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利用3D打印技术融合MRI与组织学：一种脑切片方案

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DOI：

10.3791/54780

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2016年12月6日

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1Translational Neuroradiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Cerebral Microcirculation Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Viral Immunology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke

本文内容

摘要

本实验方案的总体目标是通过制备定制的3D打印脑组织固定装置和切片盒，精确地将磁共振成像（MRI）图像数据与组织学切片进行配准。

摘要

磁共振成像（MRI）能够在宏观尺度上区分正常与异常组织，并对整个组织体积进行三维采样。尽管MRI在检测组织异常方面极为敏感，但将信号变化与潜在的病理过程相关联通常并不直接。例如在中枢神经系统中，炎症、脱髓鞘、轴突损伤、胶质增生和神经元死亡在MRI上均可表现为相似的影像学表现。因此，MRI扫描的解读依赖于具体背景，放射学与组织病理学之间的对应关系因而至关重要。然而，传统的脑组织病理切片往往不够精确且不一致，从而增加了组织学切片与MRI之间比对的难度。本文介绍了一种精确切取灵长类动物脑组织的新方法，从而实现组织学与MRI之间的精准匹配。本文详述的实验方案将有助于研究人员应用该方法，其核心在于使用3D打印的脑组织切片模具。该方法经轻微修改后，可轻松应用于其他物种的脑组织，包括人类。

引言

在体 MRI 可在宏观层面提供一种无创且敏感的组织完整性检测方法。观察到的 MRI 信号强度变化 体内 是许多正在进行的临床试验中的结局指标。1 尽管通过磁共振成像观察到的信号强度变化能够在全脑背景下识别异常区域，但其特异性通常不足以区分不同的病理过程，尤其在涉及多种病理变化的动态过程中更是如此。例如，在多发性硬化症（MS）或其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中，炎症、水肿、髓鞘降解、轴突破坏、胶质增生和神经元死亡等病理过程相互重叠。 2, 3 为了获得有关潜在病理的必要特异性，必须结合MRI所识别的异常组织的组织学知识，并考虑其背景情况。

然而，即使在严格控制的动物实验中，由于多种原因，将组织学与体内 MRI 进行匹配在本质上仍具有挑战性。首先，组织学切片与 MRI 之间的尺寸尺度差异可达几个数量级。4 其次，为了进行恰当的比较，MRI 切片平面的方向必须与脑组织切片时的切面方向一致。由于脑的形状复杂，当脑组织置于平坦表面时，很难 consistently 制备出笔直且精确的切面。第三，相对于潜在的小目标区域（如病灶、肿瘤等），脑组织体积较大，这给处理组织的病理学家带来了“大海捞针”般的困难。第四，即使找到了目标组织，其后续处理方式通常也使得与原始 MRI 数据建立对应关系几乎不可能。最后，传统的脑组织病理切片方法往往不够精确且缺乏一致性，进一步加剧了组织学切片与 MRI 图像之间比对的复杂性。

此前为应对这些挑战所做的尝试，主要依赖于使用形变算法对数据进行共配准和/或在组织内部或周围放置基准标记物作为参考。5, 6, 7, 8 前一种方法需要复杂的计算模型，而这些模型特别容易受到数据格式、成像伪影以及组织处理过程中所引起变化的干扰。4 而后一种方法则存在污染或以其他方式损伤组织本身的风险。9

此处所述的方法通过使用死后磁共振成像（postmortem MRI）弥合不同成像模式之间的差距，从而改善模态间的过渡 体内 磁共振成像与组织学。死后磁共振成像可提供脑部的三维（3D）图像，其分辨率高于活体成像所能达到的水平 体内 此外，该方法还提供了生成大脑表面形态准确模型所需的数据。该数字模型可用于3D打印定制的大脑固定装置。通过精确定位，该大脑固定装置可实现基于MRI定位的精确脑切片，减少对复杂数学算法的依赖，并支持针对特定区域进行靶向取样。

我们实验室最近引入了一种利用死后 MRI 和 3D 打印技术为人类定制脑组织固定装置和切片工具的新方法10 和狨猴大脑。4 这两种方法有助于在研究环境中更准确地建立磁共振成像（MRI）与组织学之间的相关性，最终加深对MRI异常所对应特定病理改变的理解。通过精心设计的实验，对大脑在不同时间点进行多次取样 体内，可为病理学结果的解读提供背景信息，进而提高对MRI结果解读的特异性。本文介绍了一种经过改进的、统一框架下的实验方案，适用于任何类型的脑组织，无论其来源于非人灵长类动物、啮齿类动物还是人类。我们提供了详细的实验步骤以及相应的视频，以指导狨猴脑组织的切片操作。尽管整体方案适用于各类脑组织，但由于不同脑组织在MRI采集条件、组织尺寸以及实际操作中所面临挑战的差异，针对不同类型脑组织在具体操作上存在一定区别。在本文中，标注为“人类”的部分将特指适用于人类脑组织的方案差异。

方案

本文所述的所有动物操作和实验程序均按照国家神经疾病与卒中研究所动物护理与使用委员会批准的方案进行。脑组织取自诱导产生实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的普通狨猴（Callithrix jacchus）11。动物经4%多聚甲醛心脏灌注安乐死后，脑组织在10%福尔马林中保存，保存时间介于3周至1年之间。

1. 尸检磁共振成像的准备与采集

  1. 狨猴大脑
    1. 准备一个工作台，配备棉纱布、一个50 ml离心管、小刮勺、约30 ml氟化油、石蜡以及狨猴脑组织。
    2. 将氟化油和纱布填充至试管20 ml刻度处，填充过程中压缩纱布以去除气泡。
    3. 用纸巾轻轻擦干脑组织表面的福尔马林。将脑组织前端朝下放入管中。用纱布小心地围绕脑组织四周固定其位置，确保其在管内稳定。如需进行额外的磁共振成像扫描，可参考补充部分11中关于制作脑部MRI支架的方法。
    4. 用纱布和氟化油填满试管的剩余部分。操作过程中小心去除气泡。拧紧管盖，并用石蜡密封试管。
    5. 用记号标记帽盖与大脑半球间裂对齐的位置。用纸巾包裹导管，并将其插入线圈中，使标记位于顶部中央。
    6. 获取二维自旋回波T2图像。参数见表1。
    7. 打开 Mipav 中的 10 个解剖学 150 微米 T2 加权图像序列，并将其配准至第 6 个th 采集
      注意：配准采用一种优化的自动配准3.5D算法，具有9个自由度，使用窗口化sinc插值和归一化互相关代价函数，并调用Powell结合Brent搜索算法。旋转角度采样范围为+10°至-10°，粗配准以5°为增量，细配准以1°为增量。随后对配准后的图像进行平均：实用工具，图像计算器—批量图像，平均。
  2. 人脑
    1. 在中脑水平处进行切割，将前脑与脑干分离。10 也可沿中线切割将半球分离。
    2. 将前脑置于一个圆柱形管中，该管一端为半球形穹顶，另一端为管口。
    3. 通过管口注入氟化油至管中。通过管口施加轻柔的负压抽吸约30分钟，以去除气泡。
    4. 获取3D T1-MPRAGE图像。参数见表1。

2. 提取脑表面：Mipav 7.2

  1. 以冠状面方向打开 MRI 图像。
  2. 选择“算法”→“变换工具”→“变换”→“重采样”。选择“自定义尺寸”，并将体素重采样为各向同性：0.1 × 0.1 × 0.1 mm。将重采样后的 MRI 保存为 Brain_MRI_Resampled。人类样本：将体素重采样为各向同性 0.3 × 0.3 × 0.3 mm。
  3. 选择“算法”→“滤波器（空间）”→“非线性降噪”。使用默认设置，点击“确定”。
  4. 选择“显示查找表”，然后点击双阈值按钮。拖动图中滑块以覆盖整个脑部区域。
  5. 选择“算法”→“分割”→“阈值”→“使用最小/最大值进行阈值分割”。将强度图左下角（刻度正下方）的数值输入到"下限"框中。在输出图像类型中选择"二值"，并取消勾选"反转阈值"。
  6. 选择“算法”→“形态学”→“填充孔洞”。勾选"在 2.5D 中处理"。
  7. 由于这是全脑的 MRI 图像，脑干与大脑皮层之间存在一些需要填充的空隙。人类脑部：跳过此步骤。
    1. 使用线状感兴趣区域（VOI），在脑部两侧最外侧位置绘制连接脑干与大脑皮层的线条，并贯穿整个脑部继续绘制。
    2. 选择“VOI”→“VOI 转换”→“全部转为二值掩膜”。选择“工具”→“图像计算器”。在操作符下拉菜单中选择“OR”，并选择脑部掩膜图像。勾选"提升目标图像类型"。
    3. 选择“算法”→“形态学”→“填充孔洞”。勾选"在 2.5D 中处理"。
  8. 将二值掩膜保存为 Brain_Model.nii。
  9. 选择“算法”→“提取表面（ marching cubes 算法）”。选择掩膜图像，保存为 Brain_Model.ply。

3. 选择切片位置：Mipav 7.2

  1. 确定目标组织或起始位置。计算预期的切片厚度。在狨猴脑中，每节包含30个MRI切片，刀片间隙对应5个MRI切片，可形成3 mm厚的组织节段和0.5 mm的刀片间隙，最终得到约3.5 mm厚的组织块；在人脑中，每节包含20个MRI切片，刀片间隙对应4个MRI切片，可形成6 mm厚的组织节段和1.2 mm的刀片间隙，最终得到约7.2 mm厚的组织块。
  2. 在第一个刀片间隙的位置，点击"box VOI"，然后在脑组织上绘制一个方框。点击框内以选中该区域。将对应于刀片间隙的每个MRI切片的轮廓复制并粘贴。
  3. 向前跳转至对应于组织节段厚度的MRI切片数量处，复制并粘贴下一个刀片间隙对应的轮廓。在整个脑组织范围内重复此过程。
  4. 选择VOI、VOI转换、全部转为二值掩膜。保存为Blade_Gaps.nii。
  5. 选择算法、提取表面（行进立方体法）、掩膜图像，输出为Blade_Gaps.ply。

4. 创建 MRI Blade 图像：Mipav 7.2

  1. 打开 Brain_MRI_Resampled 和 Blade_Gaps.nii 图像。
  2. 选中 Blade_Gaps.nii 图像后，选择“Utilities”（实用工具）中的“Image Math”（图像数学）。选择“Promote image type”（提升图像类型）和“Multiply”（乘法），输入值为 10,000。
  3. 选择“Utilities”（实用工具）中的“Image Calculator”（图像计算器）。选择“Add”（加法），然后从图像下拉框中选择 Brain_MRI_Resampled 图像。勾选“Promote destination image type”（提升目标图像类型）。
  4. 将此图像保存为 Brain_BladeMap.nii。
  5. 通过点击“Triplanar view”（三平面视图），可在三个正交视图中查看脑部切片的位置。

5. 导入脑组织与刀片间隙表面：Netfabb Professional

  1. 选择部件，添加部件。选择文件 Brain_Model.ply 和 Blade_Gaps.ply
  2. 选中脑模型，点击修复模式。在修复模式下：
    1. 点击壳体选择按钮，然后点击脑模型。
    2. 点击反向选择按钮以选中其他网格。点击删除以移除其他网格。
    3. 点击应用修复，然后移除旧部件。
  3. 右键点击脑模型，选择移动。点击“移至原点”按钮，记录出现的 XYZ 参数。这些平移参数用于保持在 Mipav 中设定的刀片位置。点击平移，然后关闭窗口。（请勿多次点击平移，否则会使用相同参数再次平移。）
  4. 选择 Blade_Gaps 模型。右键点击该部件，选择移动。在 XYZ 参数框中输入之前记录的 XYZ 值。然后点击平移并关闭窗口。
  5. 选择 Brain_Model 模型，点击修复模式。在修复模式下：
    1. 点击壳体选择按钮，然后点击脑模型。
    2. 右键选择平滑三角面，输入 4–5 次迭代。勾选防止体积收缩。人脑模型：1–2 次迭代。
    3. 右键选择减少三角面，在目标三角面数中输入 200000，然后点击执行。
    4. 点击自动修复，选择默认修复，然后点击应用修复。
  6. 右键点击，重命名。将平滑后的脑模型重命名为 Smoothed_Brain_Model。
  7. 选择 Smoothed_Brain_Model，右键点击，导出为 STL 格式。

6. 编辑脑部轮廓：Meshmixer

  1. 将 Smoothed_Brain_Model 导入 Meshmixer。
  2. 使用雕刻和选择工具对网格进行调整。编辑内容包括：
    1. 使用雕刻工具中的“Robust smooth”功能，平滑对应于线状 VOI 区域的表面。人脑模型：跳过此步骤。
    2. 平滑将在盒中朝下的皮层表面。
    3. 消除在网格生成和编辑过程中可能产生的微小凹陷。
  3. 选择“Analysis”（分析）→“Inspector”（检查器）→“Autorepair all”（自动修复全部）。
  4. 将 Smoothed_Brain_Model 另存为 Smoothed_Edited_Brain_Model。

7. 创建脑切片盒：Netfabb 专业版

  1. 选择部件，添加部件。选择文件 平滑处理后的编辑脑模型.
  2. 选择部件，添加部件，然后选择 STL 文件 狨猴脑切片装置部件 并单击打开。人脑： 人脑切片工具组件 （补充代码文件）
  3. 右键点击该部件，选择“扩展”中的“壳体转部件”。逐个选择每个部件，右键单击以重命名。 （单击对象旁的眼睛图标可隐藏或显示该对象。）重命名大框为 Main，小盒子 Sub，以及切割盒 盒形切割六边形形状 刀片架主件，小型扁平盒 切片机刀片，以及半管状物体 摇篮人类大脑：无 刀片架主体, 切片机刀片，或 摇篮.
  4. 隐藏 主要, Sub, 刀片，刀片架主体, 切片机刀片，以及 摇篮 并使用 Shift+单击来选中全部六个及该 盒形切割仅 盒形切割 以及 平滑处理后的编辑脑模型 应可见，但 平滑处理后的编辑脑模型 不应被选中。
  5. 点击并拖动选定部分，以调整方框相对于大脑的位置。
    1. 将大脑置于盒子中央。大脑在盒中的位置应足够深，以确保牢固夹紧，但不可过深，以免产生悬垂部分而影响正确放置。
  6. 定位完成后，可检测脑箱轮廓是否存在悬垂部分。选择 盒形切割 以及 平滑处理后的编辑脑模型选择布尔运算。
    1. 点击 平滑处理后的脑部模型 使其变红。
    2. 选择布尔减法，并应用计算。
  7. 检查脑组织盒内是否有突出部分，这些突出部分会妨碍脑组织安全放入盒中。如果存在此类突出，调整脑组织位置，使其在盒内的深度减小。如果脑组织已处于理想深度但仍存在突出，请参阅补充部分10，了解去除突出部分的解决方案。
  8. 选择 刀片间隙 模型。右键单击，选择“移动”。记录 Z 轴位置值，然后关闭窗口。该值即为最靠后刀片间隙的位置。
  9. 选择 刀片 来自的 STL 文件 脑部切片装置部件右键单击，选择“移动”。
    1. 选择绝对平移。在Z值处输入7.8中的数值；对于X和Y值，输入当前位置参数框中对应的数值。
  10. 选择 刀片 STL。右键单击，选择“复制”。
    1. 检查排列部件。在总数中输入叶片的总数量，在Z计数框中输入相同数值。将切片厚度填入Z间隙。点击“复制”。如果切片厚度有所变化，则需要单独调整各叶片的位置。从上一个叶片依次复制每个新叶片（由后向前），Z间隙等于该切片的切片厚度。
  11. 放置 切片刀片 以相同间隔重复步骤 7.9 和 7.10，使各部分与切片机中的刀片间距完全一致 切片刀片 人脑：跳过此步骤。
    1. 选择 切片机刀片 以及 刀片架主体 部分并选择布尔运算。
    2. 选择所有刀片 切片机刀片 用红色突出显示。点击布尔减法，并应用计算。
    3. 选择修复模式。执行扩展修复。选择应用修复并移除旧部件。
    4. 重命名该部分 刀片架将该部件导出为STL格式。
  12. 按住 Shift 键并选择 平滑处理后的脑部模型，所有的 刀片 上一步创建的模型，以及 Sub 和 主要单击布尔运算。
    1. 除以下部分外，将所有部件 主要 通过选中它们并点击绿色框下方的箭头，将其移至红色区域。
    2. 选择布尔减法，然后选择应用计算。
  13. 单击修复模式。在修复模式下：
    1. 检查是否有悬垂部分和尖锐点。这些可以在 Netfabb 或 Meshmixer 中进行平滑处理。
    2. 点击自动修复，扩展修复。然后应用修复并移除旧部件
  14. 右键单击修复后的脑部区域框并重命名 脑部切片盒导出为STL格式。

8. 在 Ultimaker 2 上打印脑切片盒

  1. 狨猴脑：Cura
    1. 将 Brain Slicer Box 导入 Cura。
    2. 选择旋转并拖动圆圈，使盒子在打印床上保持水平。
    3. 调整打印设置：0.1 mm 层分辨率，50% 填充密度，使用筏板（Raft）。
    4. 选择“保存工具路径到 SD 卡”。（打印时间约 12 小时。）
    5. 将 Blade Holder 导入 Cura，并旋转，使插槽位于两侧，六边形面位于 XZ 或 YZ 平面。
    6. 复制该对象。
    7. 调整打印设置：0.2 mm 层分辨率，20% 填充密度，使用边缘（Brim）。
    8. 选择“保存工具路径到 SD 卡”。（打印时间约 3 小时）
  2. 人脑：Cura
    1. 将 Brain Slicer Box 导入 Cura，并按 8.1.2 步骤进行旋转。
    2. 调整打印设置：0.2 mm 层分辨率，30–35% 填充密度，使用筏板（Raft）。
    3. 选择“保存工具路径到 SD 卡”。（单半球盒子打印时间约 70 小时 。）
  3. 在 Ultimaker 2 上
    1. 在构建板上涂抹一层薄薄的胶棒。
    2. 插入 SD 卡，选择打印并选择相应部件。

9. 切割脑组织

  1. 狨猴脑
    1. 准备一个工作台，配备固定好的脑组织、脑切片器、两个刀片架、切片刀、1 ml 氟化油、平头镊子、防护手套和包埋盒。
    2. 将新的切片刀插入刀片架的插槽中。确保每把刀片的斜面边缘朝向同一方向。操作切片刀时请佩戴防护手套。
    3. 从福尔马林中取出脑组织并轻轻擦干。
    4. 将脑组织放入切片器中。可在脑组织和切片器上滴加几滴氟化油，以便于准确定位。确保脑组织固定牢固。
    5. 将装有刀片的刀片架插入切片器对应的刀片插槽中。
    6. 用力下压刀片架，并施加缓慢而均衡的压力，使刀片穿过脑组织完成切割。
    7. 从脑组织前端开始，逐块取出切片。在取出切片前，先移除其前方的切片刀有助于操作。务必注意每块切片的前后方向。
    8. 拍摄每块切片的前表面和后表面照片。后部的切片很可能由多个分离的小块组成，因此在包埋时需特别注意各小块的方向。将每块切片放入包埋盒中，并全部置于10%福尔马林溶液中保存。
  2. 人脑
    1. 仔细测试脑组织在容器中的适配情况。
    2. 从一端开始，以倾斜角度缓慢而稳定地进行切割，依次通过每个刀片间隙完成全脑切片。
    3. 逐块取出切片，密切注意每块切片的编号及其前后方向。
    4. 拍摄每块切片的前表面和后表面照片。将切片放入密封的10%福尔马林袋中。后续将从这些切片中取组织块，放入包埋盒中用于包埋。

10. 去除脑盒中的悬突（补充部分）

  1. 切片提取：使用 Meshmixer
    1. 导入 Smoothed_Edited_Brain_Model。
    2. 选择“编辑”（Edit），然后选择“创建切片”（Make slices）。在“创建切片”界面中：
      1. 选择“堆叠式 3D”（Stacked 3D），方向为 Z，输入厚度 1–2 mm。点击“计算”（Compute）。切片加载完成后，点击“接受”（Accept）。
    3. 选择 1 或 2 个靠近皮层底部、周长较大的切片。这些切片应位于 Sub 盒子的下方。
    4. 将每个选定的切片分别导出为 Brain_Slice_#。
  2. 向上延伸切片以消除悬垂结构：使用 Netfabb Professional
    1. 导入 Brain_Slice_# 切片。
    2. 复制每个 Brain_Slice_#（如果勾选了“排列部件”，请取消勾选）。
    3. 右键单击每个 Brain_Slice_# 的副本，选择“缩放”（Scale）。
      1. 取消勾选“固定缩放比例”（Fixed scaling ratio）。然后在 Y 方向上放大脑切片，使其达到 Sub 盒子底部的高度。
    4. 将这些放大的切片重命名为 Brain_Slice_Big_#。
    5. 通过右键单击原始 Brain_Slice_# 部件并选择“移动”（Move），记录每个原始 Brain_Slice_# 切片的 Y 位置。
    6. 进行如下计算：Brain_Slice_# [y 位置] - (Brain_Slice_Big_# [y 尺寸] - Brain_Slice_#[y 尺寸])
    7. 逐一选择每个 Brain_Slice_Big_#，右键并选择“移动”（Move）。
      1. 在 Y 平移参数框中输入步骤 10.2.6 计算出的数值；在 X 和 Z 平移参数框中，输入当前“位置”参数框中的数值。选择“绝对平移”（Absolute Translation），点击“平移”（Translate），然后关闭窗口。
        注：在制作盒子时，Brain_Slice_Big_# 切片将与脑模型和刀片一同被减去。

11. 用于额外扫描的狨猴脑部 MRI 托架

  1. 制作脑部 MRI 托架
    1. 确保托架的顶面与Box_Cutout处于相同高度。脑部在托架中的深度和位置应与切片机使用时的设置一致。
    2. 按住 Shift 键并选择Smoothed_Edited_Brain_Model和Cradle。
    3. 选择布尔运算。选中脑模型使其高亮为红色，然后选择布尔减法运算，再应用计算。（如适用，还需选中Brain_Slice_Big_#切片。）
    4. 进入修复模式，以去除托架轮廓中任何尖锐的点，操作方式与之前对切片机的处理相同。选择扩展修复，应用修复后移除旧部件。
    5. 右键单击以重命名该部件为MRI Brain Cradle。选择导出，STL 格式。
  2. 使用 Cura 打印托架
    1. 将MRI Brain Cradle导入 Cura，并旋转模型，使带有脑部切口的平面朝上。
    2. 调整打印设置：层厚 0.1 mm，填充密度 100%，使用底筏（Raft）。
    3. 选择“保存路径到 SD 卡”。（打印时间约 10 小时）
    4. 按照 8.3 节所述，在 Ultimaker 2 上进行打印。
  3. 使用托架获取高分辨率 T2* MRI 图像
    1. 用纸巾轻轻擦干脑组织表面的福尔马林液体。
    2. 将脑组织按切片机使用时的说明放置于托架中。
    3. 将脑组织和托架滑入 50 ml 离心管中，并用氟化油注满至管口。
    4. 轻轻挤压离心管，使脑组织中的气泡逸出。将Cap Insert插入管盖凹槽内，防止此处产生气泡。拧紧管盖，并用石蜡密封管口。
    5. 将离心管放入线圈中，操作方式与前文所述相同。3D T2* 扫描参数见表 1。
    6. 在 Mipav 中打开 18 个 100 微米分辨率的解剖学 T2* 加权图像，并将其配准至第10个图像。配准参数与 1.1.7 节相同。对配准后的图像进行平均：工具 → 图像计算器-批量图像 → 平均。

结果

该方法的工作流程如图1所示。脑组织切片后，将MR图像与脑片表面的图像进行视觉比对，结果显示多个脑片之间的定位匹配良好（图2）。脑片经石蜡包埋后，在切片机上进行切片并染色。高分辨率尸后MRI与染色组织学切片的进一步比对表明，整个狨猴脑的各种结构均实现了精确且一致的匹配（图3）。

在该多发性硬化动物模型中，动物脑白质内出现广泛分布的白质病变。这些病变可通过磁共振成像（MRI）进行无创检测。图4展示了该技术揭示MRI发现病理基础的能力。在MRI上检测到的小病变 体内 MRI 可在死后 MRI 和组织学检查中进行追踪。如插图所示，病灶内的脱髓鞘是导致 MR 信号改变（与周围组织相比呈高信号）的主要因素之一。组织学和死后 MRI 还可显示在活体 MRI 中被遗漏的病灶 体内 MRI（图4）。

狨猴脑成像过程；三维模型制备；MRI扫描；解剖学比较。
图1. 制备狨猴脑切片模具的工作流程。脑组织经福尔马林固定（A1），随后获取各向同性体素边长为150 µm的T2加权MRI图像（A2）。图像经过处理并进行阈值分割，生成二值化掩膜（A3）。随后在三维建模软件中重建脑表面（A4）。通过切片模板与脑模型之间的布尔减法运算，生成脑切片模具的数字模型（B1）。该脑切片模具通过3D打印机打印制成（B2）。随后将脑组织牢固地放入切片模具中进行切割（B3）。请点击此处查看该图的放大版本。

脑成像对比研究；MRI与组织学切片示意图；解剖学研究
图2. 从左到右： 在体 MRI、死后MRI及组织切片照片。切片平面根据死后MRI（B）确定，并与相应的 体内 MRI切片（A）。随后将脑组织进行切割，所得脑片切面一致（C）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

比较结构差异的脑切片图像，冠状切片分析，神经解剖学研究。
图 3. 高分辨率尸检 MRI 与组织学切片匹配。将组织块包埋于石蜡中，用切片机切成 4 µm 的切片，并用快蓝和焦油紫染色（B）。然后根据脑结构将这些切片与 100 µm 的 T2*加权 MRI 图像进行视觉比对（A）。获取该图像的详细信息见实验方案的补充部分及表 1。脑结构标注：（1）红箭头 = 内囊，蓝箭头 = 前连合；（2）红箭头 = 壳核，蓝箭头 = 视束；（3）红箭头 = 尾状核，蓝箭头 = 海马；（4）红箭头 = 胼胝体，蓝箭头 = 大脑导水管；（5）红箭头 = 下丘，蓝箭头 = 锥体束。B1 中的虚线框表示在脑组织切片或石蜡包埋过程中出现误差，导致该切片沿 Y 轴轻微旋转，从而造成左侧前连合位置不匹配。请点击此处查看该图的放大版本。

脑成像示意图，显示冠状切面，突出解剖结构细节及对比度差异。
图4. 追踪病灶来源 体内 MRI 到组织学切片。该 体内 MRI未显示视束存在异常高信号的明确证据，无法提示病灶（A1）。然而，高分辨率尸检MRI显示双侧视束存在清晰的高信号条带（A2）。快速蓝-焦油紫染色的 4 µm 组织学切片显示，T2加权像上所见的高信号区域 离体 MRI 显示脱髓鞘（A3）。在大脑白质中， 体内 MRI 显示双侧轻微高信号（B1，插图为放大图像）。在高分辨率尸检 MRI 上，高信号区域更为明显（B2）。LFB 染色的 4 µm 组织学切片显示这些区域出现脱髓鞘（B3）。与基线比较后 体内 MRI 和苏木精-伊红染色结果显示，右侧被确定为解剖学异常，而非脱髓鞘病变。 请点击此处以查看此图的放大版本。

机械组件模型；3D 渲染，工程设计概念。
补充代码文件。 Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl：请点击此处下载该文件。 Brain_Slicer_Parts_Human.stl：请点击此处下载该文件。 Cap_Insert.stl：请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述方案可实现磁共振成像（MRI）与组织学切片之间的精确比对。该方案以统一格式呈现，适用于人类或小型动物（如狨猴或啮齿类动物）的大脑。文中特别指出了适用于大型（人类）与小型（非人灵长类及啮齿类）大脑的差异，并在配套视频和图示中以狨猴为例展示了具体应用。尽管该方法整体思路直接明了，但其实施过程包含多个步骤，并需使用多种软件工具。此外，还有一些可能影响该方法准确性的关键问题需特别说明。

图像质量的 体内 MRI 是一个重要因素。为了尽量减少 MRI 与数字化组织学图像之间在图像分辨率上的差异，应使用尽可能小的 MRI 体素尺寸。这一原则同样适用于死后 MRI 的图像质量。尽管死后 MRI 的扫描时间更长，可实现更高的图像分辨率，但样本制备过程可能引入图像伪影，例如与气泡相关的局部信号丢失。这些伪影可能遮蔽组织区域并影响其轮廓。此外，死后 MRI 上组织的尺寸可能受到固定方法及固定时间的影响。虽然 体内 到 离体 通过在数据采集过程中利用解剖标志来设置切片几何参数，可近似实现MRI图像匹配，但仍需进行非线性配准以更高精度地匹配这两幅MRI图像。

设计脑固定装置和切片装置也是至关重要的一步。在创建脑部的数字模型时，会应用一种平滑算法，该算法使模型相对于固定后的脑组织略有放大。这有助于将脑组织轻松插入其固定装置和切片装置中，同时减少固定装置轮廓上的尖锐边缘。然而，如果模型过大（例如超过5%），脑组织可能在死后磁共振成像和/或切片过程中发生移动。另一个重要考虑因素是调整脑模型的设计，以确保小脑能够正确地置于3D打印物体内部。当小脑在尸检过程中提取时受到损伤时，这一点可能尤为具有挑战性。

在打印脑组织切片器及其支架时，也必须谨慎选择3D打印机的类型。某些多喷嘴打印机需要通过烘箱进行后处理以去除支撑材料。尽管这类打印机制造的物体比桌面熔融沉积成型（FDM）打印机生产的物体更密闭且相对更耐用，但去除支撑材料时的加热过程可能导致盒子轻微变形，从而造成刀片间隙与脑组织轮廓不完全垂直。

脑切片过程是另一个关键步骤。在将整个大脑切割成片之前，必须确保大脑紧密地固定在脑切片器内：当对大脑施加轻微压力时，不应有移动。这将使刀片能够按照研究者设定的精确位置切割大脑。切割时应向两个刀片架均匀、持续地施加压力。根据刀片的锋利程度和组织的硬度，轻微的横向切割动作可能有助于保持切面平整。

包埋过程中的石蜡包埋也可能导致磁共振成像（MRI）与组织学图像之间的错位。如果在包埋过程中组织块未能平整地贴合于包埋盒内，切片时切片机的切割平面将与组织块表面之间产生倾斜。这将导致需要切去大量无法使用的切片，才能找到一个使全部组织均暴露的平整平面。一种校正该倾斜的方法是调整高各向同性分辨率死后 MRI 上观察平面的角度。然而，对于通常以各向异性分辨率（典型为较厚的冠状面切片）采集的活体 MRI，这种方法几乎无法实现。

最后，组织在福尔马林固定和石蜡包埋过程中可能发生一定程度的形变（如收缩），以及在切片制备过程中出现折叠、裂纹或皱褶。其中一些形变可通过将4-5 μm的切片在转移至载玻片前置于水浴中加以校正。其他形变则可部分通过将数字化组织学图像与死后MRI图像进行可变形图像共配准来解决。然而，通过细致且熟练的操作尽量减少形变，仍是实现MRI体积数据与组织学切片精确匹配的最有效方法。

总之，本文介绍的方法使研究人员能够准确评估MRI发现的潜在病理学基础。更广泛而言，该方法是一种有前景的手段，可用于识别和/或验证针对特定病理过程（如炎症或再髓鞘化）的研究中新型MRI生物标志物。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由NINDS院内研究计划资助。我们感谢美国国立卫生研究院功能磁共振成像设施。我们感谢Jennifer Lefeuvre和Cecil Chern-Chyi Yen在死后磁共振成像采集方面的协助。我们感谢John Ostuni及仪器设备科核心设施在3D打印方面的协助。本研究的图1使用了来自MeshLab的截图，该工具是在3D-CoForm项目支持下开发的。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
7T/30cm USR AVIII Bruker MRIBruker Biospin
38 mm Bruker Biospin 体积线圈Bruker Biospin
FomblinSolvay Solexis
50 ml Falcon 离心管，聚丙烯，无菌Corning21008-951
Fisherbrand 纱布海绵Fisher Scientific13-761-52
Parafilm M 通用实验室膜Bemis
Leica RM2235 旋转式切片机 Leica
Leica 一次性刀片，低剖面（819）Leica
醋酸克雷斯紫，0.1% 水溶液Electron Microscopy Sciences26089-01
劳氏快蓝，0.1% 乙醇溶液（95%）Electron Microscopy Sciences26056-15
ETOH
Ultimaker 2 Extended Ultimaker
0.75 kg 官方 Ultimaker 品牌 PLA  耗材，2.85 mm，银色金属Ultimaker
Axio Observer.Z1Zeiss
Zen 2（蓝色版）Zeiss
Netfabb Professional 5.0.1Netfabbhttp://www.netfabb.com/professional.php
Meshmixer 10.9.332Autodeskhttp://www.meshmixer.com/download.html
Mipav 7.2NIH CIThttp://mipav.cit.nih.gov
CuraUltimakerhttps://ultimaker.com/en/products/cura-software

参考文献

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3D MRI

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