方法文章

通过干涉光激活定位显微镜（iPALM）对F-actin丝进行三维超分辨率成像

DOI：

10.3791/54774

⸱

2016年12月1日

 , 
1Department of Biology, South University of Science and Technology of China, Shenzhen, 2Mechanobiology Institute, Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore

本文内容

摘要

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本文介绍了一种干涉光激活定位显微镜（iPALM）的技术方案，该方法是一种基于单分子定位的三维超分辨率显微成像技术，用于贴壁哺乳动物细胞中肌动蛋白细胞骨架的成像。该技术能够通过光学手段实现纳米尺度结构特征的可视化，而这些结构在传统受衍射极限限制的光学显微镜下无法分辨。

摘要

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荧光显微镜能够直接观察细胞内特定的生物分子。然而，传统的荧光显微镜受衍射限制，其成像平面内的空间分辨率约为 200 nm，沿光轴方向则低于 > 500 nm。因此，长期以来荧光显微镜在观察细胞内超微结构特征方面受到严重限制。近年来发展的超分辨率显微技术已克服了这一限制。特别是光可切换荧光染料的出现，使得基于定位的超分辨率显微成像成为可能，其分辨能力接近分子尺度。本文介绍了基于单分子定位显微术和多相干涉测量法的一种三维超分辨率显微技术，即干涉式光激活定位显微术（iPALM）。该方法在三个维度上均能实现约 20 nm 的近各向同性分辨率。文中描述了用于观察丝状肌动蛋白细胞骨架的实验方案，包括样品制备和 iPALM 仪器操作步骤。这些方案也可方便地调整和应用于细胞中其他超微结构特征的研究。

引言

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复杂细胞结构的可视化长期以来一直是生物学认知与发现的重要组成部分。尽管荧光显微镜能够以高分子特异性对细胞进行成像，但其分辨率受衍射限制，在成像平面（x、y 或横向维度）约为 200 nm，沿光轴方向（z 或轴向维度）则小于> 500 nm1,2。因此，超微结构特征的观察在历史上仅限于电子显微镜（EM）。幸运的是，近年来超分辨率显微技术的发展突破了这一限制，实现了 10 - 100 nm 范围的空间分辨率1-6。特别是基于单分子定位的超分辨率方法，其缩写包括 PALM（光激活定位显微镜）4、FPALM（荧光光激活定位显微镜）5、(d)STORM（直接随机光学重建显微镜）6,7、PAINT（用于成像纳米级形貌的点累积技术）8、GSDIM（基态耗尽显微镜后接单分子返回）9 和 SMACM（单分子主动控制显微镜）10，以及它们的三维（3D）实现形式，如干涉 PALM（iPALM）11 或 3D-STORM12，在揭示多种生物结构的纳米级组织方面提供了重要的新见解，包括神经元轴突和突触13、黏着斑14,15、细胞间连接16、核孔17 和中心体18-20 等。

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方案

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1. 成像样本制备

  1. 由于背景荧光信号会干扰荧光标记物的荧光信号，首先用去离子水（ddH2O）冲洗盖玻片，然后使用压缩空气吹干。随后在等离子清洗机中进行等离子刻蚀处理15秒，必要时可延长处理时间。
  2. 为实现漂移校正和iPALM校准，请使用嵌有荧光纳米颗粒的#1.5圆形（直径22 mm）预清洁盖玻片作为定位标记，这些荧光纳米颗粒可作为高度光稳定的参照标记，用于可靠的校准和漂移校正。由于需要较长的采集时间以积累足够的荧光分子密度（> 15–30分钟），样品漂移不可避免。
  3. 将每片带标记的盖玻片放入6孔组织培养板中，在超净工作台中用紫外线（UV）照射15分钟进行灭菌。
  4. 在无菌超净工作台中，通过将1 mg/ml的纤连蛋白储备液用无菌的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释至终浓度为2–10 µg/ml，制备用于包被盖玻片的纤连蛋白溶液。每片盖玻片用DPBS冲洗三次，加入2 ml纤连蛋白溶液，于4 °C孵育过夜。随后吸除纤连蛋白溶液，并用DPBS冲洗一次。
  5. 用DPBS短暂冲洗细胞。加入1–2 ml胰蛋白酶，在37 °C孵育数分钟，直至细胞脱落，然后加入约10 ml含新鲜血清的细胞培养基终止反应。例如，对于人脐静脉内皮细胞（HUVEC），使用添加了大血管内皮因子以及青霉素或链霉素的大血管内皮细胞培养基。
    1. 将细胞重新接种至纤连蛋白包被的盖玻片上（若需低密度接种，每片盖玻片接种< 50,000个....

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结果

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iPALM 的关键要求包括光学系统的对准、配准和校准。这些步骤对于确保三路分束器内实现适当的干涉至关重要，而这种干涉是提取 z 坐标所必需的。为了实现持续监测，需要稳定的荧光点光源。这可以通过使用荧光金（Au）或双金属纳米颗粒来实现23，其光致发光来源于局域表面等离子体共振（LSPR）。这些纳米颗粒在激发下表现为稳定的单偶极子，通常可实现 5 - 10 nm 的定位精度。这些 commercially available 纳米颗粒的发光亮度处于大多数单分子荧光染料的范围内，因此荧光染料和定位标记物均可在 EMCCD 相机上使用相似的激发强度和增益设置进行成像，而不会发生饱和（图 1B）。此外，这些定位标记物还有助于精确聚焦，因为在调整焦距时可以监测标记物表观宽度的变化。同时，还必须对盖玻片表面进行严格清洗，例如通过 Piranha 蚀刻或等离子清洗，因为未清洗或清洗不充分的盖玻片可能产生杂散背景荧光，从而轻易掩盖单分子信号，如前所述。

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讨论

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iPALM 的光学系统基于一种 4-π 双对置物镜设计，如图 1A所示。该装置由定制加工和商用的光学机械部件构成，具体如前文所述23，并列于表 1中。除本装置外，霍华德·休斯医学研究所（HHMI）在珍利亚研究园区的先进成像中心也设有可供科学界使用的系统。如需完整的机械图纸、控制示意图和软件，建议读者向 HHMI 的哈拉尔德·黑斯（Harald Hess）进一步咨询。使用 iPALM 及其他单分子定位显微技术对 F-肌动蛋白进行成像的一个主要优势在于，与电子显微镜（EM）技术相比，样品制备相对简便；EM 技术通常需要剧烈的样品处理、繁琐的制备流程以及经验丰富的操作人员3,23。此外，荧光天然适用于多通道成像，而这一点在 EM 中仍难以实现。然而，如下文将进一步阐述的，该方法在样品制备和成像过程方面仍存在若干当前局限性。首先，与 EM 样品制备类似，必须注意确保样品超微结构的良好保存35，因为适用于衍射极限分辨率水平的实验方案可能在纳米尺度上引起严重扰动。对于肌动蛋白成像而言，细胞的适当固定是影响样品质量的重.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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YW 和 PK 感谢新加坡国家研究基金会为 PK 提供的资金支持（NRF-NRFF-2011-04 和 NRF2012NRF-CRP001-084）。我们还感谢 MBI 开放实验室和显微镜核心设施在基础设施方面提供的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
光学平台Newport, CARS4000iPALM，安装在4个Newport Stabilizer减振器上
光学平台用减振器Newport, CAS-2000
642 nm激光器Newport, CA1185055输出功率=100 mW
561 nm激光器Newport, CA1168931输出功率=200 mW
488 nm激光器Newport, CA1137970输出功率=200 mW
405 nm激光器Newport, CA1142279输出功率=100 mW
宽带介质镜Thorlabs, NJBB1-E02激光合束器
二向色分光镜Semrock, NYLM01-427-25
声光可调滤波器AA Opto-Electronic, FranceAOTFnC-VIS-TN
线性偏振片Newport, CA05LP-VIS-B
基板本地车间定制
转向镜（22.5°）Reynard Corpporation, CA定制22.5°反射镜
电动光学支架New Focus, CA8816
电动XYZ平移台Thorlabs, NJMT3/M-Z6样品支架
T-Cube直流伺服电机控制器Thorlabs, NJTDC001
压电相位移位器Physik Instrumente, GermanyS-303.CD
物镜Nikon, JapanMRD01691物镜，Apo TIRF 60X/1.49 油浸
平移台New Focus, CA9062-COM-M
皮秒电机执行器New Focus, CA8301
旋转电磁阀/快门DACO Instruments, CT5423-458
三分束器Rocky Mountain Instruments, CO定制分束器
压电Z/倾斜/偏转扫描器Physik Instrumente, GermanyS-316.10
电动五轴倾斜对准器New Focus, CA8081
Picmotor以太网控制器New Focus, CA8752
压电控制器/放大器/数字操作模块Physik Instrumente, GermanyE-509/E-503/E-517
带通滤光片Semrock, NYFF01-523/20滤光片
带通滤光片Semrock, NYFF01-588/21
带通滤光片Semrock, NYFF01-607/30
带通滤光片Semrock, NYFF01-676/37
陷波滤光片Semrock, NYNF01-405/488/561/635
带控制器的电动滤光轮Thorlabs, NJFW103H
EMCCD相机Andor, UKDU-897U-CSO-#BV3套
用于控制相机和同步的台式计算机DellPrecision T3500PC，4套
带定位标记的盖玻片Hestzig, VA600-100AuF样品制备，提供不同密度和光谱的定位标记
纤连蛋白Millipore, MTFC010
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences, PA15710固定剂，16%
戊二醛Electron Microscopy Sciences, PA1622025%
曲拉通X-100Sigma aldrich, MOT8787
HUVEC细胞Life Technologies, CAC-015-10C
Medium 200培养基Life Technologies, CAM-200-500
大血管内皮细胞生长因子Life Technologies, CAA14608-01
杜氏磷酸盐缓冲液14190367
青霉素/链霉素15140122
胰蛋白酶/EDTALife Technologies, CA25200056
PIPESSigma aldrich, MOP1851PHEM缓冲液组分
HEPES1st base, MalaysiaBIO-1825
EGTASigma aldrich, MOE3889
MgCl2Millipore, MT5985
Alexa Fluor 647鬼笔环肽Invitrogen, CAA22287染色
硼氢化钠（NaBH4）Sigma aldrich, MO480886淬灭
葡萄糖1st base, MalaysiaBIO-1101成像缓冲液组分
葡萄糖氧化酶Sigma aldrich, MOG2133
过氧化氢酶Sigma aldrich, MOC9322
半胱胺Sigma aldrich, MO30070
环氧树脂Thorlabs, NJG14250
凡士林Sigma aldrich, MO16415样品封片
羊毛脂Sigma aldrich, MOL7387
石蜡Sigma aldrich, MO327204
浸油Electron Microscopy Sciences, PA16915-04成像，Cargille HF型

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super reso....

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iPALM EMCCD

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