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方法文章

用于微胶囊化应用的植物基胶囊提取

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⸱

DOI：

10.3791/54768

⸱

2016年11月9日

 ,  ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

本文内容

摘要

本方案/手稿描述了一种从石松（Lycopodium clavatum）孢子中制备孢粉素外壁胶囊（SECs）的简化流程，以及将亲水性化合物装载入这些SECs的方法。

摘要

源自植物孢子或花粉的微胶囊为多种微胶囊化应用提供了坚固的平台。孢粉素外壁胶囊（SECs）是通过去除孢子或花粉内部的孢质内容物后获得的。所得的中空微胶囊表现出高度的微粒均匀性，并保留了与特定植物物种相关的复杂微观结构特征。本文中，我们展示了一种从Lycopodium clavatum孢子制备SECs并将其负载亲水性化合物的简化工艺。目前的SEC分离方法已近期优化，显著减少了传统SEC分离过程中所需的处理步骤，并确保获得完整的微胶囊。天然L. clavatum孢子首先用丙酮脱脂，再经磷酸处理，并经过充分洗涤以彻底去除孢质内容物。在丙酮脱脂后，仅需使用85%磷酸进行一次处理步骤即可完全去除孢质内容物。将酸处理时间控制在30小时以内，可成功分离出洁净的SECs，并避免因处理时间过长而导致的SEC破裂。通过大量用水、稀酸、稀碱和有机溶剂反复洗涤，确保所有孢质物质和化学残留物被充分清除。采用真空负载技术将一种模型蛋白（牛血清白蛋白）作为代表性亲水性化合物载入SECs中。真空负载提供了一种简单的方法，可在无需使用剧烈溶剂或不理想化学试剂的情况下负载多种化合物，而这些试剂通常在其他微胶囊化方案中是必需的。基于上述分离与负载方案，SECs作为一种有前景的材料，可广泛应用于治疗药物、食品、化妆品及个人护理产品等多种微胶囊化领域。

引言

人们对从植物孢子和花粉中获取的天然植物基微胶囊在微胶囊化应用中的使用具有浓厚兴趣1-15。在自然界中，孢子和花粉可为敏感的遗传物质提供保护，使其免受恶劣环境条件的影响。植物孢子和花粉的基本结构通常包括外层壳壁（外壁）、内层壳壁（内壁）以及内部的细胞质物质。外壁由一种化学性质稳定的生物聚合物1,9,10,13,16构成，称为孢粉素；而内壁主要由纤维素类物质组成16-18。通过多种方法7,9可去除细胞质成分、蛋白质及内壁层，从而分离得到空心胶囊2,12,16。这些孢粉素外壁胶囊（SECs）因其粒径分布窄、形态均一，成为合成包封材料的一种极具吸引力的替代选择7,9,13,19,20。建立从不同植物物种（如Lycopodium clavatum）中获取SECs的标准化工艺，为药物递送、食品和化妆品等领域的广泛应用开辟了前景6,10-13,21

为了获得孢粉素外壁囊（SECs），研究人员首先使用有机溶剂处理孢子和花粉，并在碱性溶液中回流，以去除细胞质成分。22-25 然而，研究发现残留的囊状结构仍含有纤维素性质的内壁层。为了去除该内壁层，研究人员探索了使用盐酸、热硫酸或热磷酸进行长时间酸水解处理的方法，持续数天时间。22-25 其中，磷酸逐渐成为去除SEC内壁的首选方法。2 然而，多年来的持续研究表明，不同种类的孢子和花粉对常用剧烈处理方法的耐受性存在差异。26,27 某些孢子和花粉在强碱性溶液中会完全降解并丧失全部结构完整性，或在强酸性溶液中遭受严重损伤。16 孢粉素外壁对处理条件的响应差异，源于不同物种间孢粉素外壁材料在化学结构和外壁形态上的细微差别。28 由于孢粉素外壁囊（SECs）的稳定性存在差异，因此有必要针对每一种孢子和花粉物种优化其处理条件。

来自 L. clavatum物种的植物孢子已成为研究最广泛的单一SEC来源。这主要归因于其广泛可得、成本低廉、单一分散性以及化学稳定性。9,29这些孢子易于采集，其孢子原生质内容物以1–2 µm大小的细胞器和生物分子聚集体形式存在。11 L. clavatum孢子曾被用作天然粉末润滑剂30,31、化妆品基质30，以及草药医学32–36中多种治疗用途的成分。L. clavatum来源的SEC在加工过程中表现出比其他孢子和花粉来源的SEC更强的耐受性。2加工后所得SEC仍能保持其复杂的微脊结构和高度形态均一性，同时提供较大的内部空腔用于包封。7研究表明，L. clavatum SEC可用于包封药物10,13、疫苗11、蛋白质7,14、细胞8、油脂5–7,9以及食品补充剂5,15。与传统包封材料相比，SEC的包载效率相对较高。7此外，SEC包封还具有一些已报道的优势，例如能够掩盖味道6,10，并提供一定程度的天然抗氧化保护。12在现有研究中，L. clavatum SEC提取最常用的方法包含四个主要步骤：第一步是在50 °C条件下使用丙酮回流处理长达12小时，以去除孢子中的脂质。11第二步是在120 °C条件下使用6%氢氧化钾碱性回流处理长达12小时，以去除细胞质和蛋白类物质。11第三步是在180 °C条件下使用85%磷酸酸性回流处理长达7天，以去除纤维素性质的内壁层（intine）材料。11第四步是使用水、溶剂、酸和碱进行全面洗涤，以彻底清除所有残留的非外壁物质及化学残留物。

与包封应用相关的SEC提取主要目标是制备无细胞质成分、不含潜在致敏蛋白且形态完整的胶囊2,37。然而，从工业生产的角度来看，还需考虑其他经济和环境因素，例如能源效率、生产周期、安全性以及所产生的废弃物。就能源效率而言，高温和长时间处理不仅影响生产成本，也影响环境足迹。生产周期和周转时间是影响加工盈利能力的关键因素。特别值得关注的是，高温磷酸处理会增加安全风险，并已知会导致腐蚀性结垢，从而显著增加基础设施维护成本并延长批次周转时间38-40。在条件允许的情况下，尽量减少所需步骤数量可能显著降低所产生的废弃物。然而，目前常用的L. clavatum SEC提取四步法仅源于数十年的研究积累，实际工艺优化较少。最近，Mundargi et al.41通过系统评估和优化一种最常报道的SEC提取技术，为该领域的持续研究做出了重要贡献。

在本研究的第一部分：采用在50 °C条件下用丙酮处理6小时的方法进行孢子脱脂；采用在70 °C条件下用85%磷酸处理30小时的方法去除孢质和内壁；通过大量水洗、溶剂洗、酸洗和碱洗以去除残留的孢质成分；并通过对流干燥和真空烘箱干燥实现SEC干燥。在第三部分，通过模型蛋白牛血清白蛋白（BSA）的真空负载，演示SEC真空负载操作，随后进行载BSA的SEC洗涤和冷冻干燥。在第四部分，通过离心、探针超声处理和紫外/可见光光谱法测定BSA的包封效率。

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方案

1. 从L. clavatum孢子中提取孢粉素外壁胶囊（SECs）

注意：SEC 提取过程涉及易燃粉末（L. clavatum）、高温腐蚀性酸和易燃溶剂，因此必须佩戴适当的个人防护装备（护目镜、面罩、手套、实验服），并由授权的实验室人员进行化学品使用的批准风险评估及妥善处置。

  1. 孢子脱脂
    1. 在通风橱中使用玻璃冷凝管、水循环系统和水浴装置搭建回流装置（图1）。
    2. 称取100 g L. clavatum 孢子，操作时避免产生粉尘，并远离任何点火源。
      注意：本实验所用孢子为商业购买（见材料清单）。
    3. 将孢子缓慢转移至带有磁力搅拌子的1 L聚四氟乙烯（PTFE）圆底烧瓶中。
    4. 向PTFE烧瓶中的孢子加入500 ml丙酮，轻轻摇动烧瓶以形成均匀悬浮液。
    5. 将PTFE烧瓶置于设定为50 °C的水浴中，并连接回流冷凝管。
    6. 在50 °C条件下以200 rpm搅拌回流6小时，随后在室温下冷却。
    7. 使用滤纸在减压条件下过滤悬浮液，将脱脂后的孢子收集于大尺寸（直径15 cm）玻璃培养皿中。
    8. 在室温下（通风橱内）用带孔的铝箔覆盖样品，使溶剂挥发，干燥孢子。
  2. 酸解处理
    1. 使用去离子水（DI水）配制85%（v/v）磷酸溶液，并将脱脂干燥的孢子转移至1 L PTFE烧瓶中。
    2. 向脱脂孢子中加入500 ml 85%（v/v）磷酸溶液。
    3. 将PTFE烧瓶置于设定为70 °C的水浴中，并连接回流冷凝管。
    4. 在70 °C条件下温和回流30小时，随后在室温下冷却。
    5. 用500 ml温热的去离子水稀释悬浮液，并通过滤纸减压过滤收集SECs（孢子外壁囊）。
    6. 将SECs转移至3 L玻璃烧杯中，进行一系列洗涤操作。
  3. SEC洗涤
    1. 将含有SECs的3 L玻璃烧杯置于通风橱中。
    2. 向SECs中加入800 ml热水（50 °C），轻柔搅拌10分钟。
    3. 使用滤纸和减压过滤装置过滤悬浮液。
    4. 将SECs收集至洁净的3 L玻璃烧杯中。
    5. 重复步骤1.3.1至1.3.4共五次。
    6. 向SECs中加入600 ml热丙酮（45 °C），轻柔搅拌10分钟。
    7. 通过减压过滤收集SECs，并将其转移至洁净的3 L玻璃烧杯中。
    8. 使用600 ml热（50 °C）2 M盐酸重复步骤1.3.6和1.3.7。
    9. 使用600 ml热（50 °C）2 M氢氧化钠重复步骤1.3.6和1.3.7。
    10. 重复步骤1.3.1和1.3.4共八次。
    11. 使用600 ml热（45 °C）丙酮重复步骤1.3.6和1.3.7。
    12. 使用600 ml热（45 °C）乙醇重复步骤1.3.6和1.3.7。
    13. 使用800 ml热（50 °C）去离子水重复步骤1.3.6和1.3.7。
    14. 将洗净的SECs转移至六个大玻璃培养皿中，在通风橱室温下干燥24小时，以完全去除水分。
    15. 将SECs在60 °C、1 mbar真空条件下于真空烘箱中干燥10小时，或直至恒重。
    16. 收集干燥的SECs并转移至聚丙烯瓶中。
    17. 将SECs储存于干燥柜中。

2. SECs 的表征

  1. 利用不同阶段产生的孢子和SECs进行扫描电子显微镜分析41。
  2. 利用不同阶段产生的孢子和SECs进行元素分析41 。在元素分析前，将所有样品于60 °C下干燥至少1小时，并使用氮含量百分比乘以6.25的换算因子计算蛋白质含量11。每份样品进行三次重复测量以获得结果。
  3. 采用动态图像颗粒分析仪进行微粒特性分析41 。
  4. 使用共聚焦激光扫描显微镜对未经处理、经过处理以及负载FITC-BSA的SECs进行扫描41 。

3. 通过真空加载技术封装生物大分子

  1. 使用去离子水配制 1.2 ml 浓度为 125 mg/ml 的牛血清白蛋白（BSA）溶液，并转移至 50 ml 聚丙烯管中。
  2. 称取 150 mg SECs 并转移至 BSA 溶液中。
  3. 涡旋振荡管子 10 分钟，形成均匀溶液。
  4. 用滤纸覆盖管口。
  5. 将管子转移至冷冻干燥瓶中，在 1 mbar 真空条件下干燥 4 小时。
  6. 对三个独立批次重复执行步骤 3.1 至 3.5。
  7. 收集载有 BSA 的 SECs，并使用研钵和研杵去除团聚物。
  8. 将载有 BSA 的 SECs 转移至 50 ml 管中，加入 2 ml 去离子水以去除残留的 BSA。
  9. 在 4,704 × g 离心 5 分钟收集 SECs，并弃去上清液。
  10. 用去离子水再洗涤一次。
  11. 用滤纸覆盖装有载 BSA 的 SECs 的管子。
  12. 将 SECs 转移至冷冻箱（-20 °C）中冷冻 1 小时。
  13. 将 SECs 冷冻干燥 24 小时，并储存于冷冻箱中，待进一步表征。
  14. 按照步骤 3.1 至 3.13 的相同程序制备不含 BSA 的空白 SECs。
  15. 按照步骤 3.1 至 3.13 的相同程序制备载有 FITC-BSA 的 SECs。

4. 包封效率的测定

  1. 在2 ml聚丙烯管中称取5 mg载有牛血清白蛋白（BSA）的SECs。
  2. 加入1.4 ml pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS），涡旋振荡5分钟。
  3. 以40%的振幅对悬浮液进行探头超声处理，每次10秒，共3个循环。
  4. 使用0.45 µm聚醚砜（PES）滤膜过滤溶液。
  5. 使用空白SECs按照步骤4.1至4.4相同的操作流程进行处理。
  6. 以空白SECs作为对照，测定280 nm处的吸光度。
  7. 利用PBS中BSA标准曲线（200至1,000 µg/ml）定量包封的BSA含量。42

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结果

孢粉素外壁胶囊的简化提取工艺

L. clavatum 的孢粉素微胶囊（SEC）提取过程主要包括三个步骤：（1）使用丙酮进行脱脂；（2）使用85%（v/v）磷酸进行酸解；（3）使用溶剂进行多次SEC洗涤。简化的SEC提取流程如图1 A - I所示。简而言之，该过程首先进行丙酮回流脱脂，持续6小时，温度为50 °C；脱脂后的孢子在通风橱中过夜干燥，以去除残留的丙酮。随后，将脱脂孢子在磷酸中进行酸解处理，持续30小时。在酸解过程中，大部分孢质材料被溶解，并在后续的真空过滤步骤中被去除。为了彻底去除残留的孢质成分，需依次使用溶剂、酸、碱和水进行一系列广泛的洗涤操作。最后，将获得的SEC在室温下初步干燥24小时，再于60 °C、1 mbar真空条件下进一步干燥10小时，以彻底去除残留的溶剂和水分。

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讨论

本研究系统分析了从L. clavatum孢子中提取SEC的方法，结果表明，在提高胶囊质量的同时，还可显著简化现有常用方案11。与现有方法需要高温（180 °C）和长时间处理（7天）相比11，本研究对SEC提取工艺的优化主要集中在降低酸解步骤的温度和缩短处理时间。

脱脂和碱处理对孢子中孢质材料的去除作用有限。然而，酸解处理从5小时延长至120小时，可最大程度地去除孢质材料。结果表明，与传统方法相比11，总处理时间和温度可显著降低，仅需在中等温度（70 °C）下使用磷酸处理30小时即可获得最优质量的胶囊。此外，当酸解时间超过30小时后，发现SECs开始出现断裂，颗粒碎片显著增加，提示整批SECs的整体结构完整性可能正在下降。另外需要注意的是，L. clavatum被认为含有相对坚固的孢粉素2，因此本方案中涉及的具体处理条件，如酸浓度、温度和/或水解时间，可能需要根据其他花粉种类进行相应调整。

研究表明，仅使用...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家研究基金会（NRF-NRFF2011-01）和国家医学研究理事会（NMRC/CBRG/0005/2012）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Lycopodium clavatum 孢子（s型）Sigma19108-500G-F
牛血清白蛋白SigmaA2153-50G
FITC标记的BSASigmaA9771-250MG
磷酸（85% w/v）Sigma438081-2.5L
盐酸SigmaV800202 
氢氧化钠SigmaS5881-1KG 
丙酮SigmaV800022
乙醇AcME C000356
去离子水Millipore纯化水 
定性滤纸（1号，棉质纤维素）
聚苯乙烯微球（50 ± 1 µm） Thermoscientific（CA，美国）4250A
Vectashield Vector labs（CA，美国）H-1000
粘附式载玻片，D 263 M Schott玻璃，No.1.5H（170 μm，25 mm × 75 mm），非无菌玻璃载片Ibidi GmbH（慕尼黑，德国）10812
商用Lycopodium SECs（L型）Polysciences, Inc.（PA，美国）16867-1
加热板IKA，德国
扫描电子显微镜Jeol，日本 JFC-1600
元素分析仪 Elementar，德国VarioEL III
FlowCam：台式系统Fluid Imaging Technologies，美国FlowCamVS
共聚焦激光扫描显微镜Carl Zeiss，德国LSM710
冷冻干燥机Labconco，美国 
紫外分光光度计Boeco，德国S220

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