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方法文章

小鼠窦房结的高分辨率光学标测

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DOI：

10.3791/54773

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2016年12月2日

 , 
1Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

本文内容

摘要

本文介绍了一种以高空间和时间分辨率对小鼠右心房特别是窦房结的电活动进行光学标测的实验方案。

摘要

窦房结（SAN）功能障碍及其相关并发症是心脏疾病患者发病的重要原因。开发治疗这些患者的新药疗法依赖于对窦房结正常生理学及病理生理学的深入理解。在心脏起搏研究中，小鼠窦房结被广泛使用，因其便于对编码窦房结离子通道或钙处理蛋白的不同基因进行表达修饰。来自电生理学和组织学研究的新证据也证实了小鼠窦房结在结构和功能上具有代表性，并与包括人类在内的较大哺乳动物相似，例如存在从窦房结到心房的特化传导通路，以及窦房结内部复杂的起搏细胞层级结构。近年来，光学标测技术极大地促进了对小鼠窦房结内部及其起源的兴奋与传导机制的探索与研究，从而进一步加深了对窦房结的理解，并有助于与窦房结功能障碍相关疾病的临床治疗。在本论文中，我们详细描述了如何在完整、经Langendorff灌注的小鼠心脏以及分离的心房组织标本上进行窦房结光学标测。该实验方案是深入理解小鼠窦房结生理学与病理生理学的有力工具。

引言

导致人类生理学认知飞跃的新科学突破，往往以技术进步为先导。例如，荧光光学标测技术能够对细胞和组织中的多种生理参数进行研究1,2。该技术显著加深了我们对解剖结构与电生理功能及功能障碍之间关系的理解。在心脏中，天然起搏点和传导系统（如窦房结（SAN）和房室交界区）由结状心肌细胞构成，这些细胞被周围的心房肌细胞所隔离3-5。这种组织方式形成了具有特化电学特性的复杂三维结构。人们已认识到，这些起搏结构在结构和功能上的重构会形成显著的电生理异质性6,7。阐明此类异质性导致窦房结功能障碍和心房心律失常发生机制，将极大促进这些疾病的临床治疗。实现这一目标需要一种能够在组织水平上可视化电信号传播的技术，例如光学标测。

近年来，越来越多的证据表明，光学标测技术在心房电生理学和病理学研究中取得了显著进展2。然而，新颖且严谨的研究依赖于对实验数据的准确解读，而数据的有效性和稳定性则取决于精细的实验方案。转基因小鼠被广泛用作人类疾病（包括病态窦房结综合征、起搏异常和心房心律失常）的动物模型6,8-11。因此，将荧光光学标测技术与转基因小鼠模型相结合，为研究多种病理状态下相关的心脏电活动异常提供了强有力的工具。本文中，我们介绍了一种用于小鼠窦房结（SAN）和心房高分辨率光学标测的实验方案。具体而言，我们讨论并比较了不同的染料负载方法、染料漂白的时间效应以及实验过程中心率的稳定性。

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方案

所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 80-23）进行。本研究中使用的所有方法和方案均已由威斯康星大学实验动物护理与使用方案委员会批准，符合美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》（出版物编号 85-23，1996 年修订版）的要求。本研究中所使用的动物均按照《实验动物护理和使用指南》的规定接受了人道护理。

1. 心脏摘除与朗格多夫灌注

  1. 在心脏分离前，使用水浴和水夹套将Tyrode溶液预热至37 °C。
  2. 用5%异氟烷/95% O2麻醉小鼠。
  3. 通过检查痛觉反射是否消失，确认麻醉程度适当。
  4. 进行开胸术。使用5.5"弯头Mayo剪刀和5.5" Kelly止血钳，在胸廓前部做1 cm切口。
    1. 迅速将心脏从胸腔中取出（30秒内）。使用4"弯头Iris镊夹住肺组织，用4.3" Iris剪刀将肺、胸腺和带心包的心脏一起剪下。切勿直接夹取心脏。
    2. 在充氧（95% O2 / 5% CO2）、恒温（36.8 ± 0.4°C）的改良Tyrode溶液中清洗心脏。使用以下成分的溶液（单位为mM）：128.2 NaCl、4.7 KCl、1.19 NaH2PO4、1.05 MgCl2、1.3 CaCl2、20.0 NaHCO3 和 11.1 葡萄糖（pH 7.35 ± 0.05）。
  5. 在相同溶液中浸泡的同时，辨认肺、胸腺和脂肪组织，小心将其从心脏上分离。使用3"弯头Vannas-Tubingen剪刀和4.3" #5镊子。
  6. 然后辨认主动脉，并将其套入自制的21 G套管上。使用两把4.3"弯头#5B镊子。
  7. 插管后，在整个实验过程中，同时进行灌流（通过套管以约5 ml/min的流速灌注；应根据主动脉压力调整流速，见下文）和上灌流（浴槽中以约50 ml/min的流速）。灌注液需经预热和过滤的Tyrode溶液，并通过串联的11 µm尼龙滤器，以防止冠状循环堵塞。
  8. 通过连接至灌注管路的三通旋塞鲁尔接头的压力传感器（或压力计）监测主动脉压力，并将其维持在60至80 mmHg之间。必要时调整灌注速度，以保持主动脉压力在此范围内。

2. 来自Langendorff灌注完整心脏的窦房结光学标测

  1. 仪器设置
    1. 将心脏水平放置，并使用直径为 0.1 mm 的针将心室心尖固定在灌流腔硅胶涂层的底部，以防止实验过程中因液体流动引起的心脏移动。12
    2. 通过肺静脉、左心房（LA）和二尖瓣（MV）将一根细小的硅胶管（内径 0.012" × 壁厚 0.005"）插入左心室（LV），并用丝线（4-0）将该管固定于探查用结缔组织上。
    3. 将心脏后侧朝上放置（图1A，左侧面板）。
    4. 使用直径为 0.1 mm 的微量固定针将右心耳（RAA）边缘固定在灌流腔的硅胶底部。调整其高度，使右心房后表面保持平坦，并位于相机的焦平面上，以便从心房最大表面积区域进行光学测量。
    5. 用丝线（4-0）分别结扎上腔静脉（SVC）和下腔静脉（IVC），拉紧后将线的另一端固定在硅胶涂层腔室的底部（见图3A）。确保缝线不会遮挡光学观察视野。
    6. 将定制的起搏电极放置在右心耳（RAA）边缘。制备电极时，使用直径为 0.25 mm、表面涂覆硅胶的银丝，电极间距为 0.5 mm，起搏端裸露 1 mm 长度去硅胶部分。然后将两个 12 mm 长的 ECG 单极针电极（29 号针头）分别置于右心室和左心室基底部附近，并将接地 ECG 电极置于心室心尖附近。
  2. 染色
    1. 由于荧光染料和电-机械解偶联剂blebbistatin均对光敏感，因此所有以下操作均需在暗室中进行。首先配制电压敏感性染料 RH-237 或 di-4-ANNEPS 的储备液：1.25 mg/ml 溶于二甲基亚砜（DMSO，终浓度 2.5 mM），分装（每份 30 µl），并于 -20 °C 保存。
    2. 取 5–10 µl 染料储备液，加入 1 ml 预热至 37 °C 的Tyrode溶液中稀释，然后通过在线Luer注射口在 5–7 分钟内将其注入冠状动脉灌流管路中。
    3. 提前配制blebbistatin储备液（2 mg/ml 溶于二甲基亚砜，终浓度 6.8 mM），并于 4°C 保存备用。
    4. 在心脏稳定灌流 20 分钟后，向灌流液中加入 0.5 ml 预热至 37 °C 的blebbistatin溶液，并将 0.1 ml blebbistatin加入 1 ml 预热至 37 °C 的Tyrode溶液中稀释，随后通过在线Luer注射口在 5–7 分钟内注入冠状动脉灌流管路中。

3. 从离体心房标本对窦房结进行光学标测

  1. 仪器设备
    1. 对于离体心房制备，按照上述1.1-1.5步骤所述方法分离并插管心脏，用于全心制备。
    2. 从心室前侧解剖去除心室组织。详见图1A，右侧面板，切口#1。
    3. 沿三尖瓣-上腔静脉轴（TV-SVC轴）切开三尖瓣（TV），打开右心房（RA）。详见图1A，右侧面板，切口#2。
    4. 切开界嵴的内侧支以打开右心耳（RAA）。详见图1A，右侧面板，切口#3。
    5. 从切口#3中点向RAA右下角边缘进行切开，打开前侧心房游离壁，展平后用针固定在硅胶涂层培养皿底部。详见图1A中空心箭头所示方向，切口#4。保留一圈心室组织用于固定制备物，防止损伤心房。
    6. 类似地，沿二尖瓣（MV）至左心耳（LAA）上角的方向切开二尖瓣，打开左心房（LA）。
    7. 为打开LAA，从已切开的LAA中部开始，穿过前侧心房游离壁，直至接近LAA中段边缘处。
    8. 沿相同方向切开前侧心房游离壁，然后展平并固定于Sylgard涂层培养皿底部。
    9. 部分去除房间隔组织。此举可减少非聚焦区域组织对光学信号的散射。因此，在该制备中可同时观察到LA和RA，以及窦房结（SAN）和房室交界区（AVJ）（图1B）。
    10. 将最终制备物从硅胶涂层培养皿底部抬高约0.5 mm，以便对心外膜和心内膜表面均进行灌流。
    11. 以恒定流速用预热（37 °C）的Tyrode溶液对制备物进行表面灌流：聚焦灌流时流速约为12 ml/min（位于上腔静脉附近），浴槽式灌流时约为30 ml/min。
    12. 将自制的Ag/AgCl2刺激电极（直径0.25 mm）放置在解剖后的RAA边缘。然后将两个ECG 12 mm针状电极（29G，单极）分别置于RAA和LAA附近。接地ECG电极置于AVJ附近。
  2. 染色
    1. 直接应用电压敏感性染料（RH-237或di-4-ANNEPS）。具体操作：将1–2 µl染料储备液溶于1 mm预热（37 °C）的Tyrode溶液中，使用1 mm移液器缓慢将稀释后的染料释放至制备物表面。
    2. 或者，可通过Langendorff灌注心脏的冠状动脉进行心房染色，方法同前述全心制备（步骤2.2.1–2.2.2）。
      1. 冠状动脉灌注染色后，按上述方法分离心房制备。必要时可追加表面染色以达到满意的荧光强度。快速的心房分离不会导致染料褪色，也不影响染色质量。
    3. 使用机械-电去耦联剂blebbistatin固定制备物。将3–5 µl blebbistatin储备液加入预热（37 °C）的Tyrode溶液中，缓慢将其滴加至制备物表面及周围溶液中。由于blebbistatin具有光敏感性13,14，在制备和染色过程中应避免长时间光照。
    4. 根据需要多次追加blebbistatin以充分抑制收缩。通常最多可追加3次（每次3–5 µl），足以有效抑制运动伪影，从而准确重建窦房结和心房的激活过程。
    5. 在灌流液中额外加入0.5 ml预热的blebbistatin。此过程中暂停表面灌流30秒，以使染料/blebbistatin充分染色心房组织。

4. 光学图谱实验设置

注意：光学图谱系统的详细描述见其他文献。12

  1. 使用时间分辨率为每秒2,000帧或更高的相机，以及一系列聚光镜，以达到空间分辨率100 µm/像素或更高。这是重建窦房结激活和结内传导所必需的。
  2. 为减少溶液振动引起的运动伪影，在心脏或离体心房标本上方的溶液表面固定一小块盖玻片。
  3. 使用由恒流、低噪声卤素灯提供的激发光（波长520 ± 45 nm），并通过柔性分叉光导将滤光后的光束引导至标本上。
  4. 采用长通滤光片（>715 nm）过滤发射的荧光信号，利用相机制造商提供的软件在计算机上采集、数字化并保存所获得的荧光信号。

5. 数据处理

注意：光学标测数据以一系列在不同时间点采集的荧光强度矩阵形式收集和存储。每个像素代表在特定时间点从组织制备的特定位置采集的荧光强度测量值。系统会针对每个像素自动去除背景荧光，以更清晰地显示由膜电位变化引起的荧光信号变化，并将信号反转，使其与微电极系统测得的动作电位（APs）相对应。有关光学成像数据处理各个步骤的详细信息，包括图像分割、空间滤波、时间滤波和基线漂移校正，已在相关专题综述中提供。15

  1. 手动或使用特定算法（例如，阈值分割或边缘检测）15 为确定组织边界，创建一个二值掩膜，其中1代表包含的像素，0代表排除的像素，并将该掩膜应用于序列中的每一帧。此过程生成一幅二值图像，突出显示后续处理所需的感兴趣区域。
  2. 为了提高光学数据的信噪比，对选定的兴趣区域内的信号进行滤波。为此，使用空间（即 根据所需的卷积窗口或核（例如 3 × 3，或对噪声较大的数据采用 5 × 5）对相邻荧光像素进行平均，和/或时间滤波（例如 Butterworth、Chebyshev I 型、Chebyshev II 型、椭圆滤波） 等等。) (图2注意在数据分析时可能存在滤膜引入的假象。更多细节请参见相关综述。15
  3. 根据需要去除光学记录中基线的漂移（通过使用高通滤波或对原始信号进行多项式拟合），然后将每个像素的信号归一化至0（最小荧光）到1（最大荧光）。
  4. 选择一个时间窗口，以涵盖单次动作电位传播过程中所有像素的激活时间。将每个像素的激活时间定义为荧光信号上升支最大导数（dF/dt）对应的时间点。最大值，其中 F 为荧光强度）。利用所有像素的激活时间，重建等时激活图。每条等时线将显示同时被激活的像素。
  5. 为了重建动作电位时程（APD）分布图，对每个像素计算从激活时刻到特定复极化水平时刻之间的持续时间（例如，在80%复极化水平时，记为APD80）80). 利用所有像素的APD值，重建APD分布的等时图。每个等时线将显示具有相同APD的像素。
  6. 为计算动作电位传播的传导速度，需将标本表面拟合至5.4步骤中计算得到的激活时间数据。可采用多项式曲面拟合或局部核函数曲面平滑法，随后根据拟合曲面的梯度计算局部传导速度矢量。
  7. 为了生成复极化图，为每个像素分配其复极化时间，该时间定义为动作电位第二导数（d²V/dt²）最大值对应的时刻。2F/dt2OAP末端光学信号的幅度，或90%复极化时间。

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结果

完整窦房结在离体灌注心脏中的光学标测
显示了为自发性窦性心律重建的典型RA激活等时线图 图3 对于经Langendorff灌注的小鼠心脏，早期激活点位于上腔静脉附近解剖学上定义的窦房结所在的下腔静脉间区域。3,16 在1.0和0.5毫秒采样率下获取的两张RA激活等高线图如图所示 图3B.

为评估窦房结功能，我们测量了窦房结恢复时间（SANRT）。9 在以10-12 Hz频率进行至少1分钟的右心耳起搏后，停止电刺激，窦房结恢复时间（SANRT）定义为最后一个被捕获的动作电位与第一个自发动作电位之间的时间间隔图3C）。SANRT 校正至心率（即 SANRTc通过计算窦房结恢复时间（SANRT）与基础周期长度之间的差值来确定。此外，还...

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讨论

本文介绍了两种小鼠窦房结（SAN）制备方法：1）在Langendorff灌流的完整心脏中的完整窦房结；2）在分离并打开心房的制备标本中的窦房结。这两种制备方法适用于不同的实验目的。在Langendorff灌流的完整心脏制备中，心房的完整结构得以保留，因此可用于研究心房颤动等复杂的心房心律失常，以及在折返性心动过速期间窦房结与心房之间的相互作用6。相比之下，在分离的心房制备中，心房被打开并展平为一种伪二维结构，导致原有的三维解剖束结构受到破坏。这可能影响折返通路的解剖路径，因此分离的心房制备不适合用于研究心房心律失常的发生机制。然而，利用这种制备方法，可以精确地可视化并详细研究主导起搏位点的位置、结内传导以及动作电位的传播模式。此外，完整心房的观察受限于其后侧视野，而在分离的制备标本中，整个心房表面均可用于光学标测。

此外，分离的心房制备可通过解析心房小梁网络的复杂显微结构，实现心房的结构-功能定位映射，如 图4为此，应采用高空间分辨率（100 µm/像素或更高）和高时间分辨率（2,000 fps 或更高），因为精确区分心房和窦...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究得到了威斯康星大学麦迪逊分校医学院启动资金（A.V.G.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
水浴夹套Radnoti1660 系列大组织或单细胞分离用组织浴槽
水浴/循环器Fisher Scientific1016S
压力放大器AD InstrumentsMLT0670
EMD Millipore 尼龙网滤膜Fisher ScientificNY1102500
压力传感器AD InstrumentsMLT0670
不锈钢显微针 - 直径 0.1 mmFine Science Tools26002-10 
灌注泵World Precision InstrumentsPERIPRO-4LS
superfusion 泵World Precision InstrumentsPERIPRO-4HS
Vannas Tubingen 剪刀 World Precision Instruments503379
Dumont 镊子World Precision Instruments501201, 500085
Mayo 剪刀World Precision Instruments501750
Kelly 止血钳World Precision Instruments501241
虹膜镊World Precision Instruments15917
虹膜剪World Precision Instruments501263
ECG 12 mm 针式电极（29 号，单极） AD InstrumentsMLA1203
管路内鲁尔注射接口Ibidi10820
Ultima-L CMOS 相机 SciMediaMiCAM-05 
卤素灯Moritex USA IncMHAB-150W
NaClFisher ScientificS271-1
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500
KClFisher ScientificS217-500
MgCl2 (6H2O)Fisher ScientificM33-500
NaH2PO4 (H2O)Fisher ScientificS369-500
NaHCO3Fisher ScientificS233-3
D-葡萄糖Fisher ScientificD16-1
BlebbistatinTocris Bioscience1760
RH237ThermoFisher ScientificS1109
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2650

参考文献

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