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使用快速纳米定位系统从单分子FRET实验中获取结构信息

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DOI：

10.3791/54782

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2017年2月9日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysics, Ulm University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了利用全内反射荧光显微镜（TIRF）从大型供体-受体网络获取单分子FRET数据的实验装置及操作流程。通过贝叶斯推断软件Fast-NPS对这些测量数据进行逐步分析，结合适配的染料模型，可获得高分辨率的结构信息。

摘要

单分子荧光共振能量转移（smFRET）可用于实时获取生物分子复合物的结构信息。通过该方法，可利用多个 smFRET 测量数据，采用三边测量法确定蛋白质复合物内未知染料分子的位置。为了获得定量信息，纳米定位系统（NPS）结合 X 射线晶体学的结构数据与单分子荧光数据，采用概率性数据分析方法，不仅计算出最可能的位置，还计算出完整的三维概率分布（称为后验分布），以反映实验的不确定性。该概念已被推广，用于分析包含多个染料分子的 smFRET 网络。NPS 的最新版本 Fast-NPS 采用了一种新算法，基于马尔可夫链蒙特卡洛采样和并行退火的贝叶斯参数估计方法，可在相对较短的时间内分析大规模的 smFRET 网络。此外，Fast-NPS 允许为每个染料分子从五种不同的模型中选择一种，以考虑染料分子因其局部环境不同而表现出的空间和取向行为差异。

本文介绍了一种获取单分子FRET（smFRET）数据并应用Fast-NPS方法的详细实验方案。我们提供了获取Fast-NPS三个输入参数的详细操作步骤：smFRET值、染料分子的量子产率以及各向异性。近期，NPS已被用于解析古菌开放启动子复合物的结构。本研究利用该数据展示了五种不同染料模型对后验分布的影响。

引言

确定生物大分子的结构是理解其功能的关键前提。目前，两种成熟的结构解析方法是冷冻电子显微镜技术（cryo-electron microscopy）和X射线晶体学1,2。如今，这两种方法均可提供高达埃级分辨率的高分辨率结构信息。这些方法已被广泛用于解析蛋白质复合物等大型生物大分子的结构。尽管现有方法在过去几十年中不断得到改进，但生物结构的复杂性仍为结构生物学带来重大挑战，尤其是在研究大型、动态且瞬时存在的复合物时尤为突出3。

为了研究大分子复合物的动力学及其特定的结构-功能关系，单分子方法已提供了有价值的信息4。多种新策略相继发展，为获取结构与动态信息提供了正交的途径，例如高速原子力显微镜（AFM）5、机械操纵技术6、荧光定位显微镜7，以及单分子 Förster 共振能量转移（smFRET）8,9。由于 FRET 在生物大分子尺度上具有距离依赖性，早在早期就被称作分子尺10。

单分子FRET（smFRET）一个特别有趣的应用是利用其测量获得的距离信息来推断结构信息11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23。由于smFRET具有高时间分辨率，因此可以定位蛋白质结构中可移动部分的位置。然而，为了从smFRET数据中提取定量信息，需要在测量过程中确定有关染料分子的重要校正参数24。利用这些校正因子，可通过以下公式计算FRET效率 EFRET

FRET 效率公式 \(E_{FRET}=\frac{I_A-\beta \cdot I_D}{I_A+\gamma \cdot I'_D}\)；光谱学方法。,


其中 IA 和 ID 分别为受体分子和供体分子的荧光强度（见图2）。β因子用于校正串扰，即供体发射信号泄漏至受体通道的情况，其计算公式如下：

静力平衡公式，β=I'A/I'D，用于力学分析的方程。

其中 I'A 和 I'D 分别表示受体分子光漂白后供体分子和受体分子的荧光强度。

γ因子用于校正两个通道中相对检测效率的差异，以及供体和受体染料荧光量子产率的差异。它通过每条独立的时间轨迹按以下公式计算：

伽马校正公式，ΔIA/ΔID，用于图像处理分析的数学表达式。

请注意，本描述忽略了对受体分子的直接激发，而这种情况有时会变得重要，同样需要进行校正。为了确定这些校正因子，采用交替激发供体和受体的方案是十分有益的25 以区分光物理变化与结构动力学。

为了不仅获得定量的单分子FRET效率，还能获取定量的结构信息，2008年提出了纳米定位系统（Nano-Positioning System, NPS）26。该名称的选取是基于其与卫星导航全球定位系统（Global Positioning System, GPS）的相似性。NPS是一种结合单分子FRET与X射线晶体学数据的混合技术，用于定位生物大分子复合物中未知染料的位置。晶体结构作为参考坐标系，而单分子FRET结果则用于获取未知荧光团位置（天线）与晶体结构中已知位置（卫星）之间的距离信息。在连续的实验中，测量天线与多个卫星之间的距离，并通过基于贝叶斯参数估计的严格统计分析方法确定天线的位置。结果不仅可计算出天线最可能的位置，还可获得其完整的三维不确定性分布，即所谓的后验分布，并通过可信体积进行可视化。此外，NPS已被扩展，可用于分析完整的单分子FRET网络27。

NPS 已被用于解决真核转录中的多个重要问题，即上游 DNA、非模板 DNA 以及 RNA 聚合酶 II 延伸复合物中新生 mRNA 的走向12,28，同时也揭示了转录起始因子的作用26以及开放启动子复合物的动态结构29。此外，NPS 还被用于阐明古菌 RNA 聚合酶开放复合物的结构30，特别是转录起始因子 TFE 的位置，该因子与转录延伸因子 Spt4/5 竞争性地结合于相同位点31。

此后，已发表多种基于单分子FRET的结构研究方法15,18,21,23。在比较不同基于单分子FRET的结构方法时，可以明显看出，该方法的表观精度在很大程度上取决于所选用的染料模型。需要注意的是，染料分子可能因其局部环境的不同而表现出不同的空间和取向行为。

为此，研究者引入了Fast-NPS32。Fast-NPS采用了一种先进的采样算法，可显著缩短计算时间。此外，Fast-NPS还支持进行结构分析，并且用户可为每个染料分子从五种不同的染料模型中进行选择，这些模型将在下文予以介绍。其中最保守的模型称为classic（经典模型），该模型假设染料仅占据一个但未知的位置。在此位置上，荧光团可在一个锥形空间内自由旋转，锥体的大小由其相应的（时间依赖性）荧光各向异性决定。由于锥体的方向未知，因此在将测得的单分子FRET效率转换为距离时会带来较大的不确定性。从这一角度来看，该模型是保守的，因为与其他染料模型相比，它所得出的距离精度最低。仅在距离非常短的情况下，经典模型的假设才会导致明显不准确的位置判断。对于典型的单分子FRET值，真实位置始终包含在相对较大的可信体积范围内。

然而，由于更高的精度是可取的，因此开发和测试替代性染料模型非常重要，这有助于提高精度。如果染料的旋转速度远快于其固有的荧光寿命，则称为 iso 模型可被应用。此处，取向因子κ2 （用于计算特征各向同性 Förster 半径）R_iso=0，静力平衡公式，物理方程，教学用途) 设定为 2/3。因此，与经典模型相比，所计算的可信体积几乎小了两个数量级。32在荧光团所处的环境中，若不仅能够实现快速重定向，还能在整个可及体积内实现快速运动，则 meanpos-iso 应使用该模型。在此模型中，染料仅有效占据一个平均位置，空间平均效应通过多项式距离转换进行校正。15该模型适用于例如（通常为疏水性的）染料连接到亲水区域的情况， 例如， DNA。应用 平均位置-同位素 模型进一步使可信体积减小约一半。然而，与蛋白质相连的染料可能在其空间可及体积（AV）内可逆地结合多个疏水区域。若一种荧光团在这些区域之间瞬时切换，但在每个区域内进行自由旋转和快速局部运动，则最适宜用以下方式描述 方差-均值位置-同位素 模型。对于染料不能自由旋转的类似情况 方差-均值位置 模型适用。有关这些模型的更多详细信息，请参见我们最近的出版物32.

这些模型提供了广泛的选项，可专门用于描述染料可能遇到的各种环境，合理应用这些模型能够优化染料定位的精确度。在 Fast-NPS 中，连接在特定位置的每个染料分子均可分配至独立的模型，从而允许 FRET 配对分子采用不同的模型。这实现了无限灵活且接近真实情况的建模。然而，重要的是必须进行严格的统计检验，以确保最终模型组合所得结果仍与实验数据一致。这些检验已包含在 Fast-NPS 软件中。

为了将 Fast-NPS 应用于实验数据，只需测量三个输入参数。首先，必须确定染料对特异性的各向同性 Förster 半径（静态平衡方程 \( R_0^{iso} \)；工程或物理示意图。）。为此，需要测量供体染料的量子产率（QY）、供体荧光发射光谱以及受体吸收光谱。这些测量可在体相中进行，使用标准分光光度计和标准荧光光谱仪即可完成。对于每一对染料，可利用免费软件 PhotochemCAD 计算其 R0 值，并将其用于 NPS 分析。此外，还需使用具有偏振（和时间）分辨能力的荧光光谱仪获取染料分子的（时间分辨）荧光各向异性。然而，Fast-NPS 最重要的输入参数是在单分子荧光显微镜系统（如全内反射荧光显微镜（TIRFM））上测得的单分子 FRET 效率。

本文介绍了一种获取单分子FRET数据并应用Fast-NPS的逐步实验方案（图1）。

方案

1. 先决条件与实验设备

注意：测量室的组装如图3所示。测量室采用三明治结构设计，主要包括三个部件：石英玻璃（熔融石英）载玻片、密封膜和用于密封流动室的盖玻片。测量室被安装在定制的样品支架上。样品室和金属支架的尺寸设计为适配标准显微镜用石英玻璃载玻片（76 mm × 26 mm）。

  1. 使用金刚石钻头（0.75 mm）在 图4 所示位置切割石英玻璃片。石英玻璃片的设计为非对称结构，以便区分每片玻璃的两侧。
    注意：石英玻璃片在测量后可重复使用，直至表面出现划痕。
  2. 安装样品腔室时，使用如 图5 所示的定制金属样品支架。样品支架包含两个螺纹孔（M4），用于连接流动腔室的进样和出样管路。此外，使用螺纹（M3）将样品腔室固定在金属支架上，并使用另一组螺纹（M3）将棱镜支架固定在金属支架的下半部分。
  3. 在棱镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM）上进行单分子FRET（smFRET）测量（图6）。
    注意：该TIRFM配备三种激光器：绿色激光（532 nm，Nd:YAG激光器）和红色激光（643 nm，半导体激光器），分别用于激发供体和受体染料分子；蓝色激光（491 nm，二极管泵浦固态激光器），用于在smFRET测量前漂白样品腔室中的背景荧光杂质。三束激光通过声光可调滤波器（AOTF）进行空间合并并可选择性启用。荧光信号由高数值孔径物镜收集，通过二向色镜分为供体和受体两个通道，并投射到两台EM-CCD相机上。样品腔室安装在微米级位移台上，可通过两个步进电机实现x和y方向的移动。第三个压电电机与红外激光器及位置敏感探测器配合，构成自动对焦系统，确保整个实验过程中始终处于最佳焦平面。
    1. 当观察到FRET时间轨迹中存在动态变化时，采用交替激光激发（ALEX）方法25。此类动态可能由分子内部的构象变化或受体亮度波动及受体闪烁引起。
      注意：ALEX可区分这两种可能的原因，避免对动态FRET轨迹的误读。然而，为简化说明，本方案部分仅限于分析未使用ALEX拍摄的图像序列。
      警告：单分子荧光装置中使用了3B类激光器。在系统运行前，必须根据当地政府法规采取充分的激光安全防护措施。
  4. 使用紫外-可见光谱仪（UV-VIS）进行用于测定量子产率的吸收测量（见材料与方法部分）。
  5. 使用荧光光谱仪测量供体的荧光发射光谱、受体的吸收光谱以及荧光各向异性（见材料与方法部分）。
  6. 按照已发表的流程33制备样品腔室。也可采用文献[34]中描述的方法。
  7. 将待研究样品标记上适用于smFRET的供体-受体染料分子对，并确保样品上带有生物素基团，以便在样品腔室表面固定。
    注意：为了利用Fast-NPS软件定位未知的天线染料位置，需要构建多种不同的样品。每种构建体需在一个未知的天线染料位置和一个来自晶体结构已知的卫星位置各标记一个染料。为获得准确结果，至少需要三种不同的构建体，其中染料连接在天线位置，并分别与三个不同的卫星位置配对。同时测量天线之间以及卫星之间的距离也有助于提高精度，但这需要更换染料分子，并在数据分析时正确输入相关信息。

2. 将流动室安装至定制支架中

  1. 将硅胶管（0.8 mm 内径，2.4 mm 外径）穿入中空头螺钉（M4）中，使用锋利的剃刀在两端将管子切齐，两侧各留出约 1 cm 的伸出长度。然后调整管子在一侧螺钉端的伸出长度至约 2 mm。
  2. 将流动池安装到样品架中，使石英玻璃片上的孔与样品架中的螺纹对齐。轻轻拧紧进样口和出样口的螺钉，以确保样品池的进样口和出样口仍可穿刺。轻轻拧紧丙烯酸玻璃架上的四个螺钉，以固定流动池的位置。
  3. 将硅胶管（0.58 mm 内径，0.96 mm 外径）切成 20 cm 长的管段。将其中一段插入测量池的进样口和出样口螺钉中。使用夹子封闭进样口和出样口的管路。
    注意：组装好的样品池可在室温下保存最多两周。

3. 在TIRF显微镜上进行单分子FRET测量

  1. 使用注射器冲洗样品室 500 µL PBS。更换不同缓冲液时，务必在进样管末端形成液滴，以始终防止气泡进入样品室。
  2. 用缓冲液冲洗样品室 100 µL 链霉亲和素（0.5 mg/mL PBS 溶液），室温孵育 15 分钟。
  3. 洗去中性亲和素溶液 500 µL PBS。
  4. 将棱镜的金属支架拧到样品室上。
  5. 将样品室安装到TIRF显微镜的微米级载物台上。确保将样品室尽可能水平地正对物镜安装，以避免扫描过程中出现失焦。
  6. 启动控制EM-CCD相机的软件以及控制载物台压电马达的软件。
  7. 通过观察红外激光的反射来调节显微镜物镜的焦点。
  8. 将棱镜（PS991，n = 1.52）放置在金属棱镜支架上方。调整棱镜的横向位置，确保激光束能够照射到棱镜，然后使用粘合剂并在紫外光下孵育5分钟。
    注意：安装好的棱镜可通过清洁后重复使用。
  9. 在相机控制软件中，点击“Setup Acquisition”，并设置以下采集参数：100 ms 积分时间，401 帧/电影（绿色相机），400 帧/电影（红色相机），电子倍增增益 225，前置放大器增益 5x，读出速率 3 MHz（14 位）。
  10. 在本地硬盘上为测量数据创建一个文件夹，并为测量文件选择一个合适的名称。 例如，年-月-日。在软件设置中进入“自动保存”选项卡，启用“自动保存”功能，并选择文件格式 *.sif 用于视频采集。选择硬盘上的存储文件夹，使用该文件夹名称作为文件名前缀。
  11. 启用“自动递增”功能（起始值设为1）。启用将操作者信息附加到文件名的功能。供体和受体通道分别使用“DON”和“ACC”。选择“_”作为分隔符。
  12. 在相机控制软件中，点击“Video”以启动相机的实时成像，并使用三种激光器的最大激光强度（组合约3,000 W/cm²）扫描样品腔，漂白背景荧光。2 每个视野10秒。
  13. 关闭蓝色激光器。将绿色激光器的强度降低至约 200 W/cm2 约 40 mW/cm2 如果使用交替激光激发（ALEX）方法，则针对红色激光。
  14. 将生物素标记的荧光样品稀释至浓度为 50–100 pM。上样 100 µL 溶液的。样品在结合后固定于腔室表面。
    注意：切勿使样品室过载，相邻分子之间必须保持一定间距。
  15. 如有必要，加载额外的 100 µL 向腔室中加入浓度高2倍的样品。
  16. 加载完成后，使用夹具封闭测量室的进液管和出液管。
  17. 关闭所有激光器，并使用压电马达将流动室移动两个视野的距离。
  18. 在相机控制软件中，点击“采集信号”以开始录制视频，同时打开激光器。通过调节激光功率，确保视频结束时超过80%的分子被漂白。
  19. 对整个预漂白样品腔区域重复步骤 3.17 和 3.18。

4. 转化图谱（“beadmap”）的获取

  1. 按照第 1.1、1.2 和 2 节所述方法制备流动腔室。
  2. 使用包被亲和素的多光谱荧光微球，该微球在供体和受体通道中均显示荧光发射。将原液涡旋震荡 1 分钟，然后将 50 µL 原液与 50 µL 去离子水（ddH2O）混合稀释。再次涡旋震荡 1 分钟，超声处理 1–2 分钟，最后再涡旋震荡 10 秒。
  3. 执行单分子 FRET 测量中所述的步骤（第 3.5–3.10 节）。
  4. 将 100 µL（1 个腔室体积）稀释比例为 1:2 的荧光微球溶液加入流动腔室中。静置 10 分钟，使荧光微球结合到表面。
  5. 采用第 3.9 节中的采集参数，但将视频时长调整为 26（绿色相机）和 25（红色相机），并将电子倍增增益设为 10。
  6. 将绿色激光的强度设置为 20 W/cm2。
  7. 在视野范围内含有约 50–100 个微球的位置采集一段视频。

5. 单分子FRET数据的处理与分析

  1. 使用自行编写的软件 SM FRET 分析微珠图谱（参见材料与方法）及采集的视频。启动程序 viewPlot1.m。
  2. 点击“分析|批量分析”，如果未使用 ALEX 模式，则取消勾选“ALEX”选项。为获得最佳性能，选择“高”峰检测阈值。点击“确定”。
  3. 当提示是否已有微珠图谱被分析过时，选择“否”。浏览包含已采集微珠图谱的文件夹，并双击选择 *.sif 文件。在下一个对话框中点击“确定”。
    注意：如果在之前的测量中已分析过微珠图谱，则在此处选择“是”，通过浏览至正确文件夹并双击已保存的微珠图谱 *.map 文件来选择该图谱。然后继续执行步骤 5.8。
  4. 选择位于视场对角两个角落的两个单独微珠。像素强度以颜色编码显示，从深蓝色（低强度）到深红色（高强度）。
  5. 点击第一个微珠的中心。如果能通过颜色编码清晰定位分子中心，则选择“是”；否则点击“否”，并选择另一对分子。
  6. 将十字光标置于显示最大强度的像素上，然后按“KEEP”。对第二个通道重复此过程。
  7. 点击对角另一角落的分子，并重复步骤 5.5 和 5.6。
    注意：两个通道之间的相对像素偏移将在命令窗口中显示，变换图谱将自动保存为 *.map 文件，存储在包含微珠图谱 *.sif 文件的文件夹中。
  8. 为加载供“批量分析”的供体和受体视频（*.sif），浏览至相应文件夹，选择所有需分析的视频，然后点击“确定”。在下一个对话框中点击“确定”。
    注意：当命令窗口中显示的最后一行以“Finished analyzing…”开头时，表示批量分析已完成。检测到的分子将在新窗口中显示，同时显示由变换图谱确定的供体与受体通道之间的相对偏移。
  9. 要加载批量处理后的视频文件，请点击“文件|加载”。如果未使用 ALEX 模式，则取消勾选该选项。将平滑宽度（smoothwidth）设为 10，然后点击“确定”。选择包含 *.ttr 文件的文件夹，在下一个上下文菜单中点击“全选”和“确定”。
  10. 如果显示的轨迹呈现出典型的单分子 FRET 相位（图 2），请点击切换按钮“未选中”，首先通过移动鼠标光标并单击左键，选择 FRET 事件起始的时间点；接着选择受体分子漂白的时间点；最后选择供体分子漂白的时间点。
  11. 在下一个窗口中，FRET 效率将以蓝色曲线绘制。如需选择该轨迹，请点击“是”按钮；否则点击“否”。如需重新访问某条时间轨迹，可点击“上一条”按钮。
  12. 重复上述过程，直至处理完视频中的最后一个分子。
  13. 在完成一个视频中最后一个分子的分析后，点击“文件|保存”以保存所选轨迹。将所选轨迹保存在与 *.sif 文件相同的文件夹中。
  14. 对所有采集的视频重复执行步骤 5.10–5.13。
  15. 运行程序 combine_fret_results.m。选择包含所有 *.res 文件和 *.FRETonly_trace 文件的文件夹。将分子级别的 FRET 数据和帧级别的 FRET 数据分别保存为 MW.dat 和 FRW.dat。
    注意：*.dat 文件将以 ASCII 格式保存。FRW.dat 文件包含六列，每一 FRET 帧对应一行，第六列为校正后的帧级别 FRET 效率。MW.dat 文件包含 21 列，每个选定的 FRET 分子对应一行，第三列为分子级别的 FRET 效率。

6. 在直方图中展示单分子FRET数据

注意：为了提取所有记录的单分子FRET数据的平均FRET效率，需将逐帧数据或单分子数据绘制成直方图，并通过高斯拟合（单个或多个峰）进行分析。下述方案使用商业数据分析软件（见材料列表），但也可使用其他任何可用的软件替代。

  1. 打开数据分析软件（参见材料列表）。点击 文件|导入|多个ASCII。选择包含 FRW.dat 文件的文件夹。选中该文件后点击“确定”。接受默认输入选项，无需更改，直接点击“OK”。
  2. 选中包含校正后FRET效率的第三列C(Y)，右键单击该列，选择 绘图|统计|直方图。在直方图窗口中双击柱状图，取消勾选“自动分组”，并设置所需的分组大小，e.g.，0.05。同时设定起始和终止值，e.g.，-0.025 和 1.025。
  3. 通过左键单击选中直方图中的柱体。然后右键单击并选择“转到分组工作表”。左键单击选中“Counts”列，再次右键单击，选择 绘图|柱状图/条形图/饼图|柱状图。
  4. 在柱状图中进入 分析|拟合|非线性曲线拟合|打开对话框。在“函数”下选择“Gaussian”，然后切换到“参数”选项卡。取消自动参数初始化。将偏移值（y0）固定为0。点击“拟合”。
    注意：拟合函数及拟合细节将显示在柱状图中。“xc”值表示拟合函数的中心，i.e.，即作为NPS软件输入参数的平均FRET效率。

7. 量子产率的测量

  1. 采用相对法进行量子产率测定，方法类似于 Würth 所描述的实验步骤 等35，以溶于乙醇的罗丹明101（QY = 91.5%）作为标准。
  2. 使用紫外-可见分光光度计记录吸收光谱 80 µL 在光程为1 cm的吸收比色皿中测量体积。用于荧光激发的波长处的吸光度必须≤ 0.05。
  3. 在以灯校准、工作于光子计数模式的光谱仪上记录发射光谱。在激发光路中使用格兰-汤普森偏振片进行测量（0°）和发射（54.7°）光路（魔角条件），激发和发射单色器的光谱带宽分别设置为约5 nm和2.5 nm。将样品转移至光程为3 mm的荧光比色皿中进行测量，注意确保计数率不超过106 s-1.
    1. 根据以下方法计算量子产率

静态平衡方程；用于光谱分析研究的荧光量子产率公式示意图。

其中，n 和 nStd 分别为样品溶剂和标准物质的折射率；f(λ) 和 f_Std (λ) 分别为样品和标准物质在波长 λ 处的荧光强度；A(λex) 和 Astd (λex) 分别为样品和参比物质在激发波长处的吸光度，Φstd 为标准物质的量子产率。

8. 各向同性 Förster 半径的计算

  1. 根据供体分子的发射光谱、受体分子的吸收光谱、供体的量子产率以及介质的折射率，计算各向同性的 Förster 半径（静态平衡方程 \( R_0^{iso} \)；工程或物理示意图。）。可使用免费软件 PhotochemCAD 来计算 静态平衡方程 \( R_0^{iso} \)；工程或物理示意图。，但也可使用其他任何可用的软件36。

9. 各向异性的测量

  1. 通过记录不同激发/发射偏振片设置（V/V、V/H、H/V、H/H）下的荧光光谱，确定稳态荧光各向异性36。
  2. 根据比值计算每个波长的G因子，用于校正仪器的偏振伪影

偏振分析中的g因子方程；光谱学研究中使用的强度比公式。

      并利用它计算每个波长的各向异性值：

荧光各向异性方程：静态平衡；r(λ) 公式，科学数据分析。

      其中 Ixy 表示激发偏振方向为 x、发射偏振方向为 y 时的荧光强度。

  1. 对发射光谱范围内的数值取平均，以计算稳态荧光各向异性。

10. Fast-NPS 软件的安装

  1. 从 http://www.cgl.ucsf.edu/chimera 下载 UCSF Chimera，并按照安装指南进行操作。
  2. 访问乌尔姆大学生物物理研究所网站：https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html，下载 Fast-NPS 的最新版本并解压至选定文件夹。打开子文件夹“Redistributable”，安装适用于操作系统的 Visual C++ Redistributable。

11. 对 pdb 文件进行居中处理

  1. 在 Chimera 中打开感兴趣的 pdb 文件。选择大分子复合物的所有原子，并计算其质心坐标（工具|结构分析|轴/平面/质心|定义质心…|确定）。
  2. 打开回复日志（收藏|回复日志）和变换工具（工具|移动|变换坐标）。将回复日志中显示的质心坐标输入到“变换坐标”窗口的“平移”文本框中，并将每个坐标的符号取反。点击“应用”，然后通过“保存 PDB”（文件|保存 PDB）保存文件。

12. 设置位置先验

注意：所有数值均以埃为单位。

  1. 启动技术计算语言，并将当前文件夹更改为本地 Fast-NPS 文件夹。在命令窗口中输入：FastNPS。
  2. 在项目管理器中创建一个新的作业文件（项目|新建）。
  3. 设置位置先验（工具|模型染料先验）。
  4. 在“先验基础”面板中，通过输入数值（建议值为2）来定义位置先验的空间分辨率。
  5. 通过勾选复选框并点击“load PDB”按钮，排除大分子内部区域。按照第11节所述方法，选择并加载居中的pdb文件。
  6. 输入染料的近似直径（建议为13 Å，参见讨论部分）。
  7. 输入一个骨架化距离， 即， 染料分子可能渗入大分子的距离（建议为2 Å）。
  8. 在“最大先验尺寸”面板中输入位置先验的最小和最大坐标（推荐：x 为 [-150,150]，y 为 [-150,150]，z 为 [-150,150]）。
  9. 定义卫星分子时，在“prior basics”面板中勾选“attachment via flexible linker”复选框，并在“linker”面板中输入染料分子所连接的原子坐标（基于居中的pdb文件）。此外，通过输入数值指定连接臂的长度和直径（建议值分别为13 Å和4.5 Å，详见讨论部分）。若为天线分子，则跳过此步骤。
  10. 点击“计算可及体积”按钮。
  11. 保存位置信息，并可选择导出以便使用 Chimera 等软件进行可视化。

13. 定义网络几何结构

  1. 打开定义测量窗口（模式 | 编辑几何）。
  2. 在“染料”面板中按下“新建”按钮以创建新的染料分子。
  3. 通过输入数值来设定其荧光各向异性（第9节），并在“染料模型”下拉菜单中选择一种染料模型。
  4. 按下“加载”按钮，选择相应的位置，并勾选染料的激活复选框。对所有染料重复此操作。 即， 对于所有天线以及所有卫星。
  5. 在制备所有染料后，定义测量参数。在“测量”面板中点击“新建”以创建新的测量。
  6. 在下方的下拉菜单“Dye1”和“Dye2”中选择其FRET配对染料。
  7. 输入该染料对的单分子FRET效率（含误差）和各向同性的Förster半径。
  8. 最后，勾选该测量项的激活复选框。对所有测量项重复此操作。
    注意：网络通常会变得越来越复杂，用户可能会因此感到困惑。为防止出错，可通过点击“检查网络”按钮来直观地检查网络。图中显示了已激活的染料，并通过连接FRET染料的线条指示测量关系。

14. 计算

  1. 打开计算窗口（模式|计算）。
  2. 如果网络中的每种染料均已分配特定模型，请选择“用户自定义”，然后点击“计算”以开始计算。若要使所有染料使用同一模型，请从五种模型（classic、iso、meanpos-iso、var-meanpos-iso 和 var-meanpos）中选择其一，然后继续。
    注意：命令窗口将显示计算进度。计算完成后，Fast-NPS 将弹出提示消息。

15. 结果的可视化

  1. 为了导出染料的可信体积，请打开“查看结果”窗口（Model|View Results）。
  2. 导出染料密度：
    1. 可单独导出染料，也可同时批量导出所有染料。若要导出单个染料，请在“显示的染料”面板中选中该染料，然后点击“导出密度”。输入分辨率（建议设为2），并选择导出文件类型。右侧将预览该密度图，并显示其部分数学特征。
    2. 若要同时导出所有染料，请点击“批量导出”。
  3. 在Chimera中打开生成的密度文件。

16. 所选模型组合的一致性检验

  1. 打开“查看结果”窗口（Model|View Results）。如果在“计算信息”面板中，“一致性”文本框显示的数值低于90%，则当前模型未能充分反映所测得的单分子FRET效率，因此不一致。
  2. 若出现不一致情况，请点击“详细一致性”按钮。查找测量值低于90%的条目。如果一个或多个染料主要参与了这些测量，则其模型可能是导致不一致的原因。请考虑为这些染料选择不同的染料模型，并重新运行Fast-NPS计算。

结果

转录是所有生物体基因表达的第一步。在古菌中，转录由单一的RNA聚合酶（RNAP）完成。与真核生物相比，古菌的RNAP在结构上与其真核对应物具有显著的相似性，但其转录机制更为简单。因此，古菌可作为研究真核生物RNA聚合酶II（Pol II）转录起始的模型系统。最近，通过单分子FRET和NPS技术已解析出古菌RNA聚合酶开放复合物的完整结构。NPS分析所得数据被用于构建完整的古菌开放启动子复合物模型，为转录起始机制提供了有价值的见解。

为了阐明该结构，测量了位于开放启动子复合物内的未知天线染料分子与多个已知的卫星染料分子之间的单分子FRET效率，这些卫星染料分子被引入RNA聚合酶（RNAP）中的五个参考位点，其位置由晶体结构确定（pdb-ID: 2WAQ）37。天线染料被连接至非模板DNA、TFB、TBP或TFE的不同位点之一。本研究中使用的完整距离网络包含超过60个测量距离。

图7展示了基于NPS分析构建的完整古菌开放启动子复合物模型。该模型包含双链启动子DNA（浅蓝色和深蓝色）、RNA聚合酶（灰色）以及转录起始因子TBP（紫色）、TFB（绿色）和TFE（黄色）。该模型与NPS分析结果叠加显示，即通过经典模型（A）、iso模型（B）、meanpos-iso模型（C）、var-meanpos-iso模型（D）和var-meanpos模型（E）计算得到的可信体积。

TIRF 显微镜、紫外/可见光分光光度计示意图；FRET 效率、Förster 半径；Fast-NPS 分析。
图 1： Fast-NPS 计算所需参数的获取与处理流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光强度与时间关系图；光激发过程的数据分析。
图 2： 单分子FRET事件的典型荧光强度随时间变化轨迹。 供体（绿色）和受体分子（红色）的荧光强度显示了三个特征阶段，即 I：单分子FRET阶段，II：受体光漂白后的供体荧光，III：供体光漂白后的背景荧光。请点击此处查看该图的放大版本。

使用石英载玻片、流动通道、棱镜和丙烯酸支架的光谱学光学装置示意图。
图3： 单分子FRET实验用流动室的示意图。 流动室安装在一个定制的金属支架上，并配有丙烯酸玻璃固定件。该流动室采用三明治结构，包括一块带有两个孔的石英玻璃（熔融石英）载玻片，用于连接进样和出样管路，中间为密封膜，顶部由盖玻片封闭流动室。用于TIRF激发的棱镜安装在流动室的下半部分。中空凸耳螺钉提供流动室的进样口和出样口。请点击此处查看该图的放大版本。

石英玻璃载片示意图；尺寸为76x26x1mm；适用于实验装置的进液-出液流路设计。
图4： 石英玻璃载片与密封膜的制备。 石英玻璃载片的机械设计图，标示了孔位位置（单位：毫米）。请点击此处查看该图的放大版本。

铝制和丙烯酸支架尺寸示意图、工程图、设备制造。
图5： 流动室的机械结构图。 铝制棱镜支架、丙烯酸玻璃支架和铝制安装框架的尺寸以毫米为单位给出。请点击此处查看该图的放大版本。

用于激发和发射分析的激光器、EM-CCD、AOTF 的光学光谱装置示意图。
图 6： 用于单分子FRET实验的棱镜型全内反射荧光（TIRF）装置的示意图。 光学元件缩写：A，光阑；DM，二向色镜；F，发射滤光片；L，透镜；M，反射镜；O，物镜；P，棱镜；PSD，位置敏感光电二极管；S，样品；PS，定位平台；T，望远镜。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA-蛋白质结合分子模型示意图，显示ntDNA与不同蛋白质的相互作用。
图7： 不同模型假设的模拟结果。 所有图像均显示古菌RNA聚合酶（pdb-ID: 2WAQ，顶视图），以及启动子DNA模型（tDNA和ntDNA分别为蓝色和青色）、TBP（紫色）、TFB（绿色）和TFE（黄色）组成的古菌开放复合物30。可信体积叠加显示了NPS模拟结果：（A）经典模型，（B）iso模型，（C）meanpos-iso模型，（D）var-meanpos-iso模型，以及（E）var-meanpos模型。所有体积均以68%置信度显示。经典模型和var-meanpos网络与单分子FRET（smFRET）数据一致；相比之下，若所有荧光染料均采用iso、meanpos-iso或var-meanpos-iso模型的网络，则与实测数据不一致。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们介绍了用于精确定量测定通过柔性连接臂连接至生物大分子的染料之间FRET效率的实验装置与操作流程， 即核酸和/或蛋白质。

为确保精确的单分子Förster共振能量转移（smFRET）测量（第3节），在测量过程中必须始终排除流动池中的空气。此外，务必避免荧光染料过载，荧光分子之间必须清晰分离，以保证正确分析。由于不显示供体漂白的smFRET分子对需从分析中剔除，因此需确保 >视野中80%的分子在视频结束时已漂白。为校正样品中的不均一性， β-因子和 γ-因子，用于分别校正每个FRET对的供体和受体通道间的串扰以及相对检测效率。

相机设置（第3.9节中描述的积分时间、电子倍增增益、前置放大器增益和读出速率）应设定为在信噪比、动态范围和时间分辨率之间取得最佳平衡的数值。若实验条件不同或使用不同硬件，需重新调整这些参数。帧数需足够高，以确保在观察时间内大多数供体分子发生漂白。

在荧光光谱仪上进行测量（第7至9节）时，需在信号强度与所记录数据的光谱分辨率之间找到一个良好的折中方案。为此，应根据所使用的仪器和样品浓度，调整荧光光游戏副本中激发和发射光路的狭缝宽度。

此外，我们介绍了 Fast-NPS 分析方法，用于获取瞬态或动态大分子复合物的结构信息。NPS 已被应用于揭示古菌 RNA 聚合酶开放复合物中非模板 DNA 链的路径以及转录起始因子的位置。通过利用包含 60 多个不同距离测量值的网络，我们证明了配备新实现采样引擎（Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. 正在准备中），减少了分析该复杂单分子FRET网络所需的时间 ≈相较于原始的全局NPS方法，快了2个数量级27该算法的稳健性源于结合了并行退火方案的Gibbs采样器内的Metropolis算法。Fast-NPS在分子网络分析结果上具有精确的可重复性，并与先前发表的结果一致30.

已有多种不同的方法发表，旨在从单分子荧光共振能量转移（smFRET）测量中推断结构信息11,12,13,14,15,16,17,18。所有这些方法仅提供一种特定的染料模型。因此，若染料不符合相应模型所作的假设，则无法使用该方法，或会导致错误的结构信息。相比之下，Fast-NPS 允许为每个染料分子选择不同的模型。这有助于考虑染料分子本身及其连接臂所表现出的不同构象行为。染料分子所处的局部分子环境及其物理性质将决定哪种模型最为合适。

对于所分析的古菌起始复合物的单分子FRET网络，若对所有染料分子采用各向同性假设，其可信体积的大小将相较于经典模型显著减小。当结合所有染料分子的动态位置平均时，所有可信体积（95%置信水平）的中位数减小至不足0.5 nm3。然而，这些染料分子的后验分布与其实测的单分子FRET数据不再一致，表明所采用的假设会导致错误的结构信息。相比之下，采用经典模型所确定的后验分布在结果上与测得的单分子FRET效率保持一致。

由于假设所有染料分子均呈现各向同性或动态位置平均会导致不一致的结果，Fast-NPS 允许为每种染料分子设置先验分布，使每种染料可被分配至五种模型之一。每种模型使用相同的可及体积。用于计算染料可及体积（AV）的算法基于若干假设：首先，荧光团的空间形状被近似为球形，因此应使用一个综合考虑荧光团宽度、高度和厚度的直径值（第12节）。此外，连接臂的形状被近似为柔性杆。第12节中提供的数值是针对通过12-C连接臂连接的 Alexa 647 染料计算得到的。目前尚无法在实验前准确判断在给定实验构型下哪种模型最为合适，因此应测试所有模型。通常应选择在与数据保持一致的前提下产生最小后验分布范围的模型。为检验模型选择是否与单分子荧光共振能量转移（smFRET）数据一致，需同时计算后验分布和似然函数。一致性是指从后验分布中采集的样本中，超过90%位于似然函数的95%置信区间内。

尽管确实各向异性越低，距离的不确定性就越小，但在smFRET网络中，还必须考虑荧光染料分子的空间几何排布。因此，虽然通常首选使用iso模型来描述荧光各向异性较低的染料分子，但一致性检验为选择正确的染料模型提供了更直接的方法。染料模型的最佳选择可显著提高定位精度，同时保持网络与其FRET数据的一致性。

总之，Fast-NPS 能够获取大型大分子复合物的结构与动态信息。与X射线晶体学或冷冻电子显微镜等常规结构方法相比，该技术可用于监测高度柔性或瞬时存在的复合物，从而极大地拓展了我们对复杂生物过程机制的理解。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 B. Gruchmann 提供的流室机械设计图。此外，我们还要感谢 Max Beckers 和 Florian Drechsler 就纳米颗粒示踪技术（NPS）及其底层采样引擎提出的富有见地的评论和讨论。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
流动池制备
定制金属样品台自行搭建n/a
石英玻璃载玻片，76 mm x 26 mmTechnical Glass Products26007
盖玻片，60 mm x 24 mmMarienfeld101242
清洗剂，Hellmanex IIHellma320.001
Synergy UV 超纯水Millipore2512600
Zepto 等离子清洗仪Dienern/a
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，p.a.Sigma-AldrichA3648
甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯，5 kDaLaysan Bio Inc.MPEG-SVA-5000-1g
生物素化聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯，5 kDaLaysan Bio Inc.BIOTIN-PEG-SVA-5000
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761 Sigma 
碳酸钠Sigma-AldrichS2127 Sigma-Aldrich 
密封膜（Nescofilm）Fisher Scientific12981805
Tygon 柔性硅胶管，内径 0.8 mm，外径 2.4 mmSaint-Gobain Performance Plastics720958
细内径聚乙烯管，内径 0.58 mm，外径 0.96 mm（Smiths Medical）Fisher Scientific12665497
中性亲和素（Neutravidin）Life TechnologiesA2666
全内反射荧光显微镜
Nd:YAG 激光器，532 nmNewport Spectra-PhysicsEXLSR-532-100-CDRH
二极管泵浦固态激光器，491 nm，CalypsoCobolt904010050
二极管激光器，643 nm，iBeam smartTopticaiBEAM-SMART-640-S
二向色镜，532 RDCChromaF33-540
二向色镜，476 RDCChromaF33-476z
声光可调滤波器AA Opto-ElectronicAOTFnC-VIS
平凸柱面透镜，f = 75 mmThorlabsLJ1703L1-A
平凹柱面透镜，f = -300 mmThorlabs
棱镜，PS 991ThorlabsPS991
聚焦透镜，f = 75 mmThorlabsLA1608-B
注射泵，PHD 2000Harvard Apparatus70-2002
2 个步进电机，Z812BThorlabsZ812B
压电致动器，PE4ThorlabsPE4
红外二极管激光器Edmund OpticsCPS808自动聚焦系统组成部分
二向色镜，775 DCXRChroma775 DCXR
位置传感探测器（PSD），PDP90AThorlabsPDP90A自动聚焦系统组成部分
水浸物镜，Plan Apo 60X WI，NA 1.2NikonMRD07601
二向色镜，645 DCXRChroma645 DCXR发射光路组成部分
发射滤光片，3RD550-510Omega Optical3RD550-510发射光路中的绿色通道
发射滤光片，3RD660-760Omega Optical3RD660-760发射光路中的红色通道
EMCCD 相机，iXon+ DU897EBVAndorAND-20-00032
EMCCD 相机，iXon3 DU897D-BVAndorAND-20-000141
其他
Varian 50Cary紫外-可见分光光度计
Fluorolog2SPEX荧光分光光度计
Solis（V4.15）AndorEM-CCD 相机控制软件
Apt 用户工具 （V1.022）Thorlabs压电电机控制软件
Norland 光学胶 68Thorlabs粘合剂
PC-AFN-0.8 Nile redKisker Biotech亲和素包被的荧光多色微球 
MatlabMathworks用于自定义编写软件的技术计算语言
Origin（V9.0）Originlab科学绘图与数据分析软件
Hellma 105-202-15-40Hellma105-202-15-40光程长度为 1 cm 的吸收池
Hellma 105-251-15-40Hellma105-251-15-40光程长度为 3 mm 的荧光比色皿

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