从单分子结构信息FRET实验使用快速纳米定位系统

Summary

我们介绍了使用 TIRF 显微镜从大型供体-受体网络获取 smFRET 数据的设置和实验程序。使用贝叶斯推理软件 Fast-NPS 对这些测量值进行逐步分析，通过应用适应性染料模型产生高分辨率的结构信息。

Abstract

单分子 Förster 共振能量转移 （smFRET） 可用于实时获取生物分子复合物的结构信息。因此，使用多个 smFRET 测量通过三边测量定位蛋白质复合物内的未知染料位置。为了获得定量信息，纳米定位系统 （NPS） 使用概率数据分析将来自 X 射线晶体学的结构信息与单分子荧光数据相结合，不仅计算出最可能的位置，还计算出完整的三维概率分布，称为后验，这表明实验的不确定性。该概念被推广用于分析包含大量染料分子的 smFRET 网络。最新版本的 NPS Fast-NPS 采用一种新算法，使用基于马尔可夫链蒙特卡洛采样和并行回火的贝叶斯参数估计，允许在相对较短的时间内分析大型 smFRET 网络。此外，Fast-NPS 允许通过为每种染料选择五种不同模型之一来计算后验，这些模型解释了染料分子由于局部环境而表现出的不同空间和取向行为。

这里我们提出了一个获取 smFRET 数据和应用 Fast-NPS 的详细协议。我们提供了获取 Fast-NPS 的三个输入参数的详细说明：smFRET 值，以及染料分子的量子产率和各向异性。最近，NPS 已被用于阐明古细菌开放启动子复合体的结构。该数据用于证明五种不同染料模型对后验分布的影响。

Introduction

确定的生物分子的结构对于理解其功能的重要前提。两个用于结构测定行之有效的方法是低温电子显微镜和X-射线晶体学^1,2。如今，这两种方法提供一个分辨率下到埃级高分辨率的结构信息。这两种方法已被广泛用来阐明大生物分子的结构，例如蛋白质复合物。虽然现有的方法都不断被整个过去的几十年改善，生物结构的复杂性，仍对结构生物学的一大挑战，尤其是当大，动态和短暂络合物进行了研究^3。

为了研究大分子复合物的动力学，特别是结构与功能的关系，单分子的方法有省被提供的有用信息^4。一些新的战略被开发提供有关收购的结构和动态信息的正交方式。实例是高速AFM ^5，机械操作^6，荧光定位显微镜^7，以及单分子荧光共振能量转移^{（smFRET）8,9。}由于相当早就FRET已称为分子尺 ，由于对生物大分子¹⁰的长度尺度的距离依赖性。

smFRET的一个特别有趣的应用是使用从smFRET测量获得的距离信息来推断结构信息^{11，12，13，14，15 >，16，17，18，19，20，21，22，23。}由于smFRET的高时间分辨率，蛋白质结构的移动部分的位置可以本地化。然而，为了从约染料分子smFRET数据重要校正参数提取量化信息所需要的测量²⁴中被确定。与这些校正因子，FRET的效率E _FRET可以使用公式来计算

，

在那里我 _A和I _D 图2）。的β因子占串扰，供体发射的漏入受体信道和由下式计算

在那里我是_A和_I'D是供体的荧光强度和受体分子的光漂白后的受体分子。

的γ因子校正两个通道中的相对探测效率的差异，以及在该供体的荧光量子产率和受体染料的差异。它是由每个人的时间跟踪的计算方法

请注意，本说明书中忽略了受体分子，其有时变得很重要，并需要为待校正以及直接激励。用于确定这些修正因子是有用的，以便光的物理变化和结构动力学区分以激励这两个供体以及受体以交替的方案^25。

为了不仅获得定量smFRET效率而且定量的结构信息，所述纳米定位系统（NPS）于2008年²⁶被引入。名称是根据其相似性基于卫星的全球定位系统（GPS）的选择。该NPS是结合smFRET和X射线晶体学数据在生物大分子复合物不明染料位置的定位的混合技术。的Crystal结构用作基准帧和smFRET结果用于得到未知的荧光团的位置（ 天线 ），并从晶体结构（ 卫星 ）已知的位置之间的距离信息。在连续实验中，天线和多个卫星之间的距离被测量和天线的位置是由基于贝叶斯参数估计统计学上严格的分析方案的方法来确定。其结果，不仅天线的最可能的位置被计算，但其完整的3D不确定性分布，即所谓的后，由可信卷可视化。此外，NPS扩大到允许完整smFRET网络²⁷的分析。

所述NPS已被用来解决一些在真核转录的重要问题，上游的DNA，非模板DNA和RNA聚合酶II延伸共内新生mRNA的即过程mplex ^12，28，也显示出转录起始的影响因素²⁶和一个开放式启动子的动态建筑群^29。此外，NPS是用来阐明古细菌的RNA聚合酶开放的复杂³⁰转录起始因子TFE的位置，这竞争结合相同位点的转录延伸因子Spt4 / 5 ³¹的，特别是结构。

从那时起，许多基于smFRET结构方法已经发表^{15，18，21，23。}当比较不同的基于smFRET结构的方法，它变得清晰，该方法的明显的精度在很大程度上取决于染料模型的特定选择。应该注意的是染料分子可能根据当地环境表现出不同的空间和取向行为。

为此，快NPS引入^32。快速NPS采用了先进的采样算法大大减少计算时间。此外，快速NPS允许一个执行结构分析，并为每个染料分子，用户可以从一组五个不同染料的模型将在下面描述选择。最保守的模式，堪称经典之作，假设染料只占用一个，但不明，地位。在该位置，所述荧光团可以一个锥体，其尺寸从其相应（时间依赖性）荧光各向异性测定内自由转动。圆锥体的取向是未知的，转换测量smFRET效率成距离时导致大的不确定性。在这方面，该模型是保守的，因为这将导致最小精度相比，其他染料模式LS。只有很短的距离应该由经典机型率先作出一个明显不正确的位置确定的假设。对于典型smFRET价值观，正确的立场是始终封闭在较大音量可信。

然而，由于较高的精度是可取的，它开发和测试的替代染料模型，这可能有助于改善精度是重要的。如果染料旋转比其固有的荧光寿命快得多，所谓异模型可以应用。这里，取向因子^κ2（所需要的计算特性各向同性福斯特半径 ）设定为2/3。其结果是，相比那些在经典机型的³²可信计算量几乎是两个数量级较小。在于不仅能够快速reori该荧光团是在环境中发现的情况下entation，但另外的快速运动都在其访问的卷，应使用meanpos异模型。在此模型中，将染料有效地只占用一个平均位置，其中所述空间平均是由一个多项式距离转换¹⁵占。如果例如（通常疏水的）染料附着到亲水性区域， 例如，该DNA该模型适用。所述meanpos异模型的应用导致通过大约两个因素中的可信卷的尺寸进一步减小。然而，联系到蛋白质的染料可能会可逆地结合在其空间上访问的卷（AV）数的疏水补丁。这些区域之间的瞬时开关，但在一个区域发生自由转动和快速的局部运动，最好由无功meanpos异模型中描述的荧光团。对于类似的情况，其中染料是不能自由旋转VAR-meanpos模式适用。多个D-有关这些车型etails可以在我们最近发表的³²被发现。

这些模型提供了专门占了染料可能遇到的各种环境和应用它们明智地优化其定位精度丰富的剧目。在快速NPS附加到特定位置每染料分子可以被分配到一个单独的模式，使得FRET的伙伴被允许有不同的型号。这使得无限的贴近自然造型。然而，重要的是，一个执行严格的统计测试，以确保由最终模型组合获得的结果仍然与实验数据一致。这些测试包括在快速NPS软件。

为了快速NPS适用于实验数据是必需的（只）三个输入参数的测量。首先，该染料对特定各向同性福斯特半径（/54782/54782eq5.jpg"/>）已被确定，因此，供体染料的量子产率（QY），供体荧光发射光谱和受体的吸收光谱需要测量，这些测量可以在进行散装，使用标准的光谱仪和一个标准的荧光光谱。对于每一对，则R ₀然后使用免费软件PhotochemCAD计算，并且可以在NPS分析中使用。此外，（时间分辨）染料分子的荧光各向异性需要使用一个极化（和时间）敏感荧光光谱仪来获得。然而，对于快速NPS的最重要的输入参数是在单分子荧光显微镜的设置测量的smFRET效率，如一个全内反射荧光显微镜（TIRFM） 。

在这里，我们提出了一个一步一步的协议获得smFRET数据和应用快速NPS（ 图1）。

Protocol

1.先决条件和实验室设备

注意:测量腔室的组件在图3中描绘。测量室的夹层设计包括三个主要部分组成:一石英玻璃（熔融石英）滑动，密封膜和密封所述流动室盖玻片。测量室被安装在定制的样本保持器。样品室和金属支架的尺寸减速以适合标准显微镜石英载玻片英寸（76毫米×26毫米）。

1. 切割石英用在图4所示位置a金刚石钻头（0.75 MM）载玻片。石英玻璃载玻片的设计是为了每个幻灯片的两侧来区分非对称。
   注:石英载玻片可以在测量后，直到表面变得划伤重新使用。
2. 要安装室，使用自定义的金属样品架， 如图5 <描述/ STRONG>。样品保持器包含以连接的入口和用于流室的出口管道两个线程（M4）。此外，使用线程（M3）到样品室装入到金属支架以及线程（M3）的棱镜支架固定到所述金属支架的下半部分。
3. 上执行一棱镜类型的全内反射荧光显微镜（TIRFM）（ 图6）的smFRET测量。
   注:TIRFM具有三个激光器:绿色（532纳米，Nd:YAG激光器）和红色激光（643纳米，激光二极管）供体的激发和受体染料分子，以及一个蓝色激光（491纳米，二极管泵浦的固态激光器）用于漂白上之前smFRET测量样品室中的背景荧光的杂质。这三个激光束在空间上组合的，并且可以通过一个声光可调谐滤波器（AOTF）中选择。荧光的光被高孔径物镜收集，分裂成一个供体和接受或通过使用分色镜和投射到两个EM-CCD摄像机信道。样品室被连接到一微米级，允许在X和Y方向上的移动与两个步进电机。第三压电电机与一个红外激光器和位置敏感检测器一起使用，以建立一个自动聚焦系统，以确保在整个实验最佳聚焦。
   1. 使用时，在FRET时间轨迹动态观察²⁵交替的激光激发（ALEX）。这种动力学可以通过分子内的任一构象变化或通过在受体亮度和受体闪烁波动引起的。
      注:ALEX允许这两个可能的原因的歧视和防止动态FRET轨迹的误解。然而，为了简化起见，该协议的一部分被限制为不ALEX拍摄电影的分析。
      注意:3B类激光器在单分子荧光设置中使用。确保有足够的拉SER的安全防范措施，根据当地政府的规定，已经在操作系统之前服用。
4. 执行用于确定在UV-VIS分光计的量子产率的吸收测量（见材料和​​方法）。
5. 执行施主荧光发射光谱，受体吸收光谱和荧光光谱的荧光各向异性的测量（见材料和​​方法）。
6. 根据公开的程序³³制备样品室。可替换地，该过程中可使用^[34]所述。
7. 标签与供体 - 受体染料分子对适合smFRET所研究的样品，并确保存在用于样品室的表面上的固定化生物素部分。
   注:为了本地化与快速NPS软件需要不同的样本构建一个未知的天线染料的位置。每个结构的ñ电火工品具有在未知天线染料位置上的一个标签，并在从晶体结构已知的卫星位置的一个标签。与连接到天线位置染料和三个不同的卫星的位置的至少三个不同构建所需的准确的结果。天线的卫星之间以及测量也提高精度是有用的，然而，这需要一个需要在分析中输入正确的染料分子的交换。

在自定义持有人流动室2.安装

1. 拉硅胶管（1.3毫米内径，2.4 mm外径）插入中空标签螺丝（M4）和上切割用一把锋利的剃刀刀片两端直留1cm的两侧外伸的管子。调整管至约2mm的悬垂上的标签螺钉的一侧。
2. 装入流动室到样品保持器的方式，在石英玻璃载玻片上的孔相匹配的样品支架上的螺纹。紧缩入口和出口螺钉轻轻以确保该样品室的入口和出口仍然穿透。轻轻地拧紧亚克力玻璃支架的四个螺丝固定流室的位置。
3. 切硅胶管（0.58 mm内径，0.96 mm外径）进20厘米长的块。插入件，以在入口与计量室的出口螺钉中的一个。通过使用夹钳关闭入口和出口管道。
   注:组装的样品室可以存储在室温下长达两周。

3.在TIRF显微镜smFRET测量

1. 使用注射器用PBS 500微升洗样品室。从通过改变到不同的缓冲溶液之前创建在进口管的端部的液滴进入在任何时候都在样品室防止气泡。
2. 冲洗用100微升中性（0.5毫克/毫升的PBS）溶液中的样品室，并孵育在室温下15分钟。
3. 洗出用PBS 500微升的中性溶液。
4. 螺丝金属支架的棱镜到样品室中。
5. 装入样品室至TIRF显微镜的微米级。确保在物镜的前面水平尽可能地直装入样品室，以避免在扫描过程中散焦。
6. 启动软件控制EM-CCD摄像机和用于控制级的压电马达的软件。
7. 通过观察红外激光的反射调整显微镜物镜的焦点。
8. 放置在金属棱镜支架的顶棱镜（PS991中，n = 1.52）。调整棱镜的横向位置，以确保激光束打到棱镜然后使用粘合剂和用UV光孵育5分钟。
   注意:安装棱镜可以通过清洁后重复使用。
9. 在摄像头控制软件，点击"设置采集"并定义以下采集参数:100毫秒INTEGRAT离子时间，401帧/电影（绿色的摄像头），400帧/电影（红色摄像头），电子倍增器增益225，前置放大器增益5X和读出速率3 MHz的14位。
10. 创建测量本地硬盘上的文件夹。选择一个合适的名称为测量文件， 如年-月-日。在软件设置到"自动保存"骑手，启用了"自动保存"，然后选择文件格式为*收购电影的.sif。选择在硬盘上的文件夹。使用文件夹名filestem。
11. 启用"自动增加"功能（设置起始值为1）。使操作者的到的文件名的附件。使用"DON"和"ACC"供体和受体通道。选择"_"作为分隔符。
12. 在"视频"摄像头控制软件点击使用所有这三个激光器最大激光强度（扫描样品室COM启动摄像头和漂白背景荧光的实时影像bined≈3,000瓦/厘米²为10秒每视场）。
13. 关闭蓝色激光。降低绿色激光的强度约200瓦/厘米²和大约40毫瓦/ cm ²的红色激光器，如果使用交替的激光激发（ALEX）。
14. 稀释生物素化的荧光样品50-100 PM的浓度。负载100微升溶液中。结合后的样品被固定在室表面上。
    注意:确保不超载室。邻近的分子必须从彼此分离。
15. 如果需要的话，装载一个附加100μL的2倍的浓缩的样品的腔室的。
16. 密封用夹子装载完成后，测量室的入口和出口管。
17. 关掉所有的激光器，并使用压电马达，以进一步移动至流动室的视图两个字段。
18. 在摄像头控制软件点击"带信号"开始拍摄动画和开关关于在同一时间的激光。确保分子的80％以上是由电影结束通过调节激光功率漂白。
19. 重复步骤整个prebleached样品室地区3.17和3.18。

4.采集转化地图（"beadmap"）

1. 如在第1.1，1.2和2中所述制备的流室中。
2. 使用抗生物素蛋白涂荧光珠多光谱显示其在供体荧光发射和受体通道。涡旋1分钟的股票，然后再稀释股票的50微升在50微升的DDH ₂ O涡旋1分钟，超声处理1-2分钟，然后涡旋另外10秒。
3. 开展smFRET测量（第3.5-3.10）中描述的步骤。
4. 负载100微升（1室体积）的1:2稀释的荧光珠进入流动室。等待10分钟的荧光珠结合到表面。
5. 使用采集参数在3.9，但陈戈电影长度26（绿色相机）和25（红色照相机）和电子倍增器的增益为10。
6. 绿色激光的强度设定为20W / cm ²的值。
7. 取一部电影在视场大约50-100珠。

5.处理smFRET数据分析和

1. 使用定制编写的软件的SM FRET为beadmap的分析（见材料和​​方法）和所获取的电影。启动程序viewPlot1.m。
2. 点击分析|批量分析，取消选中"亚历克斯"如果一直没有使用过它。为了获得最佳性能选择峰发现"高"的门槛。按"OK"。
3. 选择"否"当被问及如果beadmap已经进行了分析。浏览包含收购beadmap文件夹并选择（它通过双击）的* .sif文件。在接下来的对话窗口，按"OK"。
   注意:如果一个beadmap已经分析了在先前的测量包换，选择"是"，并在这里通过浏览到正确的文件夹，然后双击该beadmap * .map文件选择保存beadmap。步骤5.8继续。
4. 选择定位在视场的对角的两个单珠。像素强度是颜色编码从深蓝（低强度）到暗红色（高强度）。
5. 点击第一个胎圈的中心。如果分子的中心，可以通过彩色编码明确定位，选择"是"或点击"否"，然后选择一个不同的分子对。
6. 上显示的最大强度，并按下"KEEP"的像素的十字线的位置。重复该过程与所述第二信道。
7. 对面角落里点击分子上，然后重复步骤5.5和5.6。
   注意:两个通道的相对像素移位显示在命令窗口，并转换映射自动保存为* .MAP文件到含有beadmap * .sif文件夹<。/ LI>
8. 要加载供体和受体的电影（*的.sif）对于"批量分析"，浏览到该文件夹​​，选择要进行分析的所有电影，然后单击"确定"。在接下来的对话窗口，按"OK"。
   注:在命令窗口中显示的最后一个车道启动批量分析完成"完成分析..."。所检测的分子被显示在新窗口中，这也表明了供体的相对移动，并从转换映射确定的受主信道。
9. 要加载批电影文件单击File |负载。取消选中该选项，如果没有使用它"亚历克斯"。在smoothwidth设置为10，然后单击"确定"。选择含* .ttr文件的文件夹，然后单击在接下来的上下文菜单"全选"和"OK"。
10. 如果显示的轨迹特征特性smFRET阶段（ 图2）按下切换按钮"未选择"与第一通过移动鼠标光标线，点击鼠标左键选择FRET事件开始的时间点。下一个选择的受体分子的漂白和最终的供体分子的漂白的时间点的时间点。
11. 在接下来的窗口中FRET效率以蓝色绘制。要选择跟踪按"Yes"按钮，否则选择"否"。要重新访问时间跟踪点击"后退"按钮。
12. 重复该过程直到电影的最后分子。
13. "|保存文件"在影片的最后分子分析后点击保存所选的痕迹。保存选定的痕迹在同一文件夹作为*的.sif文件。
14. 重复步骤5.10-5.13所有获得的电影。
15. 执行程序combine_fret_results.m。选择包含* .RES文件和所有* .FRETonly_trace文件的文件夹。保存分子明智FRET和逐帧FRET文件作为MW.dat和FRW.dat分别。
    注:* .dat文件保存为ASCII文件。该FRW.dat文件包含6列，每一列都FRET帧。第六列包含修正逐帧FRET效率。该MW.dat文件包含21列和每个选定的FRET分子一行。第三列包含分子明智的FRET效率。

6.直方图显示smFRET数据

注意:为了提取所有记录smFRET数据帧逐数据或分子逐数据绘制在直方图和采用高斯拟合至（多个）的峰分析的平均值smFRET效率。在下文中，该协议使用一个商用的数据分析软件（见材料清单）。然而，任何其它可用的软件可以用来代替。

1. 打开数据分析软件（见材料清单）。点击文件|导入| ASCII多。选择包含FRW.dat文件的文件夹。选择文件，然后按"OK＆＃34 ;.接受"OK"没有变化输入选项。
2. 统计| |直方图选择包含修正FRET效率，第三列C（Y），在列，并选择情节单击鼠标右键。在直方图窗口中的列双击，然后取消选择"自动分档"，并选择所需的箱尺寸， 例如 ，0.05。也可以选择开始和结束值， 例如，-0.025和1.025。
3. 通过对他们的左击选择直方图的列。然后右击并选择"去宾工作表"。选择它通过左键点击"计数"列，然后右键单击并选择Plot |列/酒吧/饼图|列。
4. 在列条形图去分析|配件|非线性曲线拟合|打开对话框。选择"高斯"下的函数，则进入"参数"骑手。取消自动参数初始化。修正为0点击偏移值（Y0）上的"配合"。
   注意:拟合函数以及嵌合德尾巴现在显示在列情节。的"XC"值给出拟合函数， 即，用作用于NPS软件输入参数的平均值的FRET效率的中心。

7.量子产率的测量

1. 以类似于由伍尔特等人描述的方法的相对方法来执行量子产率的测定。 ^35，使用罗丹明101溶解在乙醇（QY = 91.5％），为标准。
2. 在使用具有1cm光程长度的吸收比色皿80微升体积的UV-VIS光谱仪记录吸收光谱。在波长将被用于荧光激发的吸光度必须≤0.05。
3. 在光子计数模式操作的灯校准分光计记录发射光谱。使用SPECTR执行在激励（0°）和发射（54.7°）的路径（魔角条件下）与格兰 - 汤普森偏振器测量的分别为约5纳米和用于激发和发射单色器为2.5nm，人的带宽。测量样品将它们转移到具有3 mm路径长度照顾荧光比色皿的计数率不超过10 ⁶秒^-1之后。
   1. 计算根据量子产率

其中，n和n _标准分别是样品和标准，的溶剂的折射率。 F（λ）和f_Std（λ）是样品的荧光强度，并在波长λ的标准。 _A（λEX）和A ^性病 _（λEX）是在激发波长的样品和参考的吸光度和_ΦSTD是标准的量子产率。

乐"> 8。各向同性福斯特半径计算

1. 计算各向同性福斯特半径（ ）从供体分子的发射光谱，该受体分子的吸收光谱中，供体的量子产率和介质的折射率。使用免费软件PhotochemCAD的计算 。然而任何其他可用的软件可以用来代替^36。

9.各向异性的测量

1. 确定从具有各种激发/发射偏振片设置（V / V，V / H，H / V，H / ^H）36荧光光谱的录音稳态荧光各向异性。
2. 计算的G因子，其中用于校正仪器的偏振文物，用于从所述各波长比

并用它来计算每个波长的各向异性值:

在那里我_XY指示激发极化x和红外偏振y中的强度。

3. 平均的值在整个发射光谱范围来计算稳态荧光各向异性。

10.安装快速NPS软件

1. 从http://www.cgl.ucsf.edu/chimera下载UCSF奇美拉，然后按照安装向导。
2. 转到"中国科学院生物物理研究所"的网站在乌尔姆大学:https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html。下载Fast-NPS的当前版本和其解压缩到所选的文件夹。打开子文件夹"再发行"，并安装Visual C ++可再发行是适合系统。

11.围绕PDB文件

1. 打开的奇美拉兴趣PDB文件（S）。选择的复杂大分子的所有原子，并计算出质心坐标（工具|结构分析|轴/飞机/质心|定义质心... |确定）。
2. 打开回复日志（收藏|回复登录）和转换工具（工具|移动|坐标转换）。请在回复登录到坐标转换窗口的文本框"SHIFT"显示质心坐标和改变的每一个协调的迹象。按"应用"，将文件保存为"保存PDB"（文件|保存PDB）。

12.设置了位置的先验

注意:所有值在埃考虑。

1. 启动技术计算语言和改变当前文件夹到本地快速NPS文件夹中。请在命令窗口:FastNPS。
2. 建立项目经理（项目|新）新jobfile。
3. 设置位置之前（工具|型号染料之前）。
4. （建议2）在面板"事先基础"通过输入其价值之前定义位置的空间分辨率。
5. 通过激活复选框，并单击"加载PDB"按钮排除大分子的内部。选择并如第11所述加载中心PDB文件。
6. 指定的近似直径（推荐13埃，见讨论）的染料通过输入其值。
7. 输入骨架的距离， 即，染料分子可以渗透到大分子的距离（推荐2埃）。
8. 在里面面板中的"最大规模前"，输入位置前的最小和最大坐标（推荐:在[-150,150]×，在[-150,150] y和z [-150,150]）。
9. 当定义一个卫星，激活复选框"通过柔性连接附件"面板中的"事先基础"，并在其中染料分子连接面板"接头"的原子的坐标（在中心PDB文件）进入。另外，通过输入数值指定的长度和接头的直径（13埃和4.5埃建议，见讨论）。在天线的情况下，跳过了这一点。
10. 按下按钮"计算访问卷"。
11. 之前保存的位置和可选导出它使用的软件，如奇美拉可视化的目的。

13.定义网络几何

1. 打开定义测量窗口（模式|编辑几何体）。
2. 通过按下屁股创建一个新的染料分子在"新建"，在面板中的"染料"。
3. 通过输入值设置它的荧光各向异性（第9条），并选择下拉菜单中选择"染料模式"中的染料模式。
4. 按下按钮"装载"，前选择相应的位置，并检查染料的激活复选框。重复此过程为所有的染料， 即对所有的天线以及所有卫星。
5. 创建所有染料后，定义的测量。通过点击"新建"面板中的"三围"创建一个新的测量。
6. 选择下拉菜单"Dye1"和"Dye2"低于其FRET的合作伙伴。
7. 输入错误的smFRET效率，这种染料对的各向同性福斯特半径。
8. 最后，检查测量的激活复选框。重复此过程为所有的测量。
   注意:通常情况下的网络变得越来越复杂，因此，用户可能会感到困惑。为了防止措施ŧ失误，按"检查网络"按钮目视检查网络。该图显示了激活的染料，并通过互连FRET染料线显示的测量。

14.计算

1. 打开窗口计算（模式|计算）。
2. 如果网络中的每个染料具有分配一个特定的模式，选择"用户自定义"，然后按"计算"开始计算。为了在同一个模型中的所有染料中，选择五种模式（古典，ISO，meanpos异，VAR-meanpos-ISO和VAR-meanpos）之一，并继续进行。
   注:该命令窗口将指示计算的进展。快速NPS将与弹出消息为此，当计算已经完成。

15.可视化结果

1. 为了出口染料的可信卷，打开查看结果窗口（型号|查看结果）。
2. 出口染料密度:
   1. 出口单独或全部同时染料。为了导出一个单一的染料在面板中的"显示染料"，按"出口浓度"选择它。输入分辨率（2被推荐），并选择出口文件类型。右边的密度预览和它的一些数学特性示。
   2. 为了导出所有的染料同时按下"批量导出"。
3. 在奇美拉打开生成的密度文件。

选择的模型组合16一致性检查

1. 打开查看结果窗口（型号|查看结果）。如果在面板"计算信息"文本框"一致性"显示的值低于90％的在模型不充分代表被测smFRET效率，因此是不一致的。
2. 在不一致的情况下，按下按钮"详细一致性"。搜索具有低于90％的值进行测量。如果一个或多个染料s的主要参与这些测量，其模型是容易造成不一致性。考虑这些染料不同的染料模型，然后重新运行快速NPS计算。

Results

转录基因表达的第一步中的所有生物。在古菌，转录由单个RNA聚合酶（RNAP）进行。相比于真核生物，古细菌RNAP有着惊人的相似结构，同时具有更简单转录机器的真核同行。因此，古细菌可以用作模型系统通过RNA聚合酶II（RNA聚合酶II）来研究真核转录起始。近日，古细菌RNA聚合酶开放的复杂的完整的体系结构已经从单分子荧光共振能量转移和NPS确定。从NPS分析的数据被用来构建完整的古开放的启动子复合物，它提供了有益的见解转录起始机制的典范。

为了阐明这种结构，分别位于开放的启动子COM中未知的天线染料分子之间测量smFRET效率复杂和已在该RNAP，其位置由晶体结构（PDB-ID:2WAQ）是已知的五个参考网站包含了一些已知的卫星染料分子^37。天线染料被装上的非模板DNA，TFB，TBP或TFE的不同位置中的任一个。在这项研究中所用的完整网络包括超过60测量的距离。

图7描绘了从NPS分析建完整的古细菌开放启动子复合物的模型。它包括双链启动子的DNA（亮和暗蓝色），该RNA聚合酶（灰色）和转录起始因子TBP（紫色），TFB（绿色）和TFE（黄色）。该模型叠加从NPS分析，可信册，其中采用了经典模型（A），ISO模型（B）计算的，meanpos-ISO模式（C）的VAR-meanpos异模型结果（D）和VAR-meanpos模型（E）。

图1: 所需快速NPS计算参数的采集和处理的工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2: 事件smFRET的示范性荧光强度实时跟踪。 smFRET，II:供体（绿色）和示出了三个特征阶段，即我的受体分子（红色）的荧光强度施主荧光受体漂白后，三:施主漂白后的背景荧光。g2large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

图3: 流动室供smFRET实验的示意图。流室安装到与亚克力玻璃持有人定制的金属支架。流室的夹层设计包括一个石英玻璃（熔融石英）有两个孔用于安装入口和出口管道，密封膜和关闭所述流动室盖玻片滑动。为TIRF照明棱镜被安装到所述流室的下半部。空心螺丝卡提供流室入口和出口。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4: 在石英玻璃载玻片和密封膜的制备。石英玻璃载玻片的机械制图表示的孔的位置（以毫米为单位给出）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5: 流动室机械制图。对于铝棱镜支架的措施，有机玻璃支架和铝安装帧毫米给出。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图6: 用于smFRET实验棱柱型的TIRF设置的示意图。缩写光学元件:A，孔; DM，分色镜;楼发射滤波器; L，镜头;男，镜; 0，客观的; P，棱镜; PSD中，位置敏感光电二极管; S，样品; PS，定位阶段; T，望远镜。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7: 不同的模型假设的仿真结果。所有的图片显示的古细菌RNA聚合酶（PDB ID:2WAQ，顶视图）与模型为启动子DNA（分别TDNA和ntDNA在蓝色和青色，）一起，TBP（紫色），TFB（绿色）和TFE（黄色）在古开复^30。可信卷叠加的（A）的经典模型，（B）ISO模型，（ 三 ）meanpos异型号，（ 四 ）VAR-meanpos异模型和（E）变种的NPS模拟结果-meanpos模式。所有卷都在68％可信度所示。经典和VAR-meanpos网络与smFRET数据一致。相反，在所有染料选择了ISO，meanpos异或VAR-meanpos异模型网络与实测数据不一致。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

我们目前的设置和实验程序准确地确定通过挠性接头到生物大分子， 例如 ，核酸和/或蛋白质附着染料之间的FRET效率。

为了确保精确的smFRET测量（第3节），关键的是在测量过程中的任何时间，以排除从流动室的空气。此外，确保不超载荧光流室。荧光团必须明确区分开来，以确保正确的分析。作为smFRET对，其不显示供体的漂白必须从分析中排除，确保在视场中的分子的> 80％的在电影结束漂白。考虑到样品的β因子和γ-因子中的不均匀性，纠正供体和受体通道的串扰和相对的检测效率，分别计算每个FRET对个别。

相机设置（积分时间，电子倍增增益，前置放大器的增益，并在第3.9节描述的读出速率）应被设置为值给予信噪比，动态范围和时间分辨率信号之间的最佳折衷。它们需要重新调整为不同的实验，或者如果不同的硬件被使用。帧的数量必须足够高，以确保大部分捐赠者的观察时间内分子漂白剂。

有关荧光光谱仪（第7至9）的测量的信号强度与已记录的数据的光谱分辨率之间的良好折衷有被发现。为此在荧光光谱仪的激发和发射通路狭缝必须适应依赖于所使用的仪器和样品的浓度。

此外，我们目前的快速NPS分析方法来获得短暂的或动态MACROM的结构信息olecular复合物。 NPS已应用于以显示非模板DNA链的路径和转录起始因子在古细菌RNA聚合酶开放的复杂的位置。使用超过60种不同的距离测量网络，我们发现，快速NPS，配备了新实施的采样引擎（Eilert，T.，贝克尔，M.，德雷克斯勒，F.，与米氏，J.筹建中），减少了由幅度≈2订单所需此复杂smFRET网络的分析，由于相对于原来的全球NPS方法²⁷的时间。该算法的鲁棒性是植根于都市中之吉布斯采样与并行回火方案相结合。快速NPS显示确切的网络结果的可重复性并与早期^30日公布的结果一致。

几种不同的方法已经发表，旨在从smFRET测量¹¹推断的结构信息^{>，12，13，14，15，16，17，18。}所有这些方法只提供一个特定染料模型。由此，染料，即不符合由各个模型所做的假设，不能使用，或者导致错误的结构信息。快速NPS中，与此相反，可以选择每个染料分子的不同的模型。这有助于解释两者的不同构象的行为时，染料分子本身，以及用于它的连接的连接体。染料分子的局部分子的环境中，以及它的物理性质将决定哪种模式是最合适的。

为古细菌起始复合物的分析smFRET网络，对于所有染料分子的各向同性假定导致急剧下降我n作为相比于经典模型的可信卷的大小。在具有动态位置平均为所有染料组合分子所有可信体积尺寸的中位数（95％）降低到小于0.5nm ^3。然而，这些染料分子后验不再符合其smFRET测量，表明假设而导致虚假的结构信息。与此相反，在经典模型所确定的后验是与确定smFRET效率一致。

由于各向同性和/或动态位置求得所有染料的假设导致不一致，快速NPS使其中每个染料可分配的五款车型之一染料分子前科。每个型号都使用相同的访问卷。用于染料的AV计算的算法做了几个假设。首先，荧光团的空间形状由球形近似。因此，一个直径考虑到荧光团的WID次，高度和厚度应当使用（第12节）。此外，连接体的形状是由一柔性杆近似。第12节给出的数值计算了染料Alexa的647通过12-C接头附着。迄今为止，这是不可能精确地确定先验哪种模式是最适合给定的实验的几何形状，并且因此所有的模型进行测试。在一般情况下，人会选择这使可能的最小后尺寸的模型，同时仍然与数据一致。要测试的车型可以选择是否与smFRET数据是一致的，我们都计算后和可能性。一致性意味着90％以上的从后回收的样品中是可能性的95％置信区间内。

虽然这是事实，该染料分子的各向异性低，较小的距离的不确定性，在一个smFRET网络几何安排也必须加以考虑。因而人，而representing染料分子与一个iso模型低荧光各向异性是典型的首选，一致性检验提供了选择正确的染料模型更直接的手段。染料模型的最佳选择可以导致定位精度急剧增加，并在同一时间保持与它的FRET数据网络的一致性。

概括地说，快速NPS允许获得大的大分子复合物的结构和动态信息。在对比共同的结构的方法，如X射线晶体学或低温电子显微镜这允许监测高度灵活的或瞬态络合物，从而大大扩大了复杂的生物过程的机理的理解。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
流通室准备
定制金属样品架	自制	不适用
石英玻璃载玻片，76 毫米 x 26 mm	Technical Glass Products	26007
盖玻片， 60 mm x 24 mm	Marienfeld	101242
洗涤剂，Hellmanex II	Hellma	320.001
超纯水，来自 Synergy UV	Millipore	2512600
Zepto 等离子清洗剂	Diener	n/a
（3-aminopropyl）-三乙氧基硅烷，p.a.	Sigma-Aldrich	A3648
甲氧基 PEG-琥珀酰亚胺戊酸酯，5 kDa	Laysan Bio Inc.	MPEG-SVA-5000-1g
生物素化 PEG-戊酸琥珀酰亚胺酯，5 kDa	Laysan Bio Inc.	BIOTIN-PEG-SVA-5000
生物碳酸钠	Sigma-Aldrich	S5761 Sigma
碳酸钠	Sigma-Aldrich	S2127 Sigma-Aldrich
密封膜 （Nescofilm）	Fisher Scientific	12981805
Tygon 柔性硅胶管，0.8 毫米内径，2.4 mm 外径	Saint-Gobain Performance Plastics	720958
细孔聚乙烯管，内径 0.58 mm，外径 0.96 mm （Smiths Medical）	Fisher Scientific	12665497
Neutravidin	Life Technologies	A2666
全内反射荧光显微镜
Nd：YAG 激光器，532 nm	Newport Spectra-Physics	EXLSR-532-100-CDRH
二极管泵浦固体激光器，491 nm，Calypso	Cobolt	904010050
二极管激光器 643 nm，iBeam smart	Toptica	iBEAM-SMART-640-S
二向色镜，532 RDC	Chroma	F33-540
二向色镜，476 RDC	Chroma	F33-476z
声光可调谐滤光片	AA光电	AOTFnC-VIS
平凸柱面透镜，f = 75 mm	Thorlabs	LJ1703L1-A
平凹圆柱形，f = -300 mm	Thorlabs
棱镜，PS 991	Thorlabs	PS991
聚焦镜头，f = 75 mm	Thorlabs	LA1608-B
注射泵，PHD 2000	哈佛仪器	70-2002
2 步进电机，Z812B	Thorlabs	Z812B
压电致动器，PE4	Thorlabs	PE4
红外二极管激光器	爱特蒙特光学	CPS808	自动对焦系统二
向色镜的一部分，775 DCXR	色度	775 DCXR
位置传感探测器 （PSD），PDP90A	Thorlabs	PDP90A	自动对焦系统部分
水浸物镜，Plan Apo 60X WI，NA 1.2	尼康		MRD07601
向色镜，645 DCXR	Chroma	645 DCXR	发射路径
发射滤光片部分，3RD550-510	Omega 光学	3RD550-510	绿色通道发射路径
发射滤光片，3RD660-760	Omega 光学	3RD660-760	红色通道
EMCCD 相机，iXon+ DU897EBV	Andor	AND-20-00032
EMCCD 相机，iXon3 DU897D-BV	Andor	AND-20-000141
杂项
Varian 50	Cary		紫外可见分光光度
Fluorolog2	SPEX		荧光光谱仪
Solis （V4.15）	EM-CCD 相机的	Andor
Apt 用户实用程序 （1.022 版）	压电电机的	Thorlabs
Norland 光学胶粘剂 68	Thorlabs		胶粘剂
PC-AFN-0.8 尼罗河红	Kisker Biotech		亲和素涂层荧光多规格珠子
Matlab	Mathworks		技术计算语言 for custon written software
起源 （V9.0）Originlab			科学绘图和数据分析软件
Hellma 105-202-15-40	Hellma	105-202-15-40	吸收比色皿 1 cm 光程
Hellma 105-251-15-40	Hellma	105-251-15-40	荧光比色皿，光程为 3 mm