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Summary

本协议描述携带CYCLEN基于大环螯合物协调顺钆离子树枝状磁共振成像（MRI）造影剂的制备和表征。在一系列的体外 MRI实验中，相对于可商购的单体类似物时此代理产生的放大的磁共振信号。

Abstract

钆（III）与无环或大环螯合物的顺磁性配合物是用于磁共振成像（MRI）中最常用的造影剂（CA）的。他们的目的是提高在组织的水质子的弛豫率，从而增加了MR图像对比度和磁共振测量的特异性。当前临床批准的造影剂是正在迅速从体内清除的低分子量分子。作为顺磁性螯合剂的载体的使用树枝状聚合物可以在更高效的MRI造影剂的未来发展中发挥重要作用。具体地，增加在一个较高的信号对比度顺磁物质的结果的局部浓度。此外，此CA提供由于其高分子量和尺寸较长的组织的保留时间。这里，我们证明了基于聚（酰氨基胺）大分子MRI造影剂（PAMAM）与monomacro树枝状聚合物的制备便利过程环状DOTA型螯合剂（DOTA – 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）。螯合单元通过利用朝向PAMAM树枝状聚合物的胺基表面基团的异硫氰酸酯（NCS）基团的反应性，以形成硫脲桥追加。树枝状产物纯化并通过核磁共振谱，质谱和元素分析法分析。最后，高清晰度的MR图像记录和从制备树枝状和市售单体剂获得的信号反差进行比较。

Introduction

磁共振成像（MRI）是广泛用于生物医学研究和临床诊断的有力和非电离成像技术，由于其非侵入性和优良特性的软组织的对比。最常用的MRI方法利用从水的质子获得的信号的基础上，在水信号的密度差异的组织中提供高清晰度的图像和详细的信息。的信号强度和在MRI实验的特异性可以使用造影剂（CA）的进一步提高。这些都是影响的纵向（T _1）和横向分别^1,2-顺磁性或超顺磁性物质（T _2）弛豫时间。

用聚氨基聚羧酸配体的镧系元素离子钆配合物是最常用的_Ť1的CA。钆（III）缩短的T ₁松弛因此水的质子的时间，增加的MRI实验³中的信号对比度。然而，钆离子是有毒的;它的大小近似于钙（Ⅱ），它严重影响钙辅助细胞信号传导。因此，无环和大环螯合物被用来抵消这种毒性。各种多齿配体迄今已开发的，导致具有高的热力学稳定性和动力学惰性¹钆（Ⅲ）配合物。那些基于所述12元azamacrocycle CYCLEN，特别是其四衍生物DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）是此CA类的最研究和应用的复合物。

尽管如此，GdDOTA型CA是低分子量的系统，其中显示某些缺点，例如低对比度效率和快速的肾排泄。大分子和多价的CA可能是一个很好的解决了这些问题^，4。由于CA biodistribu化主要是由它们的大小决定的，大分子的CA显示组织中更长的保留时间。同样重要的是，在单体的MR 探测器 （ 如 GdDOTA复合），基本上改善所获取的MR信号和测量质量的增加的局部浓度这些试剂的结果的多价。

树枝状聚合物之间的编写多价的CA用于MRI ^4,5最好支架。这些具有良好定义的尺寸的高度支化的大分子易于在其表面上的不同的偶合反应。在这项工作中，我们报道的制备，纯化和树枝状的CA用于MRI由第4代（G4）聚（酰氨基胺），耦合到GdDOTA状螯合物（DCA）（PAMAM）树枝状聚合物的表征。我们描述了反应性的DOTA衍生物的合成及其与PAMAM树枝状耦合。在与钆（III），标准的理化性质络合procedu再DCA的进行。最后，进行核磁共振实验证明DCA的以产生具有比从低分子量的CA获得的那些较强的对比度的MR图像的能力。

Protocol

1. DCA的制备

1. 单体单元4 ⁶的合成。
   1. 4-（4-硝基苯基）-2-（4,7,10-三- 叔丁氧基羰基环十二烷-1,4,7,10-四氮杂-1-基）丁酸叔丁基酯（2）。
      1. 溶解（4,7-双- 叔丁氧基羰基- 1,4,7,10-四氮杂cyclododec -1-基）在N -乙酸叔丁基酯1（1.00克，1.94毫摩尔），N-二甲基甲（ DMF，5ml）中，加入碳酸钾（0.67克，4.86毫摩尔，2.5当量）和在室温下搅拌45分钟该混合物。
         注:大环1从CYCLEN制备和叔根据先前公布的程序⁷ -丁基溴。
      2. 添加叔丁基-2-溴-4-（4-硝基苯基）丁酸甲酯（0.87克，2.53毫摩尔，1.3当量）分批1小时。继续下ŧ搅拌混合物他相同的反应条件下18小时。
         注: 叔丁基-2-溴-4-（4-硝基苯基）丁酸根据先前公布的程序⁸由4-（4-硝基苯基） -丁酸，亚硫酰氯和溴制备。
      3. 通过球对球真空蒸馏的手段在^40-60℃9除去DMF。
      4. 将该残余物通过柱色谱法（硅胶，7％甲醇/二氯甲烷），得到产物2，为棕色无定形固体（1.09克^{，72％）10。}
   2. 4-（4-氨基苯基）-2-（4,7,10-三- 叔丁氧基羰基环十二烷-1,4,7,10-四氮杂-1-基）丁酸叔丁基酯（3）。
      1. 溶解硝基苯衍生物2（1.00克，1.28毫摩尔）在乙醇（10毫升）和甲醇（150微升）的7N氨溶液。活性炭上添加钯作为催化剂（钯/炭，150毫克，15重量％）至soluti上。
      2. 摇在帕尔氢化装置中在氢气氛（2.5巴）下16小时的非均相混合物。
      3. 通过它在乙醇中悬浮，并通过烧结的玻璃漏斗过滤该悬浮液制备硅藻土饼。倾从1.1.2.2悬浮在所制备的滤饼通过过滤除去Pd / C催化剂。
      4. 在旋转蒸发器（水浴温度〜40℃）除去通过温和蒸馏溶剂，得到化合物3，为棕色无定形固体（0.91克，95％）。
   3. 的4-（4-异硫氰基）合成-2-（4,7,10-三- 叔丁氧基羰基- 1,4,7,10-四氮杂-1-基）丁酸叔丁基酯（4）。
      1. （0.124毫升，1.58毫摩尔，1.3当量）加入二氯硫化碳为3的三乙胺的混合物（0.91克，1.22毫摩尔）和（0.685毫升，4.87毫摩尔，4当量）的二氯甲烷（15毫升）中。
      2. 大力搅拌反应英里在室温下用磁力搅拌器16小时夹具。
      3. 在旋转蒸发器（水浴温度〜40℃）除去通过温和蒸馏出溶剂，然后纯化通过柱色谱法（硅胶，5％甲醇/二氯甲烷）粗产物，得到产物4，为浅棕色无定形固体（0.51克，53％）。
2. 树枝状DCA的合成。
   1. 树枝状聚合物5的合成。
      1. 取G4-PAMAM树枝状聚合物（667毫克，在甲醇中10％的树枝状聚合物的溶液，4.67微摩尔），蒸发通过温和蒸馏甲醇用旋转蒸发器（水浴温度〜40℃），并溶解于DMF，残余物（4毫升）中。
      2. 添加三乙胺（0.105毫升，0.75毫摩尔，160当量），在60℃下搅拌45分钟，并添加异硫氰酸酯4（354毫克，0.45毫摩尔，1.5当量相对于树枝状聚合物的氨基表面基团）分批OVE，R 1小时。
      3. 搅拌用磁力搅拌器将反应混合物在45℃下48小时。
      4. 在40-60℃除去的球对球真空蒸馏装置中的溶剂。
      5. 净化用亲脂性凝胶过滤介质和甲醇作为洗脱剂通过大小排阻层析残余物。收拾列中，不施加压力溶胀该过滤介质在甲醇中在室温下（>4毫升每1g粉末的甲醇）至少3小时。通过收集1毫升分数进行重力分离。
      6. 分析用薄层色谱（TLC）所收集的级分。开发在15％甲醇/二氯甲烷的TLC板（仅位于基线时的最极性点是从树枝状产物衍生）。蒸发在旋转蒸发器（水浴温度〜40℃）通过温和蒸馏收集到的馏分，得到产物5（270毫克，91％）。
   2. 树枝状聚合物的合成<strong> 6。
      1. 溶解在甲酸（5毫升）中的受保护的树枝状螯合剂5（270毫克，4.23微摩尔），搅拌在60℃下该混合物24小时。
      2. 蒸发在旋转蒸发（约15毫巴的压力，水浴温度〜40℃）通过蒸馏甲酸并冷冻干燥该产物，得到6-（压力〜0.2毫巴^）9。
   3. 所述树枝状造影剂的合成（DCA）
      1. 溶解在水中的树枝状螯合剂6（4.35微摩尔）和将pH调节至7.0与0.1M氢氧化钠。
      2. 溶解GdCl _{3·6H 2} O（113毫克，304微摩尔）的水（1毫升）中，并添加其滴加至螯合剂6的历时4小时的溶液;保持与氢氧化钠水溶液（0.05M），通过测量pH值用pH计的pH值在7.0。
      3. 搅拌在室温吨磁力搅拌器将混合物emperature 24小时。
      4. 乙二胺四乙酸（EDTA，158毫克，426微摩尔）的溶液中分批添加经4小时以除去过量的Gd（III），同时保持与氢氧化钠水溶液（0.05M）pH在7.0。在室温下搅拌该混合物24小时。
      5. 执行大小排阻层析以除去大部分GdEDTA的和过量的EDTA。在使用水溶胀亲水凝胶过滤介质收拾列。混合物降低至合适的体积，并装载柱。洗脱用离子交换水列不施加压力。
      6. 使用3 kDa的离心过滤单元30分钟，在离心力1800 XG删除GdEDTA和EDTA的残留离心机样品。重复此步骤（左右五次）直到滤液显示不存在EDTA和GdEDTA的。将样品转移到一个烧瓶中，蒸发，然后冷冻干燥该溶剂，得到灰白色产物作为最终的DCA（186毫克，71％）。
         注:ESI-MS的方法检查没有EDTA和GdEDTA的。
      7. 确认没有钆（III）的作为使用二甲酚橙测试一个自由离子。溶解在醋酸盐缓冲液（pH 5.8），滤液（0.5毫升）中。添加二甲酚橙溶液几滴和跟踪变色（黄色或紫色表明不存在或游离钆（Ⅲ）分别离子在溶液中，存在^）11。

2.树枝状产品在体外表征

1. 联接到PAMAM树枝状聚合物（具有DOTA状的大环化合物的树枝状聚合物的载量）大环DOTA-单元的数目的估计
   1. 估计用¹ H-NMR（核磁共振-核磁共振光谱）。
      注意:此过程有可能在树枝状5和6，但不是在DCA。
      1. 记录¹ H NMR谱^12。
      2. 整合芳香族区和两个单独的脂族区（1脂族树枝状聚合物和大环的质子的信号; 2。第t -Bu基的信号）为树枝状聚合物5和6或只是一个脂族区域，分别。
         注意:没有单独的信号中的脂族区来自第t -Bu组树枝状6，因为它们已被水解。
      3. 运用EQ。 1或公式。 2来估计大环单元（n），其中R =积分的比值的数量（脂族/在等式1或脂族-树枝状芳香族/脂肪- 叔卜在公式2），H _DEND =质子数在树枝状聚合物， 高度 _的Ar =芳族质子的数量，H _t中 _BU =质子在叔 -Bu组的数量，和H _MAC =在一个大环的质子数。
         注意:无论是公式。 1或公式。 2 FO可以使用ř树枝状5，而只有等式1可用于树枝状聚合物6。由于可交换质子（在胺，酰胺，硫脲，或羧酸盐）通常被用氘取代，他们没有在计算假定。这里，H _DEND = 1128（5）或1000（6），H _氩 = 4，和H _MAC = 27被使用。
         （1）
         （2）
   2. 通过使用氮气的比率为硫从元素分析估计。
      1. 执行对固体样品枝（DCA在此工作）的元素分析。
      2. 运用EQ。 3估计大环单元（n），其中R =测定％N和％S，N _DEND或S _DEND的比例数=数氮或树枝状聚合物中的硫原子，和N _MAC或S _MAC =氮或硫原子的一个大环单元的数目。
         注意:因子2.29是从硫和氮的原子质量的比获得。在这项工作中，N- _DEND = 250，S _DEND = 2，N _MAC = 5和S _MAC = 1被使用。
         （3）
   3. 估计用的飞行基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）。
      1. 执行MALDI-TOF MS分析^13。
      2. 计算大环单元（n）的根据式的数目。 4，其中M _Z =所观察到的质量（M / Z）中，z =电荷的物种中，M _DEND =树枝状部分的质量，以及M _MAC =一个大环单元的质量。
         没有TE:M = _DEND 14,306和M _MAC = 719在这项工作中使用。
         （4）
2. DCA浓度（[DCA]）的测定:散装磁化率测量（BMS）
   1. 在一个塑料瓶中管（[DCA]〜5-10毫摩尔）溶解在水（360微升）的DCA（5-10毫克）。
      注:[DCA]应在5-10毫的范围，以避免叔丁醇共振的可能的重叠在样品浓度> 15毫米，与水的谐振在δ= 4.7 ppm的。
   2. 添加60微升D ₂ O中的: 叔丁醇混合物（2:1体积/体积）至DCA的水溶液，并使用涡旋混合器将所得的溶液（420微升）混合。
   3. 转移400微升样品放入一个外NMR管，并放置一同轴NMR插入管与叔丁醇:H ₂ O的混合物（10:90体积/体积）到样品管中。
   4. 记录¹ H NMR谱，并测量在内部和外部的NMR管中（参考^）12从叔丁醇衍生谐振信号之间的频移。
   5. 运用EQ。 5，以确定[DCA]，其中T =绝对温度，Δχ=记录的移位，μ _有效 =有效磁的镧系元素离子为钆^{（III）14，}和s =一个常数依赖力矩（μ _有效 = 7.94在样品的形状和其在磁场（0，1/3，和在一个球体，平行于气缸，和气缸垂直于磁场的情况下的1/6，分别地）的位置。
      注:对于[DCA]得到的计算值应该被校正的原始浓度由于加入的D ₂ O中的: 叔丁醇溶液（60微升）。
      （5）
3. 动态光散射（DLS）测量。
   1. 制备过滤DCA溶液（0.2微米聚四氟乙烯/ PTFE过滤，每钆0.75毫（III））在4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（25mM，pH7.4）中，并将其转移到一个比色皿为DLS测量。
   2. 放置反应杯插入DLS装置和设置以下参数:30秒之前记录5次重复的15扫描（1次扫描= 12秒，折射率= 1.345，吸收= 1％），而不会在扫描之间，并与温度平衡延时。
   3. 导出所获取的数据和通过绘制人口（％），为大小（流体动力学直径）的函数得到的粒度分布的直方图。
4. 纵向和横向弛豫的测量。
   注意:使用弛豫时间分析仪¹⁵用类似的方法已经描述;使用具有的Topspin 300MHz的NMR波谱仪进行此过程软件。
   1. 准备一套H中DCA解决方案₂ O的:D ₂ O（500微升，10％D ₂ O H中₂ O，[DCA] = 2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0毫米，[HEPES ] = 25毫米）从DCA股票样本（见第2.2节）。
   2. 转移450微升溶液进入核磁共振管，并将其放入仪器中。
   3. 优化采集参数（90°激励脉冲持续时间（P1），以及辐射频率偏移（O _1）），然后执行T使用反转恢复（IR）和台车式赛尔Meiboom -吉尔_和 T2实验（CPMG ）的脉冲序列。
   4. 的_T1和T2 ₂弛豫时间测定。
      1. 选择所记录的测量，过程在F2尺寸的二维频谱，并执行交互式相位校正。
      2. 在分析/ T选择适当的切片（最大强度峰值） <sub> 1 / T ₂松弛窗口，整合它，以及该地区出口到放松模块。
      3. 选择合适的拟合函数（invrec或uxnmrt2红外和CPMG实验，分别），得到的T ₁或T ₂弛豫时间。
   5. 重复步骤2.4.4.2-2.4.4.4的所有剩余[DCA]解决方案。
   6. 计算从所获得的_Ť1值的弛豫率（R ₁和R _{2）（R 1,2} = 1 / T _1,2）。
   7. 情节_的 R ₁和R _2（秒^-1），为钆（III）浓度的在毫函数。
   8. 确定纵向和横向弛豫，R ₁和R _2（毫^-1秒^-1），从拟合直线的斜率，由式所定义。 6，其中R _{I，观测值} =纵向（ⅰ= 1）或横向（ⅰ= 2）抗磁松弛率水在实验中所用的情况下顺磁物质的和[钆] =钆（III）的浓度。
      （6）

3. 在体外 MRI; DCA和GdDOTA的比较

1. 管幻影的制备
   1. 为两组实验其中计算造影剂的浓度制备的DCA（4×350微升）和GdDOTA（4×350微升）以及水样（4×350微升）的水溶液:（3.1.1.1）每钆（III）或每分子（3.1.1.2）。
      1. 准备两个样品DCA和两个GdDOTA 样品的分别每钆0.5和1.0毫米（III）的浓度。此外，准备两个水样（如控制管）。
      2. 准备两个DCA样品（2.5和每钆（III）或0.05 5.0毫和每个树枝状分子0.1毫摩尔），二GdDOTA样品（0.25，0.5毫摩尔）和两个水样（CONTRO升管）。
         注意:适当的DCA和GdDOTA浓度应通过稀释各自的股票样本通过BMS法测定浓度制备（参见2.2节）与HEPES缓冲液（pH 7.4）。为了简化计算，假设为平均每树枝状聚合物分子的大环单元的N = 50。因此，DCA的比率:GdDOTA为1:5，计算上的每个分子基础。
   2. 放置在300μl的塑料瓶管中的样品，从而避免气泡的在溶液中的存在。
      注:在塑料小瓶管的尺寸取决于所使用的射频线圈的类型和大小（在此，与卷线圈给出一个例子）。
   3. 插入样品的注射器（60 ml，此）的内部，用1mM GdDOTA填充 溶液，并将其放置在扫描仪。
      注:样品置于GdDOTA的水溶液，以避免易感性的影响（在磁场的Field变化对发生的不同磁化率的物质之间的接口附近）trength。
2. 参数优化和成像。
   1. 使用解剖扫描（航向/ Tripilot）与样品的注射器放置在磁体的等角点。
   2. 按红绿灯（调整扫描）来执行调整为垫补整个卷，中心频率（O _1），接收器增益（RG），并且所述发射增益（TX0和TX1）的（磁场均匀的调整）。
   3. 用于T ₁ -加权（T _1W）成像，选择快速低角度拍摄（FLASH）法。
   4. 选择在扫描仪使用扫描定位器垂直放置（注射器水平）样本冠状切片。
   5. 运用EQ。 7对比度-噪声（CNR）采集的优化参数^16，其中α=翻转角，TE =回波时间TR =重复时间，T _{1，A，T 1，B} =第t样品A的₁倍（T _1，A）和样品B（T _1，B）该CNR应该最大化（同样是有效的_ŧ2次:T _2，A和T _2，B）。
      注:t ₁和T ₂弛豫时间应设置为从纵向和横向弛豫（第2.4节）的测量获得的值，而TE，TR，α应距离CNR优化计算而获得。
      （7）
   6. 取得使用在前面的步骤（3.2.5）中获得的参数的图像。
   7. 计算信噪比（SNR）。
      1. 加载收购牛逼 _1瓦特图像（扫描）转换成图像显示及处理窗口，单击定义感兴趣区域 （ROI） 的区域 。
      2. 选择一个圆形的投资回报率，并在样品位置和背景绘制。接着，点击显示以获得的平均信号振幅（S _信号 ）和背景（S _噪声 ）的标准偏差。
      3. 重复步骤3.2.7.2对于DCA，GdDOTA和水样。
      4. 用计算公式SNR:SNR = S _信号 / S _的噪音 。
   8. 经过稍微修改程序，用快速采集弛豫增强（RARE）方法执行_T2加权（T _2W）成像。对于CNR采集参数的优化，运用EQ。 8。
      （8）

Representative Results

Discussion

所述树枝状MRI造影剂的制备需要的单体单元的适当选择（ 即，螯合剂为钆（III））。它们减少这种顺磁性离子的毒性，迄今为止，各种各样的无环的和大环螯合剂用于此目的^1-3。在这些中，大环DOTA型螯合剂具有最高热力学稳定性和动力学惰性的，因此，是惰性MRI造影剂^1,18的制剂最优选的选择。此外，它们易发生各种合成转化，这导致双官能螯合剂，能够链接到各种功能分子（ 例如，靶向载体或纳米载体），同时仍形成稳定的Gd（III）络合物^19。为此，在此过程中所描述的DOTA型单体单元是从DO3A- 叔丁基酯，公共的和容易得到的前体，和的溴衍生物制备的4-（4-硝基苯基）丁酸。这种分子是从DOTA衍生的并具有相似的结构，以协调的Gd（Ⅲ）。合成修改的目的是使该螯合剂容易耦合到各种功能分子和运营商的反应。即，在螯合剂DOTA的改性分子结果的制备仍然使用可协调到钆4羧基（Ⅲ），以形成一种惰性复杂和正交硝基苯基，其在转换重视这个螯合剂到树枝状聚合物的表面。此过程还允许在正交反应性基团的选择的灵活性（ 例如，NH ₂或COOH），它可以用来耦合的Gd（III）螯合剂到所需载体在一个优选的方式。

所得到的双功能螯合剂可以以两种不同的方式（ 即，合成方法）耦合到其它分子。当硝基还原为氨基，将得到的苯胺可以根据去与其他分子⁸的羧酸基的缩合反应。此外，在硫光气的存在下的芳族伯胺官能团可容易地转化成异硫氰酸酯，它容易与在极性有机溶剂以及水的胺反应，为单体单元的至树枝状聚合物¹⁷偶联，提供更多的反应的可能性的基团^，20,21。

用于耦合的双功能螯合剂的树枝状载体，一个合适的树枝状骨架应选择。关系到最终树枝状聚合物缀合物的结构和期望的应用的几个因素应该在此步骤中被考虑。由于树枝状载体的广泛的商业可用性，产品具有不同的核心结构，表面反应性基团，或世代可以选择。因此，偶联反应将取决于表面基团的树枝状聚合物和螯合剂的正交基，而最终结合物可以是中性的，带电荷的，或具有不同的大小（可达15-20纳米，这取决于树枝状代^）22。所有这些方面，应考虑制备树枝状CA之前，因为它们可能影响溶解性，弛豫（MRI信号增强），扩散，和造影剂，这可能危及其在MRI中的应用的其他药物代谢动力学性质。例如，阳离子树枝状聚合物可以在生物系统中表现出毒性。然而，可以通过树枝状聚合物表面上带负电荷的基团的缀合可以减少这种影响，从而降低了其总体正电荷^23。

在这个协议中，我们已经使用其中单体大环化合物4的异硫氰酸酯基偶联到装有64伯胺表面基团的商业胱胺核G4-PAMAM的方法制备的树枝状造影剂的DCA。该hydroph的初步纯化OBIC树枝状产物5是为了除去大部分未反应的单体单元的使用具有亲脂性凝胶过滤介质和甲醇作为洗脱剂的柱通过柱色谱法进行的。 叔丁基酯的用甲酸水解是直接的，从而导致可与大小排阻层析使用亲水性凝胶过滤介质中纯化的水溶性树枝状产物。被同时保持在为了便于形成复合物在中性pH的溶液进行用钆（III）的多聚体和树枝状螯合剂的络合。否则，钆的络合（Ⅲ）（加入作为氯化物盐）降低pH值，减缓该反应。最后，值得注意的是，在树枝状聚合物芯胺基也往往具有钆（III），以协调，但只与过量的，可能无法与DOTA单位螯合。避免钆（III）的DOTA螯合剂以外的存在是必要的，因为文件从CA钆（III）的akage可以具有不希望的影响;即，它可以在体内 ¹⁸诱导的毒性。过量的钆（III）可通过用EDTA接着GdEDTA的超滤和使用3- kDa的分子量截止（MWCO）过滤器无EDTA的络合被有效地除去。当树枝状缀合物具有较低的分子量下MWCO过滤器可能被使用。

有相关DCA的筹备工作两大问题进行故障排除。由于对核磁共振信号的Gd（Ⅲ）的大扩大效果，DCA的通过NMR光谱的装置的分析并不丰富。相反，该分析应在前面的步骤（化合物5和6）来执行。接着，monomacrocyclic单元与树枝状聚合物表面缀合不会与100％转化来实现，但它很可能是50-90％之间（见下文）。通常情况下，反应产率可提高通过添加monomeri的第二部分C反应单元树枝状聚合物和单体单元的第一缀合完成之后^24。然而，每一个制备批次的结果在缀合树枝状聚合物表面上螯合剂的稍微不同的平均数目，即使当相同的树枝状聚合物和DOTA的单元被用作用于耦合材料。虽然钆（III）的存在于DCA最终量可以经由BMS方法独立地确定（见2.2节），为树枝状偶联物的更好表征，有必要在每次新一批的执行结合单体单元的估计DCA准备（见2.1和讨论如下）。

分离树枝状产品的分析表征可通过¹ H NMR谱（仅在制品5和6），元素分析，和MALDI-TOF MS的手段来进行。氨基表面基团的转化率典型收率位于50-90％之间，这取决于树枝状聚合物generati上，螯合剂的类型，和所使用的反应条件（溶剂，温度^{）6,20,24,25。}在这个特殊的情况下，从联合分析得到的计算出的质量对应于平均的49单体螯合物被连接到树枝状聚合物（ 即，〜树枝状聚合物表面的胺的75％占有率）。虽然在反应氨基的最终数量稍有失配可能这些方法²⁵之间所预期的，其直接比较提供了用于形成所需的DCA的具有特定平均数目附螯合单元的合理的证据。

在体外表征旨在评估DCA的潜在增强的MRI实验的对比度由DLS，relaxometric和MRI实验。 DCA的流体动力学直径被确定为通过DLS测量7.2±0.2纳米，这是在协议与这类以前报道偶联物与G4第4代树形分子^26。 DCA的纵向弛豫的测定接着先前描述的步骤¹⁵和揭示的6.2±0.1毫米^-1秒^-1每钆（III）中的值。增强在顺磁钆（III）的DCA相对第r ₁到相似类型（ 例如，GdDOTA）的小尺寸分子的约50％可与树枝状造影剂的中间大小进行说明。即，附着于树枝状聚合物的表面的钆螯合物的减少运动增加了旋转相关时间，因此，R _1;这种效果仍然可以在更小的纳米尺寸剂高磁场被观察到。否则，在旋转相关时间的增加显性有助于在低磁场_{^27，R 1}的增强。另一方面，所述树枝状造影剂的大小对横向RELA有显着影响xivity ^28，产生30.5±0.6毫米^-1秒^-1的值每钆（III）。总之， 在体外 DCA的评估方法是直接的，只需要仔细的样品制备，所以获得的数据和分析结果时没有任何困难的预期。

为了证明树枝状造影剂和它的力量影响图像的对比度的效果，我们使用新制备的造影剂的DCA执行上管幻影的MRI实验。我们还使用了可商购的和临床批准MRI对比剂，GdDOTA的溶液中，作为比较和管以水为对照。在加权的MRI实验中第一T _1中 ，当被用于相等的Gd（III）的浓度（0.5或1钆毫（Ⅲ）在DCA或GdDOTA），信噪比与DCA管已经高达12％是由于较高的在DCA相比GdDOTA的纵向弛豫（增加约50％Figure 5A）。第二T ₁ -加权的MRI实验的目的是要证明的DCA时每分子计算的浓度的影响。虽然相比GdDOTA施加5倍以下的DCA（50与250微米或100与500微米的DCA与GdDOTA，分别），DCA与钆一个高负荷（Ⅲ）导致了图象对比度的显著增量，这反过来又导致所观察到的SNR值是在填充有DCA幻像管高至少三倍。果然，无论是_T2加权MRI实验表现出充满DCA和GdDOTA幻象管之间的SNR大（3-20倍）的差异。

总之，这个协议描述了使用普通的合成方法，以提供DCA相比于小尺寸的CA改善的性质用于MRI树枝状的CA的一个方便的制剂。时相比，DCA展品首选热力学稳定性和动力学惰性其单体CA类似物。尽管如此，DCA和，的多价，因此，在目标区域中的顺磁性物质的高局部浓度诱导的MR图像的高对比度。考虑到往往是最好的药代动力学特性 （ 如更长的组织中的保留时间）相比，其单体CA类似物，或执行进一步的功能的能力（ 例如，有针对性的载体），这些树枝状，大环偶联代表一个有前途的，有价值的类造影剂为未来的各种MRI和分子成像应用。

Materials

Cyclen	CheMatech	C002
<em>tert</em>-Butyl bromoacetate&nbsp;	Alfa Aesar	A14917
<em>N,N</em>-Dimethylformamide	Fluka	40248
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid	Aldrich	335339
Thionyl chloride&nbsp;	Acros Organics	382662500	Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine	Acros Organics	402841000	Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled&nbsp;
Diethyl ether	any source
Sodium sulphate	Acros Organics	196640010
Chloroform&nbsp;	VWR Chemicals	22711.29
<em>tert</em>-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate	Aldrich	364789	Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate	Acros Organics	174560250	48% BF<sub>3</sub>. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate	Acros Organics	424270010
Ethyl-acetate	any source		For column chromatography
<em>n</em>-Hexane	any source		For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus	B&uuml;chi		Model type: Glass oven B-585
Silicagel	Carl Roth GmbH	P090.2
Methanol	any source		For column chromatography
Dichloromethane&nbsp;	any source		For column chromatography
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
Ammonia	Acros Organics	428381000	7 N Solution in Methanol
Palladium	Aldrich	643181	15% wet
Hydrogenation apparatus PARR	PARR Instrument Company
Celite 503	Aldrich	22151
Sintered glass funnel	any source
Thiophosgen	Aldrich	115150	Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine	Alfa Aesar	A12646
Dichloromethane&nbsp;	Acros Organics	348460010	Extra dry&nbsp;
Magnetic stirrer	any source
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS – 297	10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
Thin-layer chromatography plates	Merck Millipore	1.05554.0001
Formic acid	VWR Chemicals	20318.297
Lophylizer&nbsp;	any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate	Aldrich	G7532
Sodium hydroxide	Acros Organics	134070010
pH meter	any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Aldrich	E5134
Mass spectrometer (ESI)	Agilent		Ion trap SL 1100&nbsp;
Acetate buffer	any source		pH 5.8
Xylenol orange	Aldrich	52097	20 &mu;M in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge	any source
NMR spectrometer&nbsp;	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		Version 2.1
Combustion analysis instrument	EuroVector SpA		EuroEA 3000 Elemental Analyser&nbsp;
MALDI-ToF MS instrument	Applied Biosystems		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
<em>tert</em>-Butyl alcohol	Carl Roth GmbH	AE16.1
Vortex mixer	any source
Norell NMR tubes	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR coaxial tube	Deutero GmbH	coaxialb-5-7
DLS instrument	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 &mu;m PTFE filter&nbsp;	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
Plastic tube vials	any source
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
MRI scanner	Bruker		BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil	Bruker		Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software)	Bruker		Version 5.1