本方案描述了一种树状磁共振成像（MRI）对比剂的制备与表征方法，该对比剂携带基于环烯的巨环螯合物，可配位顺磁性钆离子。通过一系列MRI实验 体外与市售的单体类似物相比，该试剂产生了增强的MRI信号。
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摘要
摘要
钆(III)与开链或大环螯合剂形成的顺磁性配合物是磁共振成像（MRI）中最常用的对比剂（CAs）。其作用是提高组织中水水质子的弛豫速率，从而增强MR图像的对比度以及MRI测量的特异性。目前临床批准使用的对比剂均为小分子量物质，可在体内快速清除。利用树状大分子作为顺磁性螯合剂的载体，有望在未来开发出更高效的MRI对比剂方面发挥重要作用。具体而言，顺磁性物种局部浓度的提高可导致更高的信号对比度。此外，由于其较高的分子量和尺寸，此类对比剂在组织中的滞留时间更长。本文展示了一种基于聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子并携带单一大环DOTA型螯合剂（DOTA — 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）的高分子MRI对比剂的简便制备方法。通过利用异硫氰酸酯（NCS）基团与PAMAM树状大分子表面氨基之间的反应形成硫脲键桥接螯合单元。所得树状大分子产物通过核磁共振波谱、质谱和元素分析进行纯化与表征。最后，记录了高分辨率MR图像，并比较了所制备的树状大分子对比剂与市售单体对比剂所产生的信号对比度。
引言
磁共振成像（MRI）是一种强大且非电离的成像技术，因其无创性以及优异的固有软组织对比度，被广泛应用于生物医学研究和临床诊断。最常用的MRI方法利用来自水质子的信号，根据水信号密度的差异，提供高分辨率图像和组织内部的详细信息。通过使用对比剂（CAs），可进一步提高MRI实验的信号强度和特异性。这些对比剂为顺磁性或超顺磁性物质，分别影响纵向（T1）和横向（T2）弛豫时间1,2。
镧系金属离子钆与多氨基多羧酸配体形成的配合物是最常用的T1对比剂。钆(III)可缩短水质子的T1弛豫时间，从而在磁共振成像（MRI）实验中增强信号对比度3。然而，游离的钆离子具有毒性，其离子半径与钙(II)相近，会严重干扰细胞中依赖钙的信号传导过程。因此，需使用开链或大环螯合剂来中和其毒性。迄今为止已开发出多种多齿配体，形成了具有高热力学稳定性和动力学惰性的钆(III)配合物1。其中，基于12元氮杂大环cyclen、特别是其四羧酸衍生物DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）的配合物是此类对比剂中研究最深入且应用最广泛的一类。
然而，GdDOTA类造影剂是低分子量体系，具有一些缺点，例如对比度效率较....
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方案
1. DCA 的制备
- 单体单元 46 的合成
- 4-(4-硝基苯基)-2-(4,7,10-三-叔-丁氧羰基甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)丁酸 叔-丁酯 (2) 的合成。
- 将 (4,7-双-叔-丁氧羰基甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酸 叔-丁酯 1 (1.00 g, 1.94 mmol) 溶于 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF, 5 ml) 中，加入碳酸钾 (0.67 g, 4.86 mmol, 2.5 当量)，室温下搅拌混合物 45 分钟。
注：大环化合物 1 按照先前发表的方法7由 cyclen 和 叔-丁基溴乙酸酯制备。 - 在 1 小时内分批加入 叔-丁基-2-溴-4-(4-硝基苯基)丁酸酯 (0.87 g, 2.53 mmol, 1.3 当量)。在相同反应条件下继续搅拌混合物 18 小时。
注：叔-丁基-2-溴-4-(4-硝基苯基)丁酸酯按照先前发表的方法8由 4-(4-....
- 将 (4,7-双-叔-丁氧羰基甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酸 叔-丁酯 1 (1.00 g, 1.94 mmol) 溶于 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF, 5 ml) 中，加入碳酸钾 (0.67 g, 4.86 mmol, 2.5 当量)，室温下搅拌混合物 45 分钟。
- 4-(4-硝基苯基)-2-(4,7,10-三-叔-丁氧羰基甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)丁酸 叔-丁酯 (2) 的合成。
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结果
样品的制备 DCA 包括两个阶段：1）单体 DOTA 型螯合剂的合成（图1）以及2）将螯合剂与G4 PAMAM树状大分子偶联，并随后制备树状大分子Gd(III)配合物（图2）。在第一阶段，制备了一种基于环烯的 DOTA 型螯合剂，该螯合剂含有四个羧酸基团和一个适用于进一步合成修饰的正交基团。该制备从 1 (DO3A-tert-丁酯7，随后用烷基化剂处理 tert2-溴-4-(4-硝基苯基)丁酸叔丁酯8 提供DOTA衍生物 2. 钯催化氢化还原了芳香硝基团 2 以得到苯胺 3. 转化过程的 3 与硫光气反应生成异硫氰酸酯 4，此前曾用作制备树枝状造影剂的胺反应性试剂17.<.......
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讨论
树枝状 MRI 对比剂的制备需要适当选择单体单元（即， Gd(III)的螯合剂）。它们可降低这种顺磁性离子的毒性，迄今为止，已有多种无环和大环类螯合剂被用于此目的1-3在这些螯合剂中，大环类 DOTA 型螯合剂具有最高的热力学稳定性和动力学惰性，因此是制备惰性 MRI 对比剂的首选1,18此外，它们容易发生多种合成转化，从而生成双功能螯合剂，可与多种功能分子连接。例如， 靶向载体或纳米载体，同时仍形成稳定的 Gd(III) 配合物19为此，本实验中所述的DOTA型单体单元由DO3A制备而来。叔叔丁酯，一种常见且易得的前体，以及4-(4-硝基苯基)丁酸的溴化衍生物。该分子源自DOTA，具有与Gd(III)配位相似的结构。合成修饰旨在使该螯合剂易于与多种功能分子和载体发生偶联反应。具体而言，制备得到的DOTA修饰分子仍保留四个可用于与Gd(III)配位形成惰性配合物的羧基，同时含有一个正交的硝基苯基团，该基团经转化后可将螯合剂连接至树状大分子表面。该方法还允许灵活选择正交反应性基团例如， NH2.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢马克斯·普朗克学会、土耳其国家教育部（向 S. G. 提供的博士生奖学金）以及德国学术交流服务中心（DAAD，向 T. S. 提供的博士生奖学金）的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 环四氮杂烷 | CheMatech | C002 | |
| 叔丁基溴乙酸酯 | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 | Fluka | 40248 | |
| 碳酸钾 | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-硝基苯基)丁酸 | Aldrich | 335339 | |
| 亚硫酰氯 | Acros Organics | 382662500 | 注：腐蚀性物质；吸入有毒 |
| 溴 | Acros Organics | 402841000 | 注：引起严重皮肤灼伤，吸入可致死 |
| 乙醚 | 任意来源 | ||
| 硫酸钠 | Acros Organics | 196640010 | |
| 氯仿 | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| 叔丁基 2,2,2-三氯乙酰亚胺酯 | Aldrich | 364789 | 注：易燃物质；对皮肤和眼睛有刺激性 |
| 三氟化硼乙醚络合物 | Acros Organics | 174560250 | 48% BF3。注：易燃物质；引起皮肤灼伤，吸入可致死 |
| 碳酸氢钠 | Acros Organics | 424270010 | |
| 乙酸乙酯 | 任意来源 | 用于柱层析 | |
| 正己烷 | 任意来源 | 用于柱层析 | |
| 球对球（Kugelrohr）蒸馏装置 | Büchi | 型号：玻璃烘箱 B-585 | |
| 硅胶 | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| 甲醇 | 任意来源 | 用于柱层析 | |
| 二氯甲烷 | 任意来源 | 用于柱层析 | |
| 乙醇 | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| 氨 | Acros Organics | 428381000 | 甲醇中 7 N 溶液 |
| 钯 | Aldrich | 643181 | 15% 湿品 |
| 氢化装置 PARR | PARR Instrument Company | ||
| 硅藻土 503 | Aldrich | 22151 | |
| 烧结玻璃漏斗 | 任意来源 | ||
| 硫光气 | Aldrich | 115150 | 注：对皮肤有刺激性；吸入有毒 |
| 三乙胺 | Alfa Aesar | A12646 | |
| 二氯甲烷 | Acros Organics | 348460010 | 超干燥 |
| 磁力搅拌器 | 任意来源 | ||
| PAMAM G4 树状大分子 | Andrews ChemService | AuCS - 297 | 甲醇中 10% 重量浓度溶液 |
| 脂溶性 Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| 薄层层析板 | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| 甲酸 | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| 冻干机 | 任意来源 | ||
| 六水合氯化钆(III) | Aldrich | G7532 | |
| 氢氧化钠 | Acros Organics | 134070010 | |
| pH 计 | 任意来源 | ||
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | Aldrich | E5134 | |
| 质谱仪（ESI） | Agilent | 离子阱 SL 1100 | |
| 乙酸盐缓冲液 | 任意来源 | pH 5.8 | |
| 二甲酚橙 | Aldrich | 52097 | 乙酸盐缓冲液中 20 μM |
| 亲水性 Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 离心过滤装置 | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 膜（截留分子量 3000） |
| 离心机 | 任意来源 | ||
| 核磁共振波谱仪 | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | 版本 2.1 | |
| 元素分析仪 | EuroVector SpA | EuroEA 3000 元素分析仪 | |
| MALDI-ToF 质谱仪 | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| 重水 | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| 叔丁醇 | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| 涡旋混合器 | 任意来源 | ||
| Norell 核磁管 | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| 核磁同轴管 | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| 动态光散射仪 | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE 滤膜 | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| 塑料管瓶 | 任意来源 | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI 扫描仪 | Bruker | BioSpec 70/30 USR 磁体（7 T）。注：与高磁场相关的潜在危险 | |
| 射频线圈 | Bruker | 双频体积线圈（RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR） | |
| Paravision（软件） | Bruker | 版本 5.1 |
参考文献
- Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
- Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contra....
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重印与许可
