制备及体外磁共振成像基于树状大分子造影剂的表征

摘要

本协议描述携带CYCLEN基于大环螯合物协调顺钆离子树枝状磁共振成像（MRI）造影剂的制备和表征。在一系列的体外 MRI实验中，相对于可商购的单体类似物时此代理产生的放大的磁共振信号。

摘要

钆（III）与无环或大环螯合物的顺磁性配合物是用于磁共振成像（MRI）中最常用的造影剂（CA）的。他们的目的是提高在组织的水质子的弛豫率，从而增加了MR图像对比度和磁共振测量的特异性。当前临床批准的造影剂是正在迅速从体内清除的低分子量分子。作为顺磁性螯合剂的载体的使用树枝状聚合物可以在更高效的MRI造影剂的未来发展中发挥重要作用。具体地，增加在一个较高的信号对比度顺磁物质的结果的局部浓度。此外，此CA提供由于其高分子量和尺寸较长的组织的保留时间。这里，我们证明了基于聚（酰氨基胺）大分子MRI造影剂（PAMAM）与monomacro树枝状聚合物的制备便利过程环状DOTA型螯合剂（DOTA - 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）。螯合单元通过利用朝向PAMAM树枝状聚合物的胺基表面基团的异硫氰酸酯（NCS）基团的反应性，以形成硫脲桥追加。树枝状产物纯化并通过核磁共振谱，质谱和元素分析法分析。最后，高清晰度的MR图像记录和从制备树枝状和市售单体剂获得的信号反差进行比较。

引言

磁共振成像（MRI）是广泛用于生物医学研究和临床诊断的有力和非电离成像技术，由于其非侵入性和优良特性的软组织的对比。最常用的MRI方法利用从水的质子获得的信号的基础上，在水信号的密度差异的组织中提供高清晰度的图像和详细的信息。的信号强度和在MRI实验的特异性可以使用造影剂（CA）的进一步提高。这些都是影响的纵向（T _1）和横向分别^1,2-顺磁性或超顺磁性物质（T _2）弛豫时间。

用聚氨基聚羧酸配体的镧系元素离子钆配合物是最常用的_Ť1的CA。钆（III）缩短的T ₁松弛因此水的质子的时间，增加的MRI实验³中的信号对比度。然而，钆离子是有毒的;它的大小近似于钙（Ⅱ），它严重影响钙辅助细胞信号传导。因此，无环和大环螯合物被用来抵消这种毒性。各种多齿配体迄今已开发的，导致具有高的热力学稳定性和动力学惰性¹钆（Ⅲ）配合物。那些基于所述12元azamacrocycle CYCLEN，特别是其四衍生物DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）是此CA类的最研究和应用的复合物。

尽管如此，GdDOTA型CA是低分子量的系统，其中显示某些缺点，例如低对比度效率和快速的肾排泄。大分子和多价....

方案

1. DCA的制备

1. 单体单元4 ⁶的合成。
   1. 4-（4-硝基苯基）-2-（4,7,10-三- 叔丁氧基羰基环十二烷-1,4,7,10-四氮杂-1-基）丁酸叔丁基酯（2）。
      1. 溶解（4,7-双- 叔丁氧基羰基- 1,4,7,10-四氮杂cyclododec -1-基）在N -乙酸叔丁基酯1（1.00克，1.94毫摩尔），N-二甲基甲（ DMF，5ml）中，加入碳酸钾（0.67克，4.86毫摩尔，2.5当量）和在室温下搅拌45分钟该混合物。
         注:大环1从CYCLEN制备和叔根据先前公布的程序⁷ -丁基溴。
      2. 添加叔丁基-2-溴-4-（4-硝基苯基）丁酸甲酯（0.87克，2.53毫摩尔，1.3当量）分批1小时。继续下ŧ搅拌混合物他相同的反应条件下18小时。
         注: 叔丁基-2-溴-4-（4-硝基苯基）丁酸根据先前公布的程序⁸由4-（4-硝基苯基） -丁酸，亚硫酰氯和溴制备。
      3. 通过球对球真空蒸馏的手段在^40-60℃9除去DMF。

结果

DCA的制备包括两个阶段:1）的单体的DOTA型螯合剂的合成（ 图1）和2）与G4 PAMAM树枝状聚合物和树枝状钆（III）络合物的后续制备螯合剂的耦合（ 图2） 。在第一阶段，制备含有四个羧酸的基于CYCLEN-DOTA型螯合剂和适合于进一步合成修饰的正交基。从1（DO3A- 叔丁基酯^）7开始制备，这是烷基化叔丁基2-溴-4-（4-硝基苯基）丁⁸提供DOTA衍生物2。钯催化氢化还原芳族硝基在2得到苯胺3。的3与二氯硫化碳的转换导致的异硫氰酸酯4，which的先前用作树枝状的CA ¹⁷的制备的胺反应剂。

讨论

所述树枝状MRI造影剂的制备需要的单体单元的适当选择（ 即，螯合剂为钆（III））。它们减少这种顺磁性离子的毒性，迄今为止，各种各样的无环的和大环螯合剂用于此目的^1-3。在这些中，大环DOTA型螯合剂具有最高热力学稳定性和动力学惰性的，因此，是惰性MRI造影剂^1,18的制剂最优选的选择。此外，它们易发生各种合成转化，这导致双官能螯合剂，能够链接到各种功能分子（ 例如，靶向载体或纳米载体），同时仍形成稳定的Gd（III）络合物^19。为此，在此过程中所描述的DOTA型单体单元是从DO3A- 叔丁基酯，公共的和容易得到的前体，和的溴衍生物制备的4-（4-硝基苯基）丁酸。这种分子是从DOTA衍生的并具有相似的结构，以协调的Gd（Ⅲ）。合成修改的目的是使该螯合剂容易耦合到各种功能分子和运营商的反应。即，在螯合剂DOTA的改性分子结果的制备仍然使用可协调到钆4羧基（Ⅲ），以形成一种惰性复杂和正交硝基苯基，其在转换重视这个螯合剂到树枝状聚合物的表面。此过程还允许在正交反应性基团的选择的灵活性（ 例如，NH

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cyclen	CheMatech	C002
tert-溴乙酸丁酯	Alfa Aesar	A14917<
em>N，N-二甲基甲酰胺	Fluka	40248
碳酸钾	Sigma-Aldrich	209619
4-（4-硝基苯基）丁酸	Aldrich	335339
氯化亚砜	Acros Organics	382662500	注意：腐蚀性物质;如果吸入溴有毒
	Acros Organics	402841000	注意：会导致严重的皮肤灼伤，如果吸入会致命
二乙醚	任何来源
硫酸钠	Acros Organics	196640010
氯仿	VWR Chemicals	22711.29
ter-丁基 2,2,2-三氯乙酰胺酸	酯 Aldrich	364789	注：易燃物质;对皮肤和眼睛有刺激
氟化硼醚酸盐	Acros Organics	174560250	48% BF3。注意：易燃物质;导致皮肤灼伤，吸入致命
碳酸氢钠	Acros 有机物	424270010
乙酸乙酯	任何来源		柱色谱
n-己烷	任何来源		柱色谱
球对球 （Kugelrohr） 蒸馏仪	Büchi		型号类型：玻璃烘箱 B-585
硅胶	Carl Roth GmbH	P090.2
甲醇	任何来源		用于柱色谱
二氯甲烷	任何来源		柱色谱
乙醇	VWR 化学品	20821.296
氨	Acros 有机物	428381000	7 N 甲醇溶液
钯	Aldrich	643181	15% 湿
法氢化装置 PARR	PARR 仪器公司
Celite 503	Aldrich	22151
烧结玻璃漏斗	任何来源
Thiophosgen	Aldrich	115150	注意：对皮肤有刺激性;吸入有毒
三乙胺	Alfa Aesar	A12646
二氯甲烷	Acros Organics	348460010	Extra Dry
磁力搅拌器	，任何来源
PAMAM G4 树状大分子	Andrews ChemService	AuCS - 297	10% wt. 溶于甲醇
脂肪膜 Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
薄层色谱板	Merck Millipore	1.05554.0001
甲酸	VWR Chemicals	20318.297
Lophylizer	任意来源
氯化铵（III） 六水合	Aldrich	G7532
氢氧化钠	Acros Organics	134070010
pH 计	任意来源
乙二胺四乙酸二钠盐二水合	Aldrich	E5134
质谱仪 （ESI）	安捷伦		离子疏水阀 SL 1100
醋酸盐缓冲液	任何来源		pH 5.8
二甲酚橙	Aldrich	52097	20 &μ;M in acetate 缓冲液
Hydrophylic Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 离心过滤装置	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 膜 （MWCO 3000）
离心	任何来源
NMR 波谱仪	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		Version 2.1
燃烧分析仪	EuroVector SpA		EuroEA 3000 元素分析仪
MALDI-ToF MS 仪器	Applied Biosystems		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-丁醇	Carl Roth GmbH	AE16.1
涡旋混合器	，任何来源
Norell，NMR 管	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR 同轴管	Deutero GmbH	coaxialb-5-7
DLS 仪器	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE 过滤器	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
塑料管小瓶	，任何来源
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
MRI 扫描仪	Bruker		BioSpec 70/30 USR 磁体 （7 T）。注意：与高磁场相关的潜在危险
射频线圈	布鲁克		双频体积线圈 （RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR）
Paravision（软件）	布鲁克		5.1 版