本方案/手稿描述了一种从石松（Lycopodium clavatum）孢子中制备孢粉素外壁胶囊（SECs）的简化流程，以及将亲水性化合物装载入这些SECs的方法。
本方案/手稿描述了一种从石松（Lycopodium clavatum）孢子中制备孢粉素外壁胶囊（SECs）的简化流程，以及将亲水性化合物装载入这些SECs的方法。
源自植物孢子或花粉的微胶囊为多种微胶囊化应用提供了坚固的平台。孢粉素外壁胶囊（SECs）是通过去除孢子或花粉内部的孢质内容物后获得的。所得的中空微胶囊表现出高度的微粒均匀性，并保留了与特定植物物种相关的复杂微观结构特征。本文中，我们展示了一种从Lycopodium clavatum孢子制备SECs并将其负载亲水性化合物的简化工艺。目前的SEC分离方法已近期优化，显著减少了传统SEC分离过程中所需的处理步骤，并确保获得完整的微胶囊。天然L. clavatum孢子首先用丙酮脱脂，再经磷酸处理，并经过充分洗涤以彻底去除孢质内容物。在丙酮脱脂后，仅需使用85%磷酸进行一次处理步骤即可完全去除孢质内容物。将酸处理时间控制在30小时以内，可成功分离出洁净的SECs，并避免因处理时间过长而导致的SEC破裂。通过大量用水、稀酸、稀碱和有机溶剂反复洗涤，确保所有孢质物质和化学残留物被充分清除。采用真空负载技术将一种模型蛋白（牛血清白蛋白）作为代表性亲水性化合物载入SECs中。真空负载提供了一种简单的方法，可在无需使用剧烈溶剂或不理想化学试剂的情况下负载多种化合物，而这些试剂通常在其他微胶囊化方案中是必需的。基于上述分离与负载方案，SECs作为一种有前景的材料，可广泛应用于治疗药物、食品、化妆品及个人护理产品等多种微胶囊化领域。
人们对从植物孢子和花粉中获取的天然植物基微胶囊在微胶囊化应用中的使用具有浓厚兴趣1-15。在自然界中，孢子和花粉可为敏感的遗传物质提供保护，使其免受恶劣环境条件的影响。植物孢子和花粉的基本结构通常包括外层壳壁（外壁）、内层壳壁（内壁）以及内部的细胞质物质。外壁由一种化学性质稳定的生物聚合物1,9,10,13,16构成，称为孢粉素；而内壁主要由纤维素类物质组成16-18。通过多种方法7,9可去除细胞质成分、蛋白质及内壁层，从而分离得到空心胶囊2,12,16。这些孢粉素外壁胶囊（SECs）因其粒径分布窄、形态均一，成为合成包封材料的一种极具吸引力的替代选择7,9,13,19,20。建立从不同植物物种（如Lycopodium clavatum）中获取SECs的标准化工艺，为药物递送、食品和化妆品等领域的广泛应用开辟了前景6,10-13,21
为了获得孢粉素外壁囊（SECs），研究人员首先使用有机溶剂处理孢子和花粉，并在碱性溶液中回流，以去除细胞质成分。22-25 然而，研究发现残留的囊状结构仍含有纤维素性质的内壁层。为了去除该内壁层，研究人员探索了使用盐酸、热硫酸或热磷酸进行长时间酸水解处理的方法，持续数天时间。22-25 其中，磷酸逐渐成为去除SEC内壁的首选方法。<....
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1. 从L. clavatum孢子中提取孢粉素外壁胶囊（SECs）
注意：SEC 提取过程涉及易燃粉末（L. clavatum）、高温腐蚀性酸和易燃溶剂，因此必须佩戴适当的个人防护装备（护目镜、面罩、手套、实验服），并由授权的实验室人员进行化学品使用的批准风险评估及妥善处置。
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孢粉素外壁胶囊的简化提取流程
L. clavatum 的孢粉素微胶囊（SEC）提取过程主要包括三个步骤：（1）使用丙酮进行脱脂；（2）使用85%（v/v）磷酸进行酸解；（3）使用溶剂进行多次SEC洗涤。简化的SEC提取流程如图1 A - I所示。简而言之，该过程首先使用丙酮回流处理6小时（50 °C），进行脱脂，随后将脱脂后的孢子在通风橱中过夜干燥，以去除残留的丙酮。脱脂后的孢子再经85%磷酸进行30小时的酸解处理。在酸解过程中，大部分孢原质成分被溶解，并在后续的真空抽滤步骤中被去除。为了彻底去除残留的孢原质成分，需依次使用溶剂、酸、碱和水进行一系列广泛的洗涤操作。最后，将获得的SEC在室温下初步干燥24小时，再于60 °C、1 mbar真空条件下进一步干燥10小时，以彻底去除残留的溶剂和水分。
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本研究系统分析了从L. clavatum孢子中提取SEC的方法，结果表明，在提高胶囊质量的同时，还可显著简化现有常用方案11。与现有方法需要高温（180 °C）和长时间处理（7天）相比11，本研究对SEC提取工艺的优化主要集中在降低酸解步骤的温度和缩短处理时间。
脱脂和碱处理对孢子中孢质材料的去除作用有限。然而，酸解处理从5小时延长至120小时，可最大程度地去除孢质材料。结果表明，与传统方法相比11，总处理时间和温度可显著降低，仅需在中等温度（70 °C）下使用磷酸处理30小时即可获得最优质量的胶囊。此外，当酸解时间超过30小时后，发现SECs开始出现断裂，颗粒碎片显著增加，提示整批SECs的整体结构完整性可能正在下降。另外需要注意的是，L. clavatum被认为含有相对坚固的孢粉素2，因此本方案中涉及的具体处理条件，如酸浓度、温度和/或水解时间，可能需要根据其他花粉种类进行相应调整。
研究表明，仅使用.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作由国家研究基金会（NRF-NRFF2011-01）和国家医学研究理事会（NMRC/CBRG/0005/2012）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Lycopodium clavatum 孢子（s型） | Sigma | 19108-500G-F | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2153-50G | |
| FITC标记的BSA | Sigma | A9771-250MG | |
| 磷酸（85% w/v） | Sigma | 438081-2.5L | |
| 盐酸 | Sigma | V800202 | |
| 氢氧化钠 | Sigma | S5881-1KG | |
| 丙酮 | Sigma | V800022 | |
| 乙醇 | AcME | C000356 | |
| 去离子水 | Millipore纯化水 | ||
| 定性滤纸（1号，棉质纤维素） | |||
| 聚苯乙烯微球（50 ± 1 µm） | Thermoscientific（CA，美国） | 4250A | |
| Vectashield | Vector labs（CA，美国） | H-1000 | |
| 粘附式载玻片，D 263 M Schott玻璃，No.1.5H（170 μm，25 mm × 75 mm），非无菌玻璃载片 | Ibidi GmbH（慕尼黑，德国） | 10812 | |
| 商用Lycopodium SECs（L型） | Polysciences, Inc.（PA，美国） | 16867-1 | |
| 加热板 | IKA，德国 | ||
| 扫描电子显微镜 | Jeol，日本 | JFC-1600 | |
| 元素分析仪 | Elementar，德国 | VarioEL III | |
| FlowCam：台式系统 | Fluid Imaging Technologies，美国 | FlowCamVS | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss，德国 | LSM710 | |
| 冷冻干燥机 | Labconco，美国 | ||
| 紫外分光光度计 | Boeco，德国 | S220 |
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