利用药理学干预与高精度无线电遥测技术研究自由活动动物的空间认知

摘要

本文介绍了一种新颖的实验方案，该方案结合了记忆的药理学操控与无线电遥测技术，以记录并量化认知在导航中的作用。

摘要

动物感知和学习环境的能力在许多行为过程中起着关键作用，包括导航、迁徙、扩散和觅食。然而，由于在监测、操控认知以及追踪野生动物方面存在方法学上的困难，目前对认知在导航策略发展及其潜在机制中所起作用的理解仍然有限。本研究描述了一种结合药理学行为操控与高精度无线电遥测技术来探究认知在导航中作用的实验方案。该方法利用东莨菪碱（一种毒蕈碱型乙酰胆碱受体拮抗剂）来干预动物的空间认知能力，随后对处理后的动物进行高频度、高空间分辨率的追踪监测 通过 远程三角测量。该方案应用于东部锦龟（Chrysemys picta）种群中Chrysemys picta）在季节性短暂水体中已生存约100年，通过精确（±3.5米）、复杂的路径在相距较远的水源之间迁移即，具有高度曲折性且穿越多种生境的非线性路径），以及在4岁前习得的可预测路线。本研究表明，这些海龟所采用的行为模式与空间记忆的形成和回忆过程相一致。综上，这些结果支持空间认知在复杂导航中的作用，并凸显了在认知与导航研究中整合生态学与药理学技术的重要性。

引言

认知（此处定义为"从环境中获取、存储和使用信息所涉及的所有过程"¹）在一系列复杂的导航任务中起着核心作用²。例如，沙丘鹤（Grus canadensis）的迁徙精确性会随着经验积累而显著提高³，而海龟物种在孵化时即对其出生海滩形成印记，并在成年后返回该地^4-6。同样，动物能否成功迁徙、扩散和觅食，取决于其获取空间环境信息的能力^7,8。一些动物似乎会根据特定的地貌特征学习导航路线⁹，并在往返于繁殖地与觅食地之间时运用空间认知能力¹⁰。近期对东部彩龟（Chrysemys picta）的研究表明，其导航能力存在一个关键期，成年个体能否成功穿越高地生境，取决于幼年时期在一个狭窄年龄范围（< 4岁）内的经验^11-13。尽管这些研究共同展示了在理解学习对导航作用方面所取得的进展^{4-6, 14-16}，但此类行为背后的机制以及认知在导航中的完整作用仍不明确，尤其是在脊椎动物中^{8, 17, 18}。

关于认知在导航中作用的野外研究十分罕见^{2, 8, 18}，这主要归因于监测、操控和追踪野生动物所涉及的方法学困难。例如，许多动物在广阔的时空尺度上进行导航，这往往使得研究者难以探究这些动物可能学习的信息类型以及这些信息的获取方式。在如此大范围和长时间尺度上监测动物行为时，实验人员常常面临检测和定位动物的后勤难题，从而限制了可收集的数据类型以及可得出的结论。尽管使用动物佩戴的全球定位系统（GPS）记录仪可能提高对活动范围广泛动物的检测概率，但通过这些手段收集的空间数据通常分辨率非常粗糙，且缺乏详细的行为信息。因此，在此类条件下收集的数据在考察不同群体或实验处理之间行为细微差异方面的价值有限。同样，目标行为的直接、受控操控通常也受到导航行为典型的时空尺度以及野外研究固有后勤限制的制约。在自然栖息地中寻找动物、捕捉并对其进行操控，然后在不无意中引发虚假行为的前提下收集行为数据，是野外动物研究中的主要挑战。因此，对自由活动动物开展实验的设计往往受到限制，针对认知在导航中作用开展严格、受控的野外实验的能力也十分有限。

本研究通过结合药物干预与在野外条件下对自由移动动物进行高分辨率追踪的新方法，克服了以往在实地研究认知与导航关系时面临的诸多困难。东莨菪碱是一种毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR）拮抗剂，已被证明可通过阻断多种脊椎动物类群脑内的胆碱能活性，抑制空间记忆的形成与回忆^18-24东莨菪碱可在野外条件下有效用于自由活动的动物^{11, 18} 且具有显著但暂时的效果（例如，爬行动物为6-8小时）。甲基东莨菪碱是一种不能穿过血脑屏障的毒蕈碱型乙酰胆碱受体拮抗剂^19-21可用于控制东莨菪碱可能产生的外周效应以及行为的非认知方面影响¹¹药理学通过直接作用于受体实现对认知的精确调控，而高精度无线电遥测技术则可用于观察其对行为产生的效应。所采集的测量数据 通过 利用高空间分辨率（±2.5 m）和高时间分辨率（15分钟）的远程三角测量技术，可对动物行为进行精确定量记录，并关联认知实验操控进行分析。

本研究¹¹于2013年和2014年5月至8月期间在美国马里兰州肯特县切萨皮克农场（Chesapeake Farms）进行，该地位于北纬39.194°、西经76.187°，是一个占地3300英亩的野生动物管理和农业研究区域。本实验方案包含五个主要步骤：（1）捕获和处理动物；（2）安装无线电发射器；（3）配制药理学试剂；（4）监测和操控动物的移动行为；（5）分析空间数据。本文所述研究聚焦于东部彩龟（Chrysemys picta）。该种群中的龟类每年会进行陆地迁移，离开其栖息池塘，并利用四条极为精确（±3.5 m）、复杂且高度可预测的路径之一，迁往其他水生栖息地^{11, 12}。在此系统中结合药理学干预与高分辨率无线电遥测技术，有助于揭示认知在野生动物自由导航行为中的作用。

方案

所有涉及动物受试者的实验程序均经富兰克林与马歇尔学院和华盛顿学院的机构动物护理与使用委员会批准，并遵循所有地方、州和联邦法规。

1. 捕获与处理

1. 将 hoop 捕捉器放置在已知有龟类栖息的目标水体中。确定水深，确保捕捉器有 4 - 5 英寸的部分保持在水面以上，以便被捕获的龟能够浮出水面呼吸。务必使用横梁将 hoop 捕捉器完全展开并固定至最大长度，防止捕捉器塌陷。将捕捉器用桩固定在水体底部，防止其漂移。
2. 使用数条死鱼、鸡肝、鸡颈、一罐猫粮 和/或 一罐蔬菜作为诱饵进行诱捕²⁵。
3. 每日检查捕捉器两次，并取出龟类。从捕捉器中取出龟时，应握住其身体两侧，并小心避免被其爪子或喙状嘴部伤害。
   1. 释放兼捕的非目标物种。如需继续捕捉，则重新设置捕捉器。评估诱饵状态，若诱饵已被消耗，则补充更多诱饵。如无需进一步捕捉，则将捕捉器拖至岸边。
4. 如需进行，可确定龟的性别和年龄^{26, 27}。
5. 将龟放入暂养袋中，使用弹簧秤测量其体重，精确至克（g）。
6. 将龟转移至实验室时，使用温控运输箱，并在箱内加入少量水。将动物单独饲养于水族箱中，使用未经处理的池塘水，水温维持在约 25 °C，水深以仅能覆盖龟的头部为宜。

2. 安装无线电发射器

1. 为最大限度延长发射器寿命并提高输出性能，应选择尽可能大的无线电发射器，但其重量不得超过动物体重的5%²⁸。
2. 确定发射器在背甲上的安装位置，该位置应大致位于背甲中线与侧缘之间的中点处，并从背甲后缘向前约三分之一长度处。
3. 使用干布清除泥污、碎屑和藻类，清洁安装区域，然后用70%异丙醇擦拭消毒。
4. 使用少量5分钟环氧树脂将发射器固定。调整发射器方向，使其与背甲表面尽可能紧密贴合。天线应沿动物体长轴方向向后延伸。
5. 发射器位置确定后，用5分钟环氧树脂完全覆盖发射器，并延伸至周围约1 cm的背甲表面。
6. 将海龟放回水族箱，并让环氧树脂过夜固化。

3. 药理学制备

注意：氢溴酸东莨菪碱和甲基溴化东莨菪碱是强效的乙酰胆碱拮抗剂。操作这些药物时，应查阅材料安全数据表，使用适当的个人防护装备（例如，手套、通风橱），并遵循实验室安全规程，以避免意外接触。

1. 使用无菌且无热原的器材，配制氢溴酸东莨菪碱的储备液。在分析天平上称取所需量的药物，将东莨菪碱与注射用生理盐水在锥形管中混合，配制成浓度为 1 mg/mL 的溶液。涡旋振荡至完全溶解。尽可能确保基础化学品的化学纯度达到或超过美国药典（USP）制剂标准¹¹。
2. 用甲基东莨菪碱重复步骤 3.1。
3. 将溶液通过 0.22 µm 孔径的尼龙或混合纤维素酯注射器滤器，过滤至无菌密封的血清小瓶中。
4. 室温保存，24 小时内使用完毕。

4. 使用无线电遥测技术追踪海龟移动^{11, 12}

1. 移动至目标动物的大致位置，保持距离动物至少25米。使用定向八木天线并将接收器增益设为中等，扫描地平线以确定动物的大致方向和位置。当受到干扰或信号较弱时，寻找新的位置。在可能的情况下，提高高度或将八木天线举高以增强信号。
2. 找到适合测方位的位置后，使用GPS记录您的位置。
3. 使用零点/峰值法²⁸，测定左右两个零点的方位角。
   1. 确定信号最强的方向。在仍能接收到可检测信号的前提下，尽可能调低增益。如果接收器配备衰减开关，请使用该开关。将天线向左移动，并记录信号消失时的罗盘方位角。
   2. 重复上一步骤，测定右侧方位角。
4. 对同一只动物，至少在另外两个不同位置重复步骤4.3。
   注意：这些附加测点应以围绕动物的方式布设。
   1. 当从较远距离或存在不可避免的干扰情况下获取一组方位角时，应至少再获取两个额外的方位角以提高精度。用于估算单个位置的方位角组应尽快采集完毕，特别是当动物处于移动状态时。
      注意：也可由多名人员协调，同时对同一只动物进行多个独立的方位角测量。
5. 使用上述步骤，每10–15分钟以数字方式或手写方式记录一次动物的位置。
6. 认知处理的操控
   1. 在记录完未操控动物的移动路径后（作为受试者内对照），给予东莨菪碱或甲基东莨菪碱剂量。根据步骤1.5中获得的体重，计算所需给药量，以达到针对爬行动物的终剂量：东莨菪碱6.4 mg/kg或甲基东莨菪碱6.8 mg/kg^{19, 20}。
   2. 使用1.0 ml注射器配22号针头，通过尾部腹膜窦将药物直接注入腹腔。via 确保总给药体积不超过1 ml。
   3. 尽快在捕获地点释放动物。
   4. 继续每10–15分钟监测一次动物的移动，直至其到达预期目的地。

5. 空间分析

1. 计算动物位置的估计值。
   1. 对于每组零位方位角，通过手绘或 通过 软件）以确定最终的发射器方位。对同一时间点的所有方位重复此步骤。
   2. 根据制造商的说明，使用三角测量软件估算动物的位置及多个发射器方位角对应的位置误差。如果软件输出的格式不同，需将位置估计值转换为 x/y 坐标。
2. 对所有轴承组重复步骤 5.1。
3. 计算运动的空间精度。
   1. 计算累积几何平均数（即未处理动物（阴性对照）在向目标移动过程中的平均路径¹².
   2. 针对治疗组和阳性对照组中的每个个体，计算从几何均值线开始，在5米间隔内依次扩大范围所包含的重叠点的累积数量，直至包含所有点的100%^{11, 12}.
   3. 计算每组中所有个体在每个条带距离处的平均值和标准误。
   4. 根据研究问题，对数据进行统计分析，比较各处理组之间达到容纳全部数据点（100%）所需的区间，或在给定区间内数据点的重叠程度。

结果

采用上述方案，对一群经历约100年季节性临时水源环境的东部锦龟（Chrysemys picta）中认知在导航行为中的作用进行了评估。该种群栖息于临时性（每年迅速干涸，耗时数小时）与永久性水生栖息地的混合环境中（图1）。先前研究表明，当其栖息池塘干涸后，本地龟类能够以高精度（± 3.5 m）沿复杂且可预测的路线迁移到其他水源，这些路线在4岁前即已学会^11-13（图1）。

本研究表明，这些海龟所使用的过程与空间记忆的形成和回忆一致¹¹。在导航过程中，东莨菪碱阻断了动物脑内的胆碱能活性（包括空间记忆的形成和回忆^19-21）。经东莨菪碱处理的有经验成年个体偏离了其精确的历史路径，而缺乏经验（因而无记忆）的幼稚个体则不受东莨菪碱影响，提示东莨菪碱对感知或非空间认知过程无影响¹¹ （

讨论

本文所述的实验方案使研究者能够记录并量化认知在导航中的作用。在野外操控认知已被证明具有挑战性，因为大多数方法无法让研究者明确知晓动物行为的哪些具体方面受到了操控。然而，本文介绍的方案能够精确操控认知，从而准确评估其在导航中的作用。该技术还能使研究者以极高的空间和时间分辨率实时监测动物的导航行为，使研究人员能够清晰地记录对野生动物认知进行实验操控后所产生的行为影响。

在此背景下，无线电遥测技术能够精确监测动物在远距离范围内的活动，从而获得高质量的空间和行为数据。尽管遥测技术的应用并非全新²⁸，但大多数研究利用该技术回答生态学和行为学中的粗略问题（例如，栖息地利用、家域范围大小，等等）。本文所述对动物位置进行高频次监测（每小时4至5次）并结合精细尺度的空间分析，可更详细地揭示动物空间位置中的行为特征。需要注意的是，最佳追踪距离取决于发射器的信号强度和接收设备的灵敏度。通常建议至少与动物保持25米的距离，以避免对其造成干扰；然而，当动物位于开阔植被区域时，为避免干扰所需的距离可能更大。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溴化东莨菪碱	Sigma	S0929	USP
甲基溴化东莨菪碱	Sigma	S8502, 1421009	USP 和非 USP 版本
生理盐水	Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc.	409488850	USP，配制成可注射制剂
注射器滤器	Fisher	09-720-004
注射器	Fisher	14-823-30
皮下注射针头	Fisher	14-823-13
天线	Wildlife Materials	3 元素折叠式八木天线	也可提供具有更多元件的天线，但在野外使用可能较为不便。
无线电接收器	Wildlife Materials	TRX-2000S	另有防水型号可供选择。
指南针	Brunton	Truarc 15
无线电发射器	Holohil Inc.	BD-2, PD-2, RI-2B	发射器型号的使用寿命和信号输出因电池尺寸和脉冲速率设置而异，可根据研究问题和目标生物进行定制。
全球定位系统（GPS）	Garmin	eTrex Venture
同轴电缆	newegg.com	C2G 40026	必须配备 BNC 接头。
环网	Memphis Net and Twine	TN325	应根据目标动物的最小体型选择合适的网孔尺寸。