全血中自然杀伤细胞溶细胞活性的流式细胞术分析

摘要

本研究介绍了一种用于准确、快速测定人血液样本中自然杀伤（NK）细胞数量及NK细胞毒性的先进工作流程。

摘要

NK细胞毒性是广泛用于评估外界干预对NK细胞功能影响的指标。然而，该检测的准确性和可重复性可能不稳定，原因可能是操作者误差，也可能是NK细胞对实验操作的高度敏感性。为消除这些问题，本文建立并展示了一种可将上述因素影响降至最低的工作流程。作为示例，我们从经历高强度运动的跑步者（n = 4）在不同时间点采集了血液样本。首先，直接从全血中（仅需一毫升或更少）通过CD56标记及基于磁珠的分选技术，同时实现NK细胞的识别与分离。分选后的NK细胞可去除所有试剂及封闭性抗体，并进行计数，以确定每毫升血液中准确的NK细胞数量。其次，将分选得到的NK细胞（效应细胞，E）与3,3'-二辛基氧羰花青高氯酸盐（DiO）标记的K562细胞（靶细胞，T）以1:5（T:E）的最佳检测比例混合，并利用成像流式细胞仪进行分析，该仪器可对每个事件进行可视化观察，从而排除任何假阳性或假阴性结果（如双联体或效应细胞自身信号）。该工作流程约需4小时即可完成，即使处理人源样本也能获得高度稳定的结果。在条件允许的情况下，研究团队可在人体受试者中测试多种实验干预措施，并在多个时间点之间进行比较分析，而不会影响数据的完整性。

引言

自然杀伤细胞是先天免疫系统的重要组成部分。尽管其活性受到严格调控，但它们能够通过细胞间直接接触、无需预先活化即可识别并清除异常细胞¹。因此，它们构成了抵御感染的快速防御屏障。研究表明，运动尤其是剧烈运动，会暂时性抑制免疫系统功能^2,3,4,5。自然杀伤细胞对此效应尤为敏感^4,6,7，从而导致机体在一段时间内对疾病易感性增加。因此，研究在剧烈运动前、中或后采取干预措施以减轻其对自然杀伤细胞功能的影响，对于运动员赛后的健康具有重要意义。

然而，此类干预措施的研究受到多种因素的复杂影响：1) NK细胞数量稀少⁸，约占白细胞总数的1%；2) NK细胞对压力极为敏感，依赖于持续暴露在生理条件下，才能在实验过程中保持活性和稳定性；3) 用于检测NK细胞杀伤活性的标准检测方法，如Ficoll梯度离心法⁹和释放实验¹⁰，存在不可靠和结果不一致的问题。人类样本本身存在的固有变异性进一步加剧了这些挑战。在干预过程中采集的新鲜人体样本受到较为严格的监管，获取困难，至少与动物样本或永生化细胞系相比是如此。这限制了重复实验的机会，也难以增加研究队列中的受试者数量以达到显著的统计学阈值。综上所述，这些因素凸显了建立一种标准化流程的必要性，该流程应能够对人源样本中NK细胞的裂解活性进行高通量且高可靠性的分析。

我们建立了一种工作流程，可缩短从人全血中鉴定、分离和检测自然杀伤细胞（NK细胞）所需的时间，同时最大限度地减少细胞暴露于外源性因素。该方法优化了磁性细胞分选仪和成像流式细胞仪两种仪器的使用，并采用针对特定检测的优化效靶比（T:E比），以实现对NK细胞细胞毒活性增强或减弱的检测。

方案

注意：所有血液采集程序均按照阿巴拉契亚州立大学（ASU）机构审查委员会（IRB）制定的指南进行。

1. 全血采集

1. 由经过认证的采血员按照世界卫生组织的指南采集血液。
2. 将血液采集至一支含有二钾乙二胺四乙酸（K₂EDTA）的4 ml采血管中。根据制造商说明轻轻颠倒混匀采血管。将采血管置于室温下的台式摇床上，直至进行分离处理。

2. DiO标记靶细胞的制备

1. 在进行实验前数周，将K562细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的完全Iscove改良杜尔贝科培养基（IMDM）中，以确保细胞状态良好。调整细胞浓度至3 × 10⁶ cells/mL⁵ 每天通过细胞计数和后续传代维持细胞密度为 cells/mL。每2至3天进行一次完全换液。
2. 在检测当天，使用1:1稀释的血细胞计数板进行细胞计数。
   1. 从K562培养瓶中取出10 µL，放入1.5 mL离心管中。
   2. 加入10 µL台盼蓝染料至同一1.5 ml离心管中，使稀释倍数为1:1。
   3. 轻轻弹击离心管，使 K562 细胞与台盼蓝染料混匀。
   4. 让K562细胞与台盼蓝染料在室温下孵育1分钟。
   5. 从管中取出15 µL染色的K562细胞。
   6. 用移液器将样品滴加到血细胞计数板上进行细胞计数。
   7. 计数四个角的方格以及中央的方格，共五个方格。
   8. 使用以下公式计算细胞数量：
      每毫升总细胞数 =（计数的总细胞数 × 稀释倍数 / 计数方格数）× 10,000/mL
3. 将K562靶细胞重悬，调整终浓度为1 x 10⁶个/mL⁶ 细胞/ml，置于无血清 IMDM 培养基中。
4. 对于未染色的K562靶细胞，取10 mL密度为1 × 10⁶个/mL的K562靶细胞加入一个15 mL离心管中⁶ 细胞/mL，总计10 × 10⁶ K562 细胞。置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中₂ 直至使用前
5. 对于DiO染色的K562靶细胞，取10 mL密度为1 × 10⁶个/mL的K562靶细胞加入一个15 mL离心管中⁶ 细胞/mL，总计10 × 10⁶ K562 细胞
   1. 在指定用于DiO染色的15 ml离心管中，每1 mL细胞悬液加入1 µL DiO细胞标记溶液，并轻轻涡旋混匀。例如，向10 x 10⁶个细胞的悬液中加入10 µL DiO细胞标记溶液。⁶ K562 细胞/ml，体积为 1 × 10⁶ cells/mL
   2. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育K562-DiO溶液20分钟₂ 在15 ml离心管中。
6. 孵育后，向含有K562-DiO溶液的15 ml离心管中加入3 ml室温磷酸盐缓冲液（PBS）。
7. 室温下以135 × g离心10分钟。
8. 使用1,000 µl可调移液器小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀。
9. 向含有细胞沉淀的15 mL离心管中加入10 mL新鲜IMDM。
10. 轻轻涡旋振荡管子以重悬细胞。
11. 重复步骤 2.7 至 2.10 两次。
12. 将细胞置于含5% CO₂的37 °C培养箱中保存₂ 直至使用前
    注意：细胞可在培养箱中保存最多24小时，但最好在同一天内使用。

3. 对照组的制备

1. 将以下成分分别转移至已做好相应标记的 1.5 ml 离心管中：
   1. 向标记为“双阳性”的 1.5 mL 管中加入含重悬 DiO 标记 K562 细胞的新鲜 IMDM 500 µL。
   2. 向标记为“仅 DiO”的 1.5 mL 管中加入含重悬 DiO 标记 K562 细胞的新鲜 IMDM 500 µL。
   3. 向标记为“仅碘化丙啶 (PI)”的 1.5 mL 管中加入含重悬未标记 K562 细胞的新鲜 IMDM 500 µL。
2. 将双阳性管和仅 PI 管置于 55 °C 水浴中 5 分钟。
3. 5 分钟后，取出离心管并用 70% 乙醇擦拭管壁。
4. 向双阳性管和仅 PI 的 1.5 mL 管中各加入 10 µL PI。
5. 将全部三个 K562 靶细胞对照管放入 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
6. 30 分钟孵育结束后，以 163 × g 离心 2 分钟，沉淀全部三个 K562 靶细胞对照样本。
7. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
8. 每份对照样本用 20 µL 新鲜 IMDM 细胞培养基重悬，并置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中至少孵育 30 分钟，以获得最佳 DiO 荧光信号。
   注意：此时对照样本已准备好用于成像流式细胞仪检测。

4. NK 细胞自动化分离

1. 开启细胞分选仪，并等待启动程序完成。
2. 确保所有液体瓶的指示灯均为绿色，且废液瓶为空。
3. 准备一个室温下的15 mL试管架。
   注意：试管架的选择依据样本体积而定。例如，若样本体积小于3 mL，使用15 mL试管架；若体积大于3 mL，则使用50 mL试管架。
4. 根据样本（每位参与者）进行相应标记：参与者1全血样本；参与者1阴性组分；参与者1阳性组分。
5. 从步骤1.2中轻轻吸取1.5 mL全血，加入标记为“全血样本”的15 mL试管中。
6. 将步骤4.5中标记好的15 mL“全血样本”试管，以及步骤4.4中标记的15 mL“阴性组分”和“阳性组分”试管放入试管架中。按以下样本架布局放置：第1行（R1）A列：全血样本，第2行（R2）B列：阴性未标记组分，第4行（R4）C列：阳性磁标记组分。
7. 将分选架插入MiniSampler中以进行自动标记。
8. 在菜单中选择“试剂”，并高亮显示试剂瓶在分选架中的放置位置。
9. 选择“读取试剂”以激活二维码读取器。
10. 将相应的试剂瓶置于二维码读取器前方，距离读码器盖0.5–2.5 cm处。
    注意：例如，NK细胞分离所需的试剂为CD56。
11. 将试剂瓶以一定倾斜角度持于二维码读取器前方，以获得最佳读取效果。
12. 将试剂瓶放入分选架的正确位置。
13. 在屏幕上的“分离”选项卡下，高亮选择所需的位置。
14. 在“标记”子菜单中，指定一个自动标记程序。
15. 将细胞分选试剂CD56 MicroBeads分配至分选架的1、2、3和4号位置。
16. 选择“posselwb”分离程序。
17. 选择“rinse”洗涤程序。
18. 使用数字键盘在“体积”子菜单中输入1,500 µL的样本体积。
19. 在数字键盘上选择“Enter”（确认）选项。
20. 选择“Run”（运行）以启动细胞分离过程。
21. 选择“OK”（确定）以确认有足够的缓冲液用于处理所有样本。

5. 细胞分离后自然杀伤细胞计数

1. 使用细胞分选仪完成细胞分离后，立即收集阳性组分，室温放置。该组分含有目标的纯化自然杀伤细胞（NK细胞）群体。
2. 针对每个单独样本，按照步骤2.2的方法，使用血细胞计数板进行细胞计数。
   1. 完成计算后，记录细胞数量。

6. 细胞毒性检测样品制备

1. 根据每个样本/参与者的情况，准备并标记相应的 1.5 mL 离心管。
2. 将所需比例的 NK 细胞和 DiO 标记的 K562 细胞用移液器加入各离心管中。
   注意：例如，K562 靶细胞与 NK 效应细胞的所需比例为 1:5。
3. 在 135 × g 条件下离心 5 分钟。
4. 小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。
5. 用 500 µL 不含白细胞介素-2（IL-2）和 2-巯基乙醇（2-ME）的 NK 细胞培养基（不完全 NK 细胞培养基）重悬 NK 细胞与 DiO 标记的 K562 细胞混合物。
   注意：不完全 NK 细胞培养基为含碳酸氢钠的 Eagle 最低必需培养基，不含 L-谷氨酰胺、核糖核苷和脱氧核糖核苷。
6. 向每管中加入 5 µL 碘化丙啶（PI）。
7. 在 163 × g 条件下离心 2 分钟。
8. 将细胞在 37 °C 下孵育 2 小时。
9. 孵育 2 小时后，在 163 × g 条件下离心 2 分钟。
10. 小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。
11. 用 25 µL 不完全 NK 细胞培养基重悬细胞。

7. 自发性（“S”）样本的制备

1. 取500 µl DiO标记的K562细胞（浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL）加入1.5 mL离心管中。
2. 向每管中加入10 µL碘化丙啶（PI）。
3. 以163 × g离心2分钟。
4. 将细胞在37 °C孵育2小时。
5. 孵育2小时后，以163 × g离心2分钟。
6. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
7. 用25 µl不完全α-最低必需培养基（α-MEM）细胞培养液重悬细胞。

8. 使用成像流式细胞仪进行数据采集

1. 按下成像流式细胞仪前门内的绿色按钮，以开启仪器。
2. 打开与成像流式细胞仪相关联的所有计算机。
3. 启动成像流式细胞仪软件。
4. 点击“启动”按钮，以冲洗系统并准备样品管路。
5. “启动”完成后，关闭“校准”窗口。
6. 分配通道：在左上角依次点击每个通道以进行分配。
7. 在右侧点击散点图按钮，创建4个散点图：Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06、Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02、Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 以及 FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01。
8. 首先使用“双阳性”对照开始分析样品。
   1. 点击“加载”。
   2. 将步骤3.4至3.9中制备的“双阳性”样品置于1.5 ml离心管中，放入样品加载器。
   3. 在“放大倍数”选项卡下选择40X物镜。
   4. 打开405 mW和642 mW激光器。
   5. 打开“明场”通道。
   6. 点击“选择强度”。
   7. 根据“双阳性”对照样品，确定405 mW激光器的理想强度，以避免探测器过载。
      注意：例如，本实验的最佳强度设置为11 mW。
9. 在完成所需设置后，开始采集数据。
   1. 在“文件采集”选项卡下，输入自定义文件名文本，并选择用于保存数据文件的文件夹。
   2. 在“采集”旁边输入需要采集的细胞数量。通常该数值在1,000至10,000之间。
   3. 点击“采集”。
      注意：当达到所需细胞数量后，数据文件将自动保存至先前选定的文件夹中。
10. 采集完成后，加载下一个对照样品——仅DiO对照。
    1. 点击“加载”。
    2. 将含有“仅DiO”样品的1.5 mL离心管放入样品加载器。
    3. 保持“放大倍数”选项卡下40X物镜的选中状态。
    4. 保持405 mW激光器开启。
    5. 关闭642 mW激光器和“明场”通道。
       注意：现在已完成所需设置，可以开始采集数据。
    6. 在“文件采集”选项卡下，输入自定义文件名文本并选择用于保存数据文件的文件夹。在“采集”旁边输入需要采集的细胞数量。通常该数值为1,000。
    7. 点击“采集”。
       注意：当达到所需细胞数量后，数据文件将自动保存至先前选定的文件夹中。
11. 对“仅PI”对照样品重复步骤8.10。实验样品现已准备就绪，可进行采集。
12. 按以下方式处理其余实验样品，包括“自发性‘S’样品”：
    1. 保持“放大倍数”选项卡下40X物镜的选中状态。
    2. 打开405 mW和642 mW激光器。
    3. 打开“明场”通道。
    4. 点击“设置强度”。
    5. 在“文件采集”选项卡下，输入自定义文件名文本，并选择用于保存数据文件的文件夹。再次输入自定义文件名文本。
    6. 在“采集”旁边输入需要采集的细胞数量。
    7. 点击“采集”按钮。
       注意：当达到所需细胞数量后，数据文件将自动保存至先前选定的文件夹中。
13. 对所有实验样品重复步骤8.12。
14. 在所有实验数据和文件采集完成后，点击“关机”按钮以对系统进行灭菌处理。

9. 成像流式细胞仪样本分析

1. 打开成像流式细胞仪分析软件应用程序。
2. 在“文件”下，打开一个实验用的 .RIF 文件。
3. 在成像流式细胞仪软件的“补偿”选项卡中，选择“创建新矩阵”，使用单色 .RIF 文件（DiO 单独对照和 PI 单独对照，于步骤 8.10 和 8.11 中创建）构建一个新的矩阵。
   注意：软件将提示选择单色文件，并将其合并以生成一个矩阵文件（.ctm 扩展名），该文件需被选中以应用通道补偿。
4. 使用软件的“构建模块”功能创建散点图。
   1. 创建一个散点图（BrightFieldGradient_RMS 对 频率），用于圈选聚焦良好的细胞。将此门命名为“Focus”（图 1A）。
   2. 利用“Focus”门，创建一个明场面积（Bright Field Area）对明场长宽比（Bright Field Aspect Ratio）的散点图，用于圈选单细胞群体。将此门命名为“Single”（图 1B）。
   3. 利用“Single”门，创建一个 Intensity_MC_Ch02 对 Intensity_MC_Ch5 的散点图。使用该图识别并圈选仅 DiO 阳性的细胞（靶细胞，存活）以及 PI 和 DiO 双阳性的细胞（靶细胞，死亡）（图 1C）。
      注意：步骤 9.4.1、9.4.2 和 9.4.3 中描述的所有图均可通过软件的“构建模块”功能创建。
5. 点击散点图的统计功能，以获取每个门内的细胞数量。
6. 使用以下公式计算自发释放样本和实验样本中死亡靶细胞的百分比：
   样本中死亡靶细胞百分比 = （死亡靶细胞数 × 100）/（存活靶细胞数 + 死亡靶细胞数）
7. 使用以下公式计算细胞毒性：
   细胞毒性百分比 = [（实验组死亡率 - 自发释放组死亡率）/（100 - 自发释放组死亡率）] × 100

图1：细胞毒活性分析的代表性直方图、散点图和图像。（A）聚焦细胞分析。（B）单细胞分析。（C）靶细胞染色分析。所有判断均基于每个事件所附的图像进行，可在分析软件中通过直接点击图中的事件来查看。（D）双联事件的代表性图像，显示一个凋亡的NK细胞和一个活的K562靶细胞。Ch01，明场；Ch02，DiO；Ch05，PI。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

NK细胞数量的测定
采用图2中所述的运动方案，测定高强度跑步对全血中NK细胞数量的影响。分别在运动前、运动结束后即刻、运动后1.5小时，以及初次采血后24小时和48小时采集血样。对每位受试跑者（图3A）及各时间点的平均值（图3B），测定每毫升全血中NK细胞的浓度。

我们的结果（图3A）显示，跑者1、2和4表现出相似的模式：运动后自然杀伤细胞（NK细胞）数量略有上升，随后立即出现急剧下降，之后在24小时和48小时后逐渐恢复至正常水平。通过绘制跑者群体NK细胞数量的平均值，这一趋势尤为明显，但与运动前水平相比无显著差异。跑者3初始NK细胞数量非常高，运动后及运动后1.5小时急剧下降，之后在24小时和48小时后逐渐恢复至正常水平。总体而言，NK细胞数量（图3B）在运动后1.5小时有所...

讨论

本研究中描述的方法可直接测量个体自然杀伤细胞（NK细胞）在受到刺激（在本特定情况下为长时间运动）后的特异性活性。通常，NK细胞是通过密度梯度离心法或利用多种标记物组合进行细胞分选从血液中分离得到的。尽管这些方法被广泛使用，但仍存在诸多缺点：耗时较长、涉及多个操作步骤，且高度依赖操作者技术。因此，分离出的NK细胞会承受过度的应激，可能导致实验间甚至同一实验内结果的变异性增加。本文中，我们介绍了一种基于磁珠分离的技术方案。该方法能够快速、可靠地从个体全血中分选出大量NK细胞，同时最大限度地减少对血液或NK细胞的操作干预。

该方法特别适用于样本稀少的人体研究，但反过来说，当需要同时处理大量样本时，该方法会变得相当困难。事实上，细胞毒性检测的采集窗口通常必须在孵育结束后30分钟内完成，根据我们的经验，这意味着每次最多处理5个样本。如果需要处理大量样本，则必须制定分批进行的时间安排，以确保有足够的时间完成流式细胞术的数据采集。该方法的另一个缺点可能是试剂成本较高，若为获得更高数量的自然杀伤细胞而处理较大量的血液，试剂消耗会很快。然而，我们认为，这些成本被所节省的大量时间所平衡。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
K-562 淋巴母细胞	ATCC	CCL-243
Isco​​ve 改良杜尔贝科培养基	ATCC	30-2005	高葡萄糖，含 L-谷氨酰胺，含 HEPES，无菌过滤
α 最低必需培养基	ATCC	CRL-2407	不含核糖核苷和脱氧核糖核苷，但含 2 mM L-谷氨酰胺和 1.5 g/L 碳酸氢钠
0.4% 台盼蓝溶液	Amresco	K940-100ML	组织培养级
碘化丙啶染色液	BD Pharmingen	51-66211E
Vybranto DiO 细胞标记溶液	Vybranto	V-22886
autoMACS Pro 分离仪	Miltenyi Biotec	130-092-545
autoMACS 运行缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221
autoMACS 洗涤缓冲液	Miltenyi Biotec	130-092-987
autoMACS 柱	Miltenyi Biotec	130-021-101
全血 CD56 微珠，人源	Miltenyi Biotec	130-090-875
ImageStream X Mark II 成像流式细胞仪	EMD Millipore
Speedbeads	Amnis Corporation	400030
0.4–0.7% 次氯酸盐（消毒剂）	VWR	JT9416-1
Coulter Clenz	Beckman Coulter	8546929
70% 异丙醇（消泡剂）	EMD Millipore	1.3704
D-PBS（鞘液）	EMD Millipore	BSS-1006-B (1X)	不含钙或镁
INSPIRE 软件	EMD Millipore		Mark II 版本，2013 年 9 月
Ideas 应用软件	EMD Millipore		6.1 版本，2014 年 7 月