一种利用共聚焦显微镜和电子显微镜对丝状真菌菌落上细菌生物膜进行定性多尺度分析的新方法

摘要

本方案描述了一种在真菌菌丝上培养并利用共聚焦显微镜和电子显微镜对细菌生物膜进行定性分析的新方法。

摘要

细菌生物膜常在真菌表面形成，并可能参与多种细菌-真菌相互作用过程，例如代谢协作、竞争或捕食。生物膜的研究在环境科学、食品生产和医学等多个生物学领域中具有重要意义。然而，由于研究难度较大，目前针对此类细菌生物膜的研究仍较少。文献中描述的大多数用于定性和定量分析生物膜的方法，仅适用于在非生物表面或均一且较薄的生物表面（如单层上皮细胞）上形成的生物膜。

虽然激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）常用于分析 原位 和 体内 生物膜，当该技术应用于真菌菌丝上的细菌生物膜时，由于菌丝网络的厚度和三维结构，会变得极具挑战性。为克服这一局限，我们开发了一种将显微技术与限制真菌菌落中菌丝层累积的方法相结合的实验方案。利用该方法，我们能够在多个尺度上通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）和扫描电子显微镜（SEM）研究细菌生物膜在真菌菌丝上的发育过程。本报告详细描述了该实验方案，包括微生物培养、细菌生物膜形成条件、生物膜染色以及LSCM和SEM成像。

引言

真菌和细菌在大多数陆地环境中共同栖息，因此具有大量相互作用的机会。由于其多样性和广泛存在性，这些相互作用在生物技术、农业、食品加工和医学等多个生物学领域中具有重要意义^1,2分子相互作用需要一定程度的接近，以允许参与者之间的交换；在某些情况下，参与者之间必须发生物理结合才能实现功能性相互作用。³细菌与真菌之间一种常见的物理关联是在真菌表面形成细菌生物膜⁴细菌细胞与真菌菌丝之间的这种直接接触促进了密切的相互作用，这些相互作用参与了多种生物学过程。例如，在医学领域，对生物膜形成的研究所涉及的 铜绿假单胞菌 关于机会性真菌病原体 Candida albicans 可为生物膜形成与毒力之间的关联提供见解⁵在农业领域，研究表明，当植物促生根际细菌和生防细菌与真菌共同形成混合生物膜时，其作用效率显著提高。例如， Bradyrhizobium elkanii 已增强 N₂与……结合时的固定活性 平菇 在混合生物膜中⁶最后，在生物修复中，细菌-真菌混合生物膜已被用于污染场地的修复。^7,8.

激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）特别适用于生物膜的研究，因为它能够在最少预处理的情况下对活体水合生物膜进行三维观察，从而保持生物膜的结构与组织状态。因此，通过LSCM进行的生物膜分析具有很高的信息量，尤其适用于确定生物膜形成的动态过程以及检测从初始黏附到成熟生物膜发育过程中的各个特征阶段^9,10。该方法也特别适合用于观察生物膜的结构与基质^11,12，或定量分析生物膜的大小^13,14。尽管该技术适用于研究非生物表面或较薄生物表面的生物膜，但在丝状真菌菌落上研究细菌生物膜仍极具挑战性。事实上，大多数丝状真菌在培养过程中会形成厚实、复杂且具有三维结构的网络。即使共聚焦显微镜能够对较厚样本成像，激光穿透深度和荧光信号的衰减通常会导致超过50 µm深度后的图像质量显著下降¹⁵。此外，由于真菌菌落缺乏刚性，操作微生物时极易扰动其上的生物膜结构。由于样本厚度限制，目前对真菌菌丝上细菌生物膜的显微分析通常仅限于真菌菌落的一小部分区域，因而仅包含少量菌丝^16,17,18。这些因素限制了我们对真菌菌落上生物膜分布情况的全面描述，若生物膜在真菌菌落内部呈非均质分布，则可能引入分析偏差。

为克服上述困难，我们报道了一种在真菌菌丝上培养和分析细菌生物膜的方法。该方法已应用于研究荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens BBc6）在外生菌根担子菌亮白锁瑚菌（Laccaria bicolor S238N）菌丝上的生物膜形成过程。这两种森林土壤微生物此前已被描述可形成类似混合生物膜的结构^19,20。本方法可便捷地推广应用于其他丝状真菌-细菌体系。本文所述方法结合了一种可培养极薄真菌菌落的真菌培养技术，并辅以激光共聚焦显微镜（LSCM）和扫描电镜（SEM）成像。该组合使我们能够获得两种微生物相互作用的微米尺度（µm范围）和介观尺度（mm范围）图像，从而实现对生物膜的定性表征。我们还证明，样品可通过扫描电镜观察，从而在纳米尺度（nm范围）对生物膜结构进行分析。

方案

1. 细菌和真菌培养物的制备

1. 真菌培养物的制备
   1. 准备与培养皿直径相同的玻璃纸膜，将其在 EDTA（1 g/L 去离子水溶液）中煮沸 30 分钟。用去离子水冲洗膜片，并高压灭菌两次。
   2. 在含有经EDTA预处理的玻璃纸膜的适宜琼脂培养基上接种真菌琼脂块，制备真菌预培养物。在最适生长温度下培养，获得直径约1 cm的菌落。
      1. 对于 L. bicolor S238N，在Pachlewski P5琼脂培养基上于25 °C培养5天，培养基成分为0.5 g酒石酸二铵、1 g KH₂PO4，0.5 g MgSO₄₄.7H₂O，5 g D+麦芽糖，20 g D+葡萄糖，1 ml 10%盐酸硫胺素，1 ml 1/10稀释的微量元素溶液（6 g/L 硫酸亚铁；0.27 g/L 三氧化钼；8.45 g/L 硼酸；5 g/L 硫酸锰；5 g/L 硫酸铜；2.27 g/L 硫酸锌），用去离子水定容至1 L；以及20 g琼脂；pH 5.5。
   3. 从真菌预培养物中接种至新的琼脂平板，该平板覆盖有经EDTA预处理的玻璃纸膜，并含有低碳琼脂培养基，以促进菌落的辐射状扩展。
      1. 用解剖刀轻轻刮取预培养物中真菌菌落的外围区域（此处细胞生理状态一致），并将菌丝转移至新的琼脂平板以进行接种。
      2. 在最适生长温度下培养，直至新形成的菌落直径达到约1 cm。对于 L. bicolor S238N，在 P20 琼脂培养基（含 0.25 g 二NH）上于 25 °C 培养 5 天₄ 酒石酸盐；0.5 克 KH₂PO₄；0.25 g MgSO₄₄.7H₂O；1 g D+葡萄糖；0.5 ml 10%盐酸硫胺素；0.5 ml 1/10稀释的微量元素溶液（见1.1.2.1），用去离子水定容至1 L；20 g琼脂；pH 5.5.
         注意：由于在玻璃纸上的预培养，第二次培养的中央菌块中将不含琼脂培养基。应去除琼脂菌块以进行后续生物膜分析，因为这些菌块会引入琼脂和营养物质，可能导致分析结果出现偏差。此步骤仅适用于在琼脂平板上保存和传代的真菌物种，对于由孢子或冻存菌种传代的真菌则无需执行。
2. 细菌培养物的制备
   1. 使用无菌接种环从适当琼脂培养基上的培养物中挑取2至3个单菌落，接种于25 ml液体LB（Luria-Bertani）培养基（或根据所用菌株选择其他适当的培养基）中。对于 P. fluorescens BBc6，在28 °C下轻轻振荡（约150 rpm）培养过夜。
      注意：使用带有荧光蛋白（如GFP）标签的菌株更佳，因为这可避免在显微镜观察前进行真菌和细菌的双重染色。培养的时间、搅拌速度和温度取决于所用菌株，目标是获得处于对数生长后期的培养物。

2. 在真菌菌落上制备细菌的 N 体外 生物膜

1. 将细菌培养物在 5,000 × g 条件下离心 3 分钟，用 25 ml 无菌 0.1 M 磷酸钾缓冲液（25 g/L KH₂PO₄ 和 2.78 g/L K₂HPO₄，pH 5.8）重悬沉淀。重复此步骤一次，并用相同缓冲液将最终细菌浓度调整至 10⁹ 个细胞/ml。
2. 向 6 孔微孔板中每孔加入 5 ml 细菌悬液（阴性对照孔加入无菌 0.1 M 磷酸钾缓冲液）。
3. 用无菌剃须刀片切割真菌培养物上的玻璃纸膜，获得每片上含有单个真菌菌落的玻璃纸方块。用镊子小心地从固体培养基上取下带有菌丝的玻璃纸方块，并将其转移至含有细菌悬液的微孔板孔中。
4. 在真菌菌落仍附着于玻璃纸时，轻轻振荡微孔板；随后移除玻璃纸片，使真菌菌落留在板孔内。
5. 将微孔板在适宜所研究微生物的温度下，以轻度振荡（约 60 rpm）培养。
   注意：培养时间取决于生物膜形成的速率以及待分析的阶段。对于 P. fluorescens BBc6/L. bicolor，于 20 °C 培养 30 分钟可获得早期生物膜，培养长达 16 小时可获得成熟生物膜。

3. 生物膜形成的激光扫描共聚焦显微镜分析

1. 样品制备
   1. 为去除浮游细菌以及通过静电作用附着在菌丝上的细菌，将真菌转移至一个新的6孔板中，该孔板内含有5 ml高浓度盐溶液（NaCl，17 g/L）¹⁷，轻轻振荡1分钟。
   2. 将真菌转移至另一个含有5 ml无菌0.1 M磷酸钾缓冲液的6孔板中，轻轻振荡2分钟，随后将真菌转移至新鲜的磷酸钾缓冲液中。
   3. 在保持于磷酸钾缓冲液中的条件下，使用解剖刀切割出需要成像的真菌菌落部分，使所获得的片段包含约一半的菌落。
   4. 为对样品进行染色，将其转移至一个含有无菌水的培养皿中，水中加入适当的荧光染料（根据分析目的选择），并在避光条件下孵育。
      1. 为观察真菌网络结构，可选用例如刚果红（终浓度0.1%，孵育5分钟）、与Alexa Fluor 633偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）（终浓度10 µg/ml，孵育10分钟）或FUN1（终浓度10 µM，孵育10分钟）。
      2. 若使用未标记荧光的细菌，可选用多种市售的细胞通透性DNA染料中的一种特异性DNA荧光探针进行反染。例如使用DAPI（终浓度0.25 µg/ml，孵育10分钟）。
      3. 为观察基质蛋白，使用蛋白染色剂²¹。
   5. 染色完成后，将样品转移至含有10 ml无菌0.1 M磷酸钾缓冲液的培养皿盖中进行清洗，轻轻振荡1分钟。
   6. 将载玻片一半浸入培养皿盖中，小心地使切割后的样品漂浮于载玻片上方，然后缓慢将载玻片从缓冲液中取出，使样品轻柔地沉降在载玻片上。
      注意：此步骤操作必须轻柔，以避免生物膜结构受到扰动。
   7. 最后，在样品上加入10 μl抗荧光淬灭封片剂，并加盖盖玻片。
      注意：载玻片制备完成后，应尽快进行显微观察（最迟不超过30分钟），以防止生物膜结构发生改变。
2. 共聚焦显微镜分析
   1. 使用配备成像软件的共聚焦激光显微镜，以10X或40X物镜观察载玻片。
      注意：本实验中使用的仪器为多光束扫描共聚焦显微镜，配备405、488和561 nm激发激光器、GaAsp PMT检测器，以及10X 0.3 NA和40X 1.2 NA物镜。
      1. 根据所需数据类型和时间限制，设置合适的成像参数。根据所用染料及制造商建议选择相应的激光激发/发射波长。结合使用拼图扫描（tile scan）和Z轴层扫（Z-stack）功能，以获得真菌菌落及生物膜的整体三维图像。
         注意：图3中的图像采用以下参数获取：8位/像素，平均次数 = 2，像素驻留时间 = 1.58 µsec，5x5图像拼接扫描（在线拼接，重叠率10%，阈值 = 0.7）；Z轴步进 = 2 µm。
   2. 对于三维数据的可视化，可使用多种免费或商业软件（这些软件提供丰富的三维渲染选项）。
      1. 例如，为将Z轴层扫数据以二维最大强度投影方式显示，需去除明场通道，调整亮度与对比度，并合并各通道以生成复合图像。若存在信号缺失的Z轴端层切片，应予以剔除。随后进行二维最大强度投影，并将结果转换为RGB彩色图像。本研究中所示图像通过ImageJ软件中的"Z投影"功能实现二维最大强度投影²²。

4. 电子显微镜分析

1. 按照共聚焦激光扫描显微镜（LSCM）的操作步骤准备样品，但在第3.1.2步中，清洗后将生物膜转移至无菌水中，而非磷酸钾缓冲液。这可以避免在脱水过程中形成盐结晶，从而干扰扫描电镜成像。
2. 将生物膜转移至样品台，并去除多余水分；仅保留一层薄薄的水膜覆盖样品表面。
3. 将样品放入可变压力扫描电子显微镜（VP-SEM）的样品室中，在帕尔贴冷却台上将其冷冻至-50 °C，并在SEM样品室内以100 Pa的可变压力进行缓慢冷冻干燥，持续15小时。
4. 冷冻干燥完成后，取出样品并转移至高真空薄膜沉积系统中，在氩等离子体条件下（2.5 × 10^-2 mbar，35 mA）对样品表面镀上2 nm厚的铂层（石英测量）。
5. 使用配备场发射电子枪（FEG）的扫描电镜，结合高分辨率"镜内"探测器和1 kV的加速电压观察镀膜后的样品。

结果

真菌培养与生物膜制备的整体示意图如下所示 图1该培养方法使我们能够获得厚度为20至50 µm、包含数层菌丝的真菌菌落，从而可利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）对水合状态下的活体生物膜进行微观和介观尺度的分析。. 该方法的应用使得获取高质量的图像成为可能 P. fluorescens BBc6 生物膜 L. bicolor 生物膜形成过程中的菌丝图2-4).

生物膜的介观尺度分析表明，P. fluorescens BBc6 在 L. bicolor S238N 菌丝上的生物膜分布具有异质性（图 2 和 图 3）。介观尺度分析还实现了对生物膜形成过程的动态追踪（图 3），从初始阶段仅有少量细菌附着于菌丝（图 3a），到最终形成厚实且成熟的生物膜结构（图 3b）。介观尺度图像的高分辨率使我们能够在同一图像上进行微观尺度分析，从而获得菌落的精细结构（图 3c–d）。

结合特异性标记的微尺度分析使我们在生物膜表征方面更进一步。此处应用了可标记大多数蛋白质类别的SYPRO Ruby²³对样品进行染色（图4），结果显示细胞外基质中存在蛋白质。

最后，通过样品脱水和镀膜后进行扫描电镜成像，获得了生物膜结构的更多细节（图5）。扫描电镜成像可达到纳米级分辨率，从而能够观察到基质结构。

图1：真菌培养与生物膜制备的整体示意图。 本图描述了该方法的主要步骤，从微生物培养到样品分析。具体细节详见实验方案。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：BBc6生物膜在真菌菌落上的分布情况。 样品在相互作用18小时后以10倍放大倍数成像。该图像是通过三维共聚焦显微镜图像的二维最大强度投影获得。图中灰色网格表示马赛克成像位置。L. bicolor 菌丝用刚果红染色（红色），细菌则标记了GFP（绿色）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：L. bicolor 菌丝上 BBc6 生物膜形成的早期与晚期阶段。 该图像通过三维共聚焦显微镜图像的二维最大强度投影获得。成像在40倍放大倍数下进行。（a）相互作用2小时后的生物膜分布。（b）相互作用14小时后的生物膜分布。（c）（a）中白色矩形区域的放大图。（d）（b）中白色矩形区域的放大图。真菌菌丝用刚果红染色（红色），细菌则标记GFP（绿色）。请点击此处查看该图的高清版本。

图 4：BBc6 生物膜在 L. bicolor 菌丝上的基质染色。（a）相互作用 16 小时后的生物膜。（b）（a）中白色矩形区域的放大图。成像在 40 倍放大倍数下进行，图像通过三维共聚焦显微图像的二维最大强度投影获得。细菌用 GFP 标记（绿色），真菌用 Fun1 染色（深绿色），蛋白质用 S. Ruby 染色（红色）。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：BBc6在L. bicolor菌丝上形成的生物膜的扫描电镜成像。 扫描电镜成像条件为2360倍放大，EHT：1 kV。成像前，样品在电镜腔室内缓慢冷冻干燥，并镀上铂层。绿色箭头指示细菌生物膜，黄色箭头指示真菌菌丝。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

细菌生物膜存在于多种环境中，自20世纪50年代以来已被广泛研究，由此发展出多种分析方法²⁴。用于定量和监测生物膜的经典方法包括微量滴定板法，以及目前应用最广泛的结晶紫（CV）染色法。这些方法操作快速、成本低且易于处理²⁵，特别适用于定量总生物膜生物量，或进行活性及基质定量分析。另一方面，"组学"方法在生物膜研究中也具有重要价值，可实现对生物膜的定量和功能分析^26,27。尽管微量滴定板法和"组学"方法具有诸多优势，但这些技术仍无法捕捉生物膜的若干关键特征，从而限制了对这一过程的全面理解。这些特征包括基质结构、细菌菌落构型、细胞/细胞相互作用以及定植模式，而这些正是理解生物膜功能及其形成动态的关键数据。尽管显微镜技术具备捕捉上述特征的能力，但针对丝状真菌表面细菌生物膜的显微分析仍十分有限。这主要是由于丝状真菌的生长特性常形成厚实、复杂且具有三维网络结构的菌落。细菌在真菌表面形成生物膜的现象在多种环境中普遍存在，并在多个领域中具有重要意义⁴（例如，医学、农业和环境领域）；因此，开发新方法以促进此类研究至关重要。为此，我们结合了一种生成极薄真菌菌落的方法与细菌生物膜的显微成像技术。此外，我们还提出了一套用于定性分析这些生物膜的显微工具。该方法的成功关键在于能够制备出极薄的菌丝菌落，并选用合适的染料。以下将对此进行详细讨论。

由于生物膜结构复杂，理解其功能需要采用多尺度研究方法^28,29在不同尺度下分析生物膜的分布模式、细菌菌落结构以及基质的结构与组成即， 介观尺度和微观尺度）。此外，纳米级分辨率能够揭示细胞/细胞间的物理相互作用以及基质的纳米结构。因此，所建立的方法可便捷地实现对真菌菌落上形成的细菌生物膜进行多尺度分析。

在大多数研究中，对生物膜的激光共聚焦显微镜（LSCM）分析通常局限于微观尺度，而中观尺度的分析通常采用光学相干断层扫描技术^30,31,32。本文所介绍的方法能够利用新一代高分辨率激光共聚焦显微镜，实现对同一样品区域甚至同一图像同时进行微观和中观尺度的分析（图3）。因此，避免了使用不同方法在不同尺度下采集数据所带来的整合问题。

这一系列分析方法能够同时获取真菌菌落上生物膜的分布情况、细菌菌落沿发育中生物膜的空间结构以及胞外基质的结构。中尺度分析显示，细菌生物膜在真菌菌落上的分布呈异质性（图2 和 图3）。若仅采用只能对真菌菌落局部区域成像的实验方案，则无法获得此类观察结果，因为局部区域未必能代表整个菌落的实际情况。因此，尽管中尺度分析常被忽视，但它能够提供有关生物膜分布模式的重要信息。

最后，所开发的方法可用于结合不同的显微技术分析样品，包括扫描电子显微镜。此处采用扫描电子显微镜（SEM）以达到纳米级分辨率，并获取生物膜内细菌的空间分布信息。该方法在薄层真菌菌落上表现良好，但扫描电子显微镜仅能实现表面成像。与激光共聚焦显微镜（LSCM）不同，扫描电子显微镜需要对样品进行脱水处理，且大多数情况下还需镀上导电金属层。若脱水过程操作不当，可能会改变生物结构，因此该步骤可能需要优化。本研究中采用缓慢冷冻干燥法进行样品脱水³³。尽管如此，将激光共聚焦显微镜与扫描电子显微镜结合应用于同一样品，可在样品的相同位置实现关联显微成像。

尽管具有上述优点，该方法仍存在一些局限性。首先，它可能不适用于所有类型的真菌。事实上，该培养方法是针对在固体培养基表面呈放射状扩展的真菌而开发的。该方法可能不适用于主要形成气生菌丝的真菌例如，镰刀菌属（Fusarium sp.））或用于主要在琼脂内扩散的微需氧真菌时，也可能存在问题。此外，降解玻璃纸的真菌同样可能带来困难（例如., Trichoderma sp.). 其次，需要注意的是，染色策略至关重要，必须谨慎选择染色剂，因为染色剂不得干扰生物膜的结构。例如，我们观察到Calcofluor White会导致生物膜部分破坏（数据未显示），这可能是由于该染色剂的高pH值所致。此外，某些染料会产生不均匀的染色效果（例如，刚果红），而另一些则产生均一染色（例如，使用WGA凝集素进行细胞壁染色），导致图像质量不均一。此外，需要注意的是，某些染料可能并非完全特异。例如，WGA不仅可染色真菌细胞壁，还可染色革兰氏阳性菌细胞壁中的N-乙酰神经氨酸，以及革兰氏阳性菌和阴性菌在生物膜形成过程中产生的黏附素^34,35因此，建议使用荧光蛋白标记的细菌和/或真菌，以避免多重染色。若使用多种染料，需确保它们之间无化学干扰，且发射光谱不应重叠。

中尺度分析需要扫描较大的区域，因此使用激光共聚焦显微镜（LSCM）可能耗时较长（根据样品厚度不同，通常需要40分钟至1小时），从而成为大量样品分析的瓶颈。然而，可根据所需数据的类型进行相应调整。通过降低图像质量，可以缩短采集时间并减小图像尺寸。例如，在分析生物膜的整体分布时，无需高分辨率。

最后，在选择将Z轴层叠数据以二维或三维投影形式展示时，需要考虑一些局限性。二维投影是总结数据的有效方式，但会丢失深度信息，且重叠的结构会变得不可见。而三维投影虽然可以从不同视角进行可视化，但在空间结构复杂的情况下，通常渲染效果较差。

总之，我们报道了一种在结构水平上表征菌丝上细菌生物膜的方法。该方法可拓展应用于其他领域。事实上，此方法可用于对在真菌菌丝上形成的细菌生物膜进行功能或化学特性分析。由于存在多种现有的荧光报告系统，激光共聚焦显微镜（LSCM）分析可实现多种应用目的²⁹例如，荧光显微镜可用于监测pH梯度³⁶ 或生物膜中的分子扩散³⁷此外，该方法还可用于多物种生物膜中的群落分析。例如，荧光 原位 针对特定细菌群的杂交技术在研究多物种生物膜中特定细菌分布时尤为有用^38,39最后，可使用多种荧光染料来表征生物膜的基质组成。²¹此处使用Sypro染色剂对蛋白质进行靶向，该染色剂可染色多种蛋白质，包括基质蛋白（图4），但其他染料也可用于可视化其他重要的基质成分，如胞外多糖或细胞外DNA。有趣的是，所有这些分析均可利用所述方法在介观尺度上进行。由于激光共聚焦显微镜（LSCM）可在活体样品上实施，因此还可结合coverwell小室实现延时成像，尤其适用于较薄的真菌菌落。这一选项尤为值得关注，因为生物膜的形成是一个复杂且动态的过程。最后，从定量分析的角度来看，该方法可通过在介观尺度图像上实现自动定量分析，提高定量结果的准确性，从而克服生物膜异质性及统计学相关问题²⁹.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔 Falcon 组织培养板	Fisher Scientific	08-772-33	用于 2.2 &和 3.1
刚果红	Fisher Scientific	C580-25	用于 3.1.4.1
FUN 1 细胞染色剂	赛默飞世尔科技	F7030	用于 3.1.4.1
麦芽凝集素，Alexa Fluor 633 标记物	赛默飞世尔科技	W21404	用于 3.1.4.1
DAPI 溶液	赛默飞世尔科技	62248	用于 3.1.4.2
碘化丙啶	赛默飞世尔科技	P3566	用于 3.1.4.3
FilmTracer SYPRO Ruby 生物膜基质蛋白染色剂	赛默飞世尔科技	F10318	用于 3.1.4.4
Fluoromount-G 封片剂	Fisher Scientific	OB100-01	用于 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1	Zeiss		用于 3.2.1
ZEN 2.1 lite black 软件	蔡司		用于 3.2.1
高真空镀膜仪 Leica EM ACE600	Leica		应用于4个
GeminiSEM-FEG	Zeiss		用于 4