病毒基因组翻译和复制的起始过程中发挥关键作用。基因组的结构蛋白包括衣壳蛋白、膜蛋白和包膜蛋白。非结构蛋白则对基因组复制至关重要。

目前，寨卡病毒毒株分为三种主要基因型：西非型、东非型和亚洲型6,10-13。有研究提出，东非谱系曾传播至西非和亚洲，并在这些地区进一步演化12。当前在美洲暴发的疫情由亚洲基因型引起。寨卡病毒可在蚊子细胞和哺乳动物细胞中培养。皮肤成纤维细胞、未成熟树突状细胞、皮层神经前体细胞以及Vero细胞均易受寨卡病毒感染10,14,15。Ⅰ型和Ⅱ型干扰素均已被证明可抑制皮肤成纤维细胞中寨卡病毒的增殖15。本研究的目的是提供一个逐步详尽的实验方案，用于在哺乳动物细胞培养系统中生产并检测亚洲基因型寨卡病毒毒株PRVABC59，并展示该感染性培养系统作为药物研发平台的应用价值。该资源有望显著促进寨卡病毒及神经科学研究领域，进一步阐明其病毒致病机制以及毒力进化的规律。

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方案

注：工作流程的示意图见图1。

1. 细胞

  1. 使用Vero细胞进行寨卡病毒的生产及病毒复制周期的分析。
  2. 配制含有10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（100单位/毫升）、链霉素（100单位/毫升）和10 mM HEPES的完全生长培养基。
  3. 在37 °C、5% CO2条件下，使用指定的完全生长培养基培养Vero细胞。

2. 寨卡病毒的制备

  1. 在 T-75 培养瓶中使用 0.25% 胰蛋白酶收获细胞密度为 80% 的 Vero 细胞，并进行细胞计数。
    1. 吸除 T-75 培养瓶中的培养基，并用 2 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞。
    2. 加入 2 ml 0.25% 胰蛋白酶，将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。
    3. 加入 8 ml 含血清的生长培养基以中和胰蛋白酶活性。用移液器反复吹打使细胞悬浮，然后将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中。
    4. 取 10 µl 细胞悬液，与等体积的 0.4% 台盼蓝混合。将制备好的混合液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪获取活细胞数量。
  2. 将总计 700 万个细胞以 30 ml 体积接种至 T-160 培养瓶中。
  3. 次日，每瓶用 10 ml 无血清培养基配制适当感染复数（0.01 至 0.1 MOI）的寨卡病毒接种液。
  4. 吸除 T-160 培养瓶中的旧培养基，加入新配制的病毒接种液（10 ml）。
  5. 将接种后的培养瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4–6 小时。每隔 1 小时轻轻倾斜培养瓶，使接种液均匀分布。
  6. 孵育结束后，每瓶更换为 30 ml 预热的含血清生长培养基，继续培养病毒 96 小时。
  7. 通过相差显微镜观察细胞单层上病毒蚀斑的形成情况，监测感染进程，并根据需要在 40X 和 200X 放大倍数下拍照记录（图 2）。

40倍和200倍放大下的细胞分化过程，显微镜图像，细胞生物学研究。
图2：寨卡病毒在Vero细胞单层上形成的蚀斑。不同放大倍数的明场图像显示了感染后48小时（48 hpi）的寨卡病毒蚀斑。注意单层上出现的圆形细胞病灶。（比例尺 = 50 µm）请点击此处查看该图的高清版本。

  1. 在96小时时间点收集细胞培养上清液，并于4 °C下以300 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。
  2. 小心吸取上清液，避免扰动沉淀的碎片，转移至15 ml离心管中。可选择在24,000 × g条件下进行超速离心，以浓缩病毒颗粒（可选步骤）。
  3. 将病毒培养上清液分装成多份，于-80 °C保存。

3. 通过噬斑实验测定寨卡病毒滴度

  1. 使用12孔板，以每孔2 ml体积将Vero细胞以每孔1×105个细胞的密度接种。
  2. 次日，用无血清培养基对从T-160培养瓶收集的病毒培养上清液进行10倍系列稀释。吸弃各孔中的旧培养基，每孔加入400 µl已稀释的病毒接种液，设三个重复孔。
  3. 将接种后的培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育4–6小时。每隔1小时轻轻倾斜培养板，使接种液均匀分布。
  4. 孵育结束后，弃去接种液，每孔加入含血清的培养基（2 ml/孔）。
  5. 接种后48小时，使用相差显微镜计数病毒病灶，并以每毫升空斑形成单位（PFU）计算病毒滴度。空斑实验示意图参见图3。
  6. 使用含20%乙醇的4%甲醛和0.1%结晶紫溶液对细胞进行固定和染色，以便清晰观察空斑。

4. 寨卡病毒基因组复制检测

  1. 使用12孔板，以每孔2 ml体积接种初始Vero细胞，密度为每孔1 × 105 个细胞。次日，用无血清培养基制备低滴度和高滴度的病毒接种物（MOI分别为0.01和0.1；每孔400 µl），设三个重复。对于模拟感染组，仅使用无血清培养基（每孔400 µl）。
  2. 重复步骤3.2至3.4。
  3. 在48小时和96小时时间点，收集样本用于RNA提取和免疫细胞化学（ICC）检测。
    1. 收集RNA样本时，吸除培养基，然后直接向每孔加入400 µl裂解液，并收集裂解产物。
    2. 进行ICC检测时，吸除培养基，然后向每孔加入1 ml甲醇固定细胞，并将培养板在4 °C孵育30分钟。
    3. 从细胞裂解液中，按照试剂盒制造商说明书使用RNA提取试剂盒分离总RNA。使用分光光度计对RNA进行定量。
  4. 进行两步法反转录定量PCR（RT-qPCR），以测定所提取RNA中的ZIKV基因组含量。
    1. 进行RNA反转录时，首先在0.2 ml离心管中配制13 µl反应体系，包含5 µg提取的RNA、1 µl dNTPs（10 mM）和1 µl随机六聚体引物（250 ng）。将反应管在65 °C孵育5分钟，随后置于冰上1分钟。接着向反应体系中加入1 µl反转录酶、4 µl 5×第一链合成缓冲液、1 µl 0.1 M二硫苏糖醇（DTT）和1 µl RNase抑制剂。先在25 °C孵育5分钟，再在50 °C孵育60分钟，最后在70 °C加热15分钟以终止反应。
    2. 使用1 µl上述获得的cDNA，在25 µl反应体系中进行qPCR，反应体系包含12.5 µl 2×绿色染料预混液（含DNA聚合酶）和1 µl 10 mM特异性引物，引物针对寨卡病毒[Zika病毒泛基因型引物（正向：5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3'；反向：5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3'），Zika病毒亚洲基因型PRVABC59株引物（正向：5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'；反向：5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3'）]、丙型肝炎病毒（JFH RTQ F: 5'-CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3；JFH RTQ R: 5'-CCTATCAGGCAGTACCACA-3'）或细胞看家基因GAPDH（正向：5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3'；反向：5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3'）。
    3. 在实时荧光定量PCR系统中，按照以下程序运行PCR：95 °C 15秒，60 °C 30秒，共40个循环。
    4. 根据循环阈值（Ct）对GAPDH表达水平进行归一化，以校正Zika病毒基因组的检测值。计算Zika基因组相对于GAPDH的ΔCt值，并获得2ΔCt值。然后通过计算感染组与未感染组细胞在指定时间点归一化后的Zika基因组含量比值，得出倍数变化。ZIKV基因组复制结果见图4。
  5. 使用甲醇固定的细胞进行免疫细胞化学（ICC）检测。
    1. 用1× PBS洗涤固定后的细胞三次，并用ICC封闭缓冲液（含3%山羊血清、3% BSA和0.1% Triton X-100的PBS溶液）进行封闭。
    2. 将小鼠单克隆抗双链RNA抗体J2（1 µg/ml）按1:100比例溶于封闭缓冲液中，加入后于4 °C孵育过夜。
    3. 用1× PBS洗涤细胞，然后加入二抗——山羊抗小鼠IgG-594（1 µg/ml），按1:1,000比例溶于封闭缓冲液，室温孵育1小时。
    4. 用1× PBS洗涤细胞，使用Hoechst染料对细胞核进行染色，并在荧光显微镜下以100倍放大倍数观察细胞（图4）。

5. 针对寨卡病毒感染的细胞因子文库筛选

  1. 使用12孔板，以每孔1 x 105个细胞的密度接种 naive Vero 细胞。待细胞贴壁后（接种后6小时），在每个孔中加入不同浓度的细胞因子，设两个生物学重复（每孔2 ml）。设置仅含载体（PBS）的对照组。
  2. 处理后12小时，进行寨卡病毒（Zika virus）感染（每孔400 µl，MOI为0.1）。设置未感染病毒的阴性对照孔（mock）。
  3. 感染后4小时，将病毒接种液更换为含细胞因子的培养基（2 ml），继续在37 °C 培养44小时。
  4. 感染后48小时，使用相差显微镜计数病毒蚀斑，并在40倍放大倍数下拍摄感染细胞的代表性图像（图5）。

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结果

本研究采用了一种亚洲基因型的寨卡病毒毒株（PRVABC59；GenBank 登录号 KU501215）12. 用于研究的 Vero 细胞应达到 80% 融合度 从头合成 寨卡病毒感染。为了病毒的制备及后续的病毒学表征，实验采用早期传代（P3代）的寨卡病毒。感染后第二天可观察到病毒蚀斑。最初感染细胞释放的寨卡病毒子代可扩散至邻近细胞，从而在单层细胞培养中形成可见的蚀斑。图2）。寨卡病毒感染的细胞病变效应（CPE）表现为细胞形态改变，如细胞变圆、脱落以及溶细胞死亡。

为测定病毒滴度，将从T-160培养瓶收获的含病毒无细胞上清液进行10倍系列稀释，并接种至12孔板中的Vero细胞单层（图3）。以接种后48小时作为终点，以避免计入继发感染产生的噬斑。选择含有30–100个噬斑的孔进行计数，以获得准确的滴度。

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讨论

此处提供了一种简化的寨卡病毒培养方案 体外 介绍了关键步骤，包括确定病毒培养扩增的最佳终点、滴度测定以及基因组复制的定量。寨卡病毒是一种人类病原体，因此在操作传染性病原时必须严格遵守生物安全操作规程。实验中使用了猴肾细胞系Vero来演示多种病毒学检测方法。寨卡病毒在不同组织和物种来源的细胞中其复制动力学可能存在差异。其他细胞系也可参照先前描述的方法使用。15寨卡病毒已从受感染胎儿的脑组织中分离出来3 并已被证实可感染皮层神经前体细胞14因此，评估寨卡病毒（ZIKV）感染在神经元细胞中的病理生理学特征，可提供更具细胞特异性的深入见解。利用该感染性培养系统，可进一步研究非洲型和亚洲型基因型在神经毒力表型上的差异。本文所述的病毒制备方法同样适用于高滴度病毒的生产。 体内 在非人灵长类或啮齿类动物模型系统中的致病性研究。

尽管本研究仅限于使用Vero细胞，但也可测试来源于人类和蚊子的高滴度生产细胞系。在病毒生产过程中，若第3天仅观察到10-30%的细胞出现细胞病变效应（CPE），可将感染细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢美国疾病控制与预防中心（CDC）的 Aaron Brault 博士和 Brandy Russell 博士提供寨卡病毒 PRVABC59 毒株。感谢耶鲁大学的 Nicholas Ten 对本手稿进行文字编辑。本研究由 Cedars-Sinai 医学中心机构研究项目奖资助，授予 V.A.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基Sigma生命科学D5796
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
2.5% 胰蛋白酶，10 倍浓度，无酚红  康宁25-054-C1
0.4% 台盼蓝染色液Life TechnologiesT10282
库尔斯 – 自动细胞计数仪赛默飞世尔科技C10227
Countess 细胞计数  腔室载玻片ThermoFisher ScientificC10283
RNeasy Mini试剂盒Qiagen74104
Nanodrop 2000赛默飞世尔科技Nanodrop 2000
小鼠单克隆抗双链RNA抗体 J2 英文 & 科学咨询有限公司10010200
山羊抗兔IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
SUPERSCRIPT III 逆转录酶 Life Technologies18080085
SYBR QPCR 超级混合液（含 ROX）Life Technologies11744500
QuantStudio 12K Flex 实时荧光定量 PCR 系统Thermo Fischer4471088
无RNase的DNasePromegaM6101
Vero 细胞系 ATCCCCL-81
寨卡病毒株 PRVABC59美国疾病控制与预防中心（CDC）
IL-6Peprotech200-06             
IL-1α       Peprotech200-01A          
TNF-αPeprotech300-01A          
干扰素αA  R & D Systems11100-1
干扰素βPeprotech300-02BC
干扰素γPeprotech300-02
Centrifuge 5415REppendorf5415R
Centrifuge 5810REppendorf5810R
尼康Eclipse Ti免疫荧光显微镜，配备尼康Intensilight C-HGFI尼康访问尼康以获取申请

参考文献

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