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小鼠窦房结的高分辨率光学标测

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DOI：

10.3791/54773

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2016年12月2日

 , 
1Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

本文内容

摘要

本文介绍了一种以高空间和时间分辨率对小鼠右心房特别是窦房结的电活动进行光学标测的实验方案。

摘要

窦房结（SAN）功能障碍及其相关并发症是心脏疾病患者发病的重要原因。开发治疗这些患者的新药疗法依赖于对窦房结正常生理学及病理生理学的深入理解。在心脏起搏研究中，小鼠窦房结被广泛使用，因其便于对编码窦房结离子通道或钙处理蛋白的不同基因进行表达修饰。来自电生理学和组织学研究的新证据也证实了小鼠窦房结在结构和功能上具有代表性，并与包括人类在内的较大哺乳动物相似，例如存在从窦房结到心房的特化传导通路，以及窦房结内部复杂的起搏细胞层级结构。近年来，光学标测技术极大地促进了对小鼠窦房结内部及其起源的兴奋与传导机制的探索与研究，从而进一步加深了对窦房结的理解，并有助于与窦房结功能障碍相关疾病的临床治疗。在本论文中，我们详细描述了如何在完整、经Langendorff灌注的小鼠心脏以及分离的心房组织标本上进行窦房结光学标测。该实验方案是深入理解小鼠窦房结生理学与病理生理学的有力工具。

引言

导致人类生理学认知飞跃的新科学突破，往往以技术进步为先导。例如，荧光光学标测技术能够对细胞和组织中的多种生理参数进行研究1,2。该技术显著加深了我们对解剖结构与电生理功能及功能障碍之间关系的理解。在心脏中，天然起搏点和传导系统（如窦房结（SAN）和房室交界区）由结状心肌细胞构成，这些细胞被周围的心房肌细胞所隔离3-5。这种组织方式形成了具有特化电学特性的复杂三维结构。人们已认识到，这些起搏结构在结构和功能上的重构会形成显著的电生理异质性6,7。阐明此类异质性导致窦房结功能障碍和心房心律失常发生机制，将极大促进这些疾病的临床治疗。实现这一目标需要一种能够在组织水平上可视化电信号传播的技术，例如光学标测。

近年来，越来越多的证据表明，光学标测技术在心房电生理学和病理学研究中取得了显著进展2。然而，新颖且严谨的研究依赖于对实验数据的准确解读，而数据的有效性和稳定性则取决于精细的实验方案。转基因小鼠被广泛用作人类疾病（包括病态窦房结综合征、起搏异常和心房心律失常）的动物模型6,8-11。因此，将荧光光学标测技术与转基因小鼠模型相结合，为研究多种病理状态下相关的心脏电活动异常提供了强有力的工具。本文中，我们介绍了一种用于小鼠窦房结（SAN）和心房高分辨率光学标测的实验方案。具体而言，我们讨论并比较了不同的染料负载方法、染料漂白的时间效应以及实验过程中心率的稳定性。

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方案

所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 80-23）进行。本研究中使用的所有方法和方案均已由威斯康星大学实验动物护理与使用方案委员会批准，符合美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》（出版物编号 85-23，1996 年修订版）的要求。本研究中所使用的动物均按照《实验动物护理和使用指南》的规定接受了人道护理。

1. 心脏摘除与朗格多夫灌注

  1. 在心脏分离前，使用水浴和水夹套将Tyrode溶液预热至37 °C。
  2. 用5%异氟烷/95% O2麻醉小鼠。
  3. 通过检查痛觉反射是否消失，确认麻醉程度适当。
  4. 进行开胸术。使用5.5"弯头Mayo剪刀和5.5" Kelly止血钳，在胸廓前部做1 cm切口。
    1. 迅速将心脏从胸腔中取出（30秒内）。使用4"弯头Iris镊夹住肺组织，用4.3" Iris剪刀将肺、胸腺和带心包的心脏一起剪下。切勿直接夹取心脏。
    2. 在充氧（95% O2 / 5% CO2）、恒温（36.8 ± 0.4°C）的改良Tyrode溶液中清洗心脏。使用以下成分的溶液（单位为mM）：128.2 NaCl、4.7 KCl、1.19 NaH2PO4、1.05 MgCl2、1.3 CaCl....

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结果

完整窦房结在离体灌注心脏中的光学标测
显示了为自发性窦性心律重建的典型RA激活等时线图 图3 对于经Langendorff灌注的小鼠心脏，早期激活点位于上腔静脉附近解剖学上定义的窦房结所在的下腔静脉间区域。3,16 在1.0和0.5毫秒采样率下获取的两张RA激活等高线图如图所示 图3B.

为评估窦房结功能，我们测量了窦房结恢复时间（SANRT）。9 在以10-12 Hz频率进行至少1分钟的右心耳起搏后，停止电刺激，窦房结恢复时间（SANRT）定义为最后一个被捕获的动作电位与第一个自发动作电位之间的时间间隔图3C）。SANRT 校正至心率（即 SANRTc通过计算窦房结恢复时间（SANRT）与基础周期长度之间的差值来确定。此外，还.......

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讨论

本文介绍了两种小鼠窦房结（SAN）制备方法：1）在Langendorff灌流的完整心脏中的完整窦房结；2）在分离并打开心房的制备标本中的窦房结。这两种制备方法适用于不同的实验目的。在Langendorff灌流的完整心脏制备中，心房的完整结构得以保留，因此可用于研究心房颤动等复杂的心房心律失常，以及在折返性心动过速期间窦房结与心房之间的相互作用6。相比之下，在分离的心房制备中，心房被打开并展平为一种伪二维结构，导致原有的三维解剖束结构受到破坏。这可能影响折返通路的解剖路径，因此分离的心房制备不适合用于研究心房心律失常的发生机制。然而，利用这种制备方法，可以精确地可视化并详细研究主导起搏位点的位置、结内传导以及动作电位的传播模式。此外，完整心房的观察受限于其后侧视野，而在分离的制备标本中，整个心房表面均可用于光学标测。

此外，分离的心房制备可通过解析心房小梁网络的复杂显微结构，实现心房的结构-功能定位映射，如 图4为此，应采用高空间分辨率（100 µm/像素或更高）和高时间分辨率（2,000 fps 或更高），因为精确区分心房和窦.......

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究得到了威斯康星大学麦迪逊分校医学院启动资金（A.V.G.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
水浴夹套Radnoti1660 系列大组织或单细胞分离用组织浴槽
水浴/循环器Fisher Scientific1016S
压力放大器AD InstrumentsMLT0670
EMD Millipore 尼龙网滤膜Fisher ScientificNY1102500
压力传感器AD InstrumentsMLT0670
不锈钢显微针 - 直径 0.1 mmFine Science Tools26002-10 
灌注泵World Precision InstrumentsPERIPRO-4LS
superfusion 泵World Precision InstrumentsPERIPRO-4HS
Vannas Tubingen 剪刀 World Precision Instruments503379
Dumont 镊子World Precision Instruments501201, 500085
Mayo 剪刀World Precision Instruments501750
Kelly 止血钳World Precision Instruments501241
虹膜镊World Precision Instruments15917
虹膜剪World Precision Instruments501263
ECG 12 mm 针式电极（29 号，单极） AD InstrumentsMLA1203
管路内鲁尔注射接口Ibidi10820
Ultima-L CMOS 相机 SciMediaMiCAM-05 
卤素灯Moritex USA IncMHAB-150W
NaClFisher ScientificS271-1
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500
KClFisher ScientificS217-500
MgCl2 (6H2O)Fisher ScientificM33-500
NaH2PO4 (H2O)Fisher ScientificS369-500
NaHCO3Fisher ScientificS233-3
D-葡萄糖Fisher ScientificD16-1
BlebbistatinTocris Bioscience1760
RH237ThermoFisher ScientificS1109
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2650

参考文献

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110 (4), 609-623 (2012).
  3. Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R.

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重印与许可

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