成年小鼠脊髓组织原代混合胶质细胞培养物的制备

摘要

神经病理性疼痛的发生涉及脊髓胶质细胞的病理性改变。一种源自成年脊髓组织并用于研究这些细胞的可靠胶质细胞培养体系 体外 不足。因此，本文展示了如何 建立来自成年小鼠脊髓组织的原代混合胶质细胞培养物。

摘要

人们普遍认为，脊髓胶质细胞的反应在神经病理性疼痛的发生发展中起着重要作用。通过细胞和分子水平的研究，已获得了大量关于胶质细胞活动的信息 体外 细胞培养系统。该 体外 所使用的研究体系主要包括源自新生动物脑皮质组织的原代胶质细胞和永生化细胞系。然而，这些体系可能无法反映脊髓胶质细胞的特性 体内为了进一步研究脊髓胶质细胞在周围神经损伤诱导的神经病理性疼痛发展中的作用，采用一种更能反映体内情况的培养系统 体内 在特定条件下，本实验室已建立一种从成年小鼠制备原代脊髓混合胶质细胞培养的方法。简言之，获取成年小鼠的脊髓组织，经木瓜蛋白酶消化处理后，使用密度梯度培养基去除髓鞘。所得单细胞悬液在添加了2-巯基乙醇（2-ME）的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（cDMEM）中培养，培养温度为35.9℃ ^oC. 这些培养条件专门针对混合胶质细胞的生长进行了优化。在此条件下，细胞在培养12至14天后即可用于实验。 （细胞通常在此期间处于对数生长期）从原代培养建立后（第0天）开始，可维持培养至第21天。该培养系统可用于研究脊髓胶质细胞在多种物质和刺激因子作用下的反应。除神经病理性疼痛外，该系统还可用于研究其他涉及脊髓胶质细胞病理改变的疾病中的胶质细胞反应。

引言

慢性疼痛是一种严重的健康问题，影响着美国约1亿成年人，每年造成的经济损失估计高达6350亿美元¹越来越多的证据表明，脊髓胶质细胞在神经病理性疼痛（一种最具破坏性的慢性疼痛）的发生发展中起着重要作用². 合适的 体外 培养系统将对深入研究胶质细胞在细胞和分子水平上的作用具有重要意义。

目前， 体外 研究人员常用的胶质细胞培养系统主要包括来源于新生小鼠或大鼠脑皮质组织的胶质细胞，以及由新生小鼠或大鼠原代胶质细胞衍生的永生化胶质细胞系。新生动物的细胞中含有大量未分化的细胞，可进一步分化为胶质细胞（主要为星形胶质细胞和小胶质细胞），从而为实验提供充足的细胞来源³然而，我们之前的研究表明，新生小鼠脑部胶质细胞与成年大鼠脊髓胶质细胞在脂多糖（LPS）刺激下表现出显著不同的反应。例如，白细胞介素（IL）-4 对 LPS 诱导的成年大鼠脊髓胶质细胞一氧化氮（NO）产生的抑制作用明显强于新生小鼠脑部胶质细胞⁴此外，新生小鼠脑胶质细胞（方法见参考文献5）与成年小鼠脊髓胶质细胞在神经肽降钙素基因相关肽（CGRP）刺激下产生的趋化因子谱具有明显差异。图1). 建立的细胞系易于使用和维护，可在短时间内提供大量细胞。通常，永生化细胞系是通过病毒介导的永生化系统（例如广泛使用的BV2小胶质细胞系）生成的^{6, 7} 或在发现自发转化....

方案

本方案已获得新英格兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本方案用于从4只成年小鼠脊髓制备胶质细胞培养物。

1. 在无菌条件下于细胞培养罩内配制溶液

1. 准备培养基：完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（cDMEM），包含 DMEM（含 4.5 g/L 葡萄糖）、10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素、250 ng/mL 两性霉素 B 和 50 µM 2-巯基乙醇（2-ME；见 1.1.1）。混合并过滤除菌所有其他组分，然后加入 FBS。将培养基在 4 ^oC 下保存。
   1. 制备 50 mM 2-ME/磷酸盐缓冲液（PBS）储存液：将 100 µL 浓缩的 2-ME（14.3 M）加入 28.6 mL 的 1× PBS 中，并过滤除菌（该溶液可在 4 ^oC 下保存数月）。每 1,000 mL 培养基使用 1 mL 的 2-ME 储存液。
2. 密度梯度介质的制备
   1. 制备等渗密度梯度介质储存液（例如，100% Percoll）：将 1 份 10× 无菌 PBS 与 9 份无菌密度梯度介质原液（例如，Percoll）混合。
   2. 将 100% 密度梯度介质（按 1.2.1 制备）用....

结果

该方法可用于从小鼠和大鼠中制备混合胶质细胞。在培养启动后第12天（D 12），12孔板中每孔的平均总细胞数应相对稳定，当细胞来源于小鼠脊髓时，每孔约有100,000个细胞。通过本方法获得的胶质细胞可用于研究成年脊髓胶质细胞在给予特定物质或试剂后的反应实验。图3展示了一项典型实验中细胞因子和趋化因子反应的示例：实验中，成年BALB/c小鼠的脊髓小胶质细胞在培养启动后第13天（D 13）接受LPS（Salmonella Minnesota Re595）处理。LPS处理24小时后收集上清液，使用市售试剂盒通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞因子和趋化因子水平。

当该成年胶质细胞培养体系首次建立时，细胞在37℃的标准培养环境中孵育 ^oC. 在此条件下，小胶质细胞的平均含量在5 - 10%之间。然而观察发现，尽管采用了统一的培养技术，某些培养样本中的小胶质细胞含量仍极低（<2.......

讨论

为了在不同实验之间获得可重复的结果，必须以一致的方式执行所有步骤，包括更换培养基的时间安排。以下步骤对于获得高质量的成年混合胶质细胞尤为关键。

酶消化是本方案中的一个重要环节。为了获得单细胞悬液，必须确保组织块被充分消化。然而，过度消化将导致细胞数量显著减少。每个实验室都需要进行预实验，根据所用孵育瓶的类型、每次使用的平均组织量以及摇床类型（旋转式或轨道式摇床），确定准确的消化时间。此外，无论选择何种木瓜蛋白酶解离系统，都必须始终使用相同来源的相同组分，因为偶尔更换组分可能导致总细胞收获量出现显著差异。

在本方案中，使用密度梯度介质去除髓鞘。配制和使用密度梯度溶液时必须在室温（RT）下进行，因为这些溶液的密度对温度敏感。密度梯度溶液通常储存在4 °C ^oC. 如有必要，密度梯度溶液可在室温下放置过夜，待次日用于建立培养。此外，在细胞于20%密度梯度中离心30分钟后，应立即将细胞从离心机中取出，以防止大块碎片发生位移。即， 远离溶液顶部；参见步骤 4.1。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’s修饰的Eagle’含4.5 g/L葡萄糖的DMEM培养基	Lonza	12-709F	cDMEM 培养基是一种标准且广泛使用的培养基。研究人员可自行决定 DMEM 及配制 cDMEM 培养基所用其他组分的购买来源。
L-谷氨酰胺（100倍）	Lonza	17-605E	L-谷氨酰胺是各种培养基中常用的标准组分。研究人员可自行决定L-谷氨酰胺的采购来源。
抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）	Corning-Mediatech	30-004-CI	这是一种青霉素、链霉素和两性霉素的组合制剂，配方包含10,000单位/毫升青霉素G、10毫克/毫升硫酸链霉素和25 µg/mL 两性霉素 B。研究人员可自行决定各组分的购买渠道。
2-巯基乙醇（2-ME）	Sigma-Aldrich	M3148	一种适用于细胞培养、分子生物学和电泳的生物试剂。
木瓜蛋白酶解离系统	沃辛顿生化公司	LK003150	该试剂盒的各个组分可单独购买。
Percoll	GE医疗集团	17-0891-01	Percoll 以无菌溶液形式出售。如有需要，未稀释的 Percoll 可重新高压灭菌。
实验室摇床培养箱	Barstead/实验室线路	MaxQ4000	这是目前使用的培养摇床。也可使用其他类型的摇床。
脂多糖， 沙门氏菌 Minnesota Re595	Sigma-Aldrich	L-9764	其他血清型的脂多糖也可诱导胶质细胞反应，但反应强度可能有所不同。
小鼠IL-6 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY406	每位研究人员均可选择自己偏好的ELISA试剂盒。
小鼠 TNF-α DuoSet ELISA	R&D Systems	DY410	每位研究人员均可选择自己偏好的ELISA试剂盒。
小鼠IP-10（CXCL10）DuoSet ELISA	R&D Systems	DY466	每位研究人员均可选择其偏好的ELISA试剂盒。
小鼠 MCP-1（CCL2）ELISA OptEIA 试剂盒	BD 生物科学	555260	每位研究人员均可选择自己偏好的ELISA试剂盒。
小鼠趋化因子 Q-Plex	Quansys Biosciences	120251MS	该产品当时无法在内部进行检测，因此我们送样至生产商进行分析。
APC-抗小鼠-CD45（克隆 30-F11）	eBioscience	17-0451	可使用来自其他供应商的相同克隆的抗体。
FITC-抗小鼠-CD11b（克隆 M1/70）	eBioscience	11-0112	可使用来自其他供应商的相同克隆的抗体。
Accuri C6 流式细胞仪	BD 生物科学	BD Accuri C6	每位研究人员均可使用其偏好的任意流式细胞仪。
FlowJo 软件	Tree Star, Inc.	FlowJo7.6.5	每位研究人员均可使用自己偏好的任何分析软件。