需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

成年小鼠脊髓组织原代混合胶质细胞培养物的制备

10.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54801

⸱

2016年11月19日

 , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Osteopathic Medicine, University of New England

本文内容

摘要

神经病理性疼痛的发生涉及脊髓胶质细胞的病理性改变。一种源自成年脊髓组织并用于研究这些细胞的可靠胶质细胞培养体系 体外 不足。因此，本文展示了如何 建立来自成年小鼠脊髓组织的原代混合胶质细胞培养物。

摘要

人们普遍认为，脊髓胶质细胞的反应在神经病理性疼痛的发生发展中起着重要作用。通过细胞和分子水平的研究，已获得了大量关于胶质细胞活动的信息 体外 细胞培养系统。该 体外 所使用的研究体系主要包括源自新生动物脑皮质组织的原代胶质细胞和永生化细胞系。然而，这些体系可能无法反映脊髓胶质细胞的特性 体内为了进一步研究脊髓胶质细胞在周围神经损伤诱导的神经病理性疼痛发展中的作用，采用一种更能反映体内情况的培养系统 体内 在特定条件下，本实验室已建立一种从成年小鼠制备原代脊髓混合胶质细胞培养的方法。简言之，获取成年小鼠的脊髓组织，经木瓜蛋白酶消化处理后，使用密度梯度培养基去除髓鞘。所得单细胞悬液在添加了2-巯基乙醇（2-ME）的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（cDMEM）中培养，培养温度为35.9℃ oC. 这些培养条件专门针对混合胶质细胞的生长进行了优化。在此条件下，细胞在培养12至14天后即可用于实验。 （细胞通常在此期间处于对数生长期）从原代培养建立后（第0天）开始，可维持培养至第21天。该培养系统可用于研究脊髓胶质细胞在多种物质和刺激因子作用下的反应。除神经病理性疼痛外，该系统还可用于研究其他涉及脊髓胶质细胞病理改变的疾病中的胶质细胞反应。

引言

慢性疼痛是一种严重的健康问题，影响着美国约1亿成年人，每年造成的经济损失估计高达6350亿美元1越来越多的证据表明，脊髓胶质细胞在神经病理性疼痛（一种最具破坏性的慢性疼痛）的发生发展中起着重要作用2. 合适的 体外 培养系统将对深入研究胶质细胞在细胞和分子水平上的作用具有重要意义。

目前， 体外 研究人员常用的胶质细胞培养系统主要包括来源于新生小鼠或大鼠脑皮质组织的胶质细胞，以及由新生小鼠或大鼠原代胶质细胞衍生的永生化胶质细胞系。新生动物的细胞中含有大量未分化的细胞，可进一步分化为胶质细胞（主要为星形胶质细胞和小胶质细胞），从而为实验提供充足的细胞来源3然而，我们之前的研究表明，新生小鼠脑部胶质细胞与成年大鼠脊髓胶质细胞在脂多糖（LPS）刺激下表现出显著不同的反应。例如，白细胞介素（IL）-4 对 LPS 诱导的成年大鼠脊髓胶质细胞一氧化氮（NO）产生的抑制作用明显强于新生小鼠脑部胶质细胞4此外，新生小鼠脑胶质细胞（方法见参考文献5）与成年小鼠脊髓胶质细胞在神经肽降钙素基因相关肽（CGRP）刺激下产生的趋化因子谱具有明显差异。图1). 建立的细胞系易于使用和维护，可在短时间内提供大量细胞。通常，永生化细胞系是通过病毒介导的永生化系统（例如广泛使用的BV2小胶质细胞系）生成的6, 7 或在发现自发转化后（如星形胶质细胞系 C8-D1A 和小胶质细胞系 C8-B4）8, 9细胞系在单独研究星形胶质细胞和小胶质细胞的分子特性方面具有显著优势；然而，从细胞系获得的结果通常需要在原代细胞或体内进一步验证 体内 需要指出的是，目前尚未有源自啮齿类动物脊髓胶质细胞的胶细胞系的报道。

为了帮助 研究 脊髓胶质细胞在神经病理性疼痛发展中的作用研究中，通过改进先前报道的用于制备成年大鼠混合胶质细胞培养物的方法，建立了一种源自成年小鼠脊髓的培养体系4, 5小鼠脊髓胶质细胞培养方法最近得到了进一步优化10 本文对此进行了更详细的描述。可根据特定研究需求选择合适品系的小鼠建立成年脊髓混合胶质细胞培养体系，细胞在培养开始后可维持长达21天。该方法可用于神经病理性疼痛研究，以及涉及脊髓内病理改变的多种神经系统疾病的研究，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）、人类免疫缺陷病毒（HIV）相关性感觉神经病变和多发性硬化症（MS）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案已获得新英格兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本方案用于从4只成年小鼠脊髓制备胶质细胞培养物。

1. 在无菌条件下于细胞培养罩内配制溶液

  1. 准备培养基：完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（cDMEM），包含 DMEM（含 4.5 g/L 葡萄糖）、10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素、250 ng/mL 两性霉素 B 和 50 µM 2-巯基乙醇（2-ME；见 1.1.1）。混合并过滤除菌所有其他组分，然后加入 FBS。将培养基在 4 oC 下保存。
    1. 制备 50 mM 2-ME/磷酸盐缓冲液（PBS）储存液：将 100 µL 浓缩的 2-ME（14.3 M）加入 28.6 mL 的 1× PBS 中，并过滤除菌（该溶液可在 4 oC 下保存数月）。每 1,000 mL 培养基使用 1 mL 的 2-ME 储存液。
  2. 密度梯度介质的制备
    1. 制备等渗密度梯度介质储存液（例如，100% Percoll）：将 1 份 10× 无菌 PBS 与 9 份无菌密度梯度介质原液（例如，Percoll）混合。
    2. 将 100% 密度梯度介质（按 1.2.1 制备）用常规 1× 无菌 PBS 稀释，配制成 20% 密度梯度介质（例如，10 mL 100% 密度梯度介质加 40 mL 1× PBS），并在 4 oC 下保存。在进行细胞培养前，将 20% 密度梯度介质恢复至室温（RT）。
  3. 木瓜蛋白酶解离系统的溶液制备
    注意：木瓜蛋白酶解离系统可在材料表中查到。也可使用其他类似的解离试剂盒（包括自行配制的）。所有组分必须无菌。
    1. 将 32 mL 的厄尔平衡盐溶液（EBSS）加入卵黏蛋白抑制剂混合物（粉末）中。
    2. 将 5 mL EBSS 加入一个木瓜蛋白酶小瓶（粉末）中。将该小瓶置于 37 oC 水浴中 10 分钟，或直至木瓜蛋白酶完全溶解。
    3. 将 500 µL EBSS 加入一个 DNase 小瓶（粉末）中。轻轻混匀。
    4. 将上述 250 µL DNase 溶液加入木瓜蛋白酶小瓶中。
    5. 计算所需上述木瓜蛋白酶/DNase 混合液的总量（每只小鼠脊髓约需 800 µL 木瓜蛋白酶/DNase 混合液），并将所需量转移至 50 mL 管中用于组织消化（步骤 3.2）。剩余混合液在原小瓶中于 4 °C 保存，至少可稳定两周。
    6. 所有试剂盒组分在使用前均需置于冰上保存。
  4. 准备脊髓收集管：一个无菌 15 mL 管中加入 5 mL 的亨克平衡盐溶液（HBSS；来自木瓜蛋白酶解离系统，用于收集脊髓），另一个无菌 15 mL 管中加入 1× PBS（用于填充 5 mL 注射器，见步骤 2.4）。此外，准备一个无菌培养皿（35 mm 或 60 mm）并加入 5 mL HBSS，置于超净台中备用。

2. 脊髓采集

注意：所有设备必须无菌。应在经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指定区域进行采集。

  1. 准备以下工具用于收获小鼠脊髓：直型锋利/钝头18厘米外科剪、12厘米标准手术刀（#3实心）、碳钢无菌手术刀片#10、小型动物断头器、12厘米标准弯头镊子，以及连接在5 mL注射器上的无菌20G针头。
  2. 使用CO2对动物实施安乐死，并用70%乙醇（EtOH）对小鼠头部和背部区域进行消毒。
  3. 使用断头器将动物断头。在下背部做一条纵向中线切口，暴露肌肉层。使用无菌直型外科剪（18 cm）在髋部水平对脊柱进行彻底横切（同时剪开覆盖脊柱的肌肉层）。
  4. 将动物放置在一张新的 disposable 擦拭纸上。小心地将20G针头（连接装有无菌1×PBS的5 mL注射器，见步骤1.4）插入脊柱，方向朝向头侧。牢固按住动物并快速推动注射器。整个脊髓应从颈段末端被推出。将脊髓收集至含有HBSS的15 mL离心管中。
  5. 对剩余小鼠重复步骤2.4。每只动物操作后，使用70% EtOH对所有使用过的器械进行消毒。
    注意：通常每4只小鼠的脊髓可建立一个12孔板（见4.3）。

3. 单细胞悬液的制备

注意：步骤3和4需在超净工作台中进行，以保持无菌环境。

  1. 将所有脊髓转移至含有 HBSS 的培养皿中（步骤 1.4）。用无菌剪刀和镊子将每根脊髓切成许多细小的碎块。用无菌镊子或 10 mL 移液器将脊髓组织转移至含有已配制的木瓜蛋白酶/DNase 酶混合液的 50 mL 圆锥形离心管中（步骤 1.3.5）（避免将 HBSS 加入酶混合液中，以免进一步稀释已配制的酶溶液，可能导致酶活性降低）。
  2. 轻轻涡旋混匀管内液体。将离心管置于 37 oC 的培养箱/摇床中，以 150 rpm 的转速进行振荡孵育 1 小时。
  3. 再次涡旋混匀管内液体，并使用 5 mL 移液器剧烈吹打酶溶液与组织的混合物，以促进进一步解离。
  4. 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
  5. 在离心过程中，于无菌离心管中将 2.7 mL EBSS 与 300 µL 重悬的白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液（1.3.1）混合。加入 150 µL DNase 溶液（步骤 1.3.3）。
  6. 离心结束后，弃去上清液，并用上述溶液（步骤 3.5）重悬细胞沉淀。充分涡旋以彻底分散细胞沉淀。
  7. 向细胞悬液中加入 3 mL 重悬的白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液（步骤 1.4.1）。在室温下以 70 × g 离心 6 分钟。弃去上清液（其中含有膜碎片）。

4. 从单细胞悬液中进一步去除髓鞘

  1. 将8 mL 20%密度梯度介质（按步骤1.2.2制备）加入含有细胞沉淀的离心管中，轻轻涡旋以分散沉淀，然后在室温下以800 × g离心30分钟，不启用刹车。小心移除上层碎片（主要是髓鞘）和上清液，但保留沉淀。
  2. 为去除残留的密度梯度介质，用8 mL稀释的cDMEM（1份cDMEM与2份HBSS混合）重悬细胞沉淀进行洗涤。在4 oC下以400 × g离心10分钟。吸除上清液后，再次用上述稀释cDMEM按相同方式洗涤细胞。将细胞置于冰上保存，直至接种。
  3. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于培养基（含2-ME的cDMEM，按步骤1.1制备）中。接种一块12孔板时，使用3 mL × 4（所用小鼠数量）+ 2 mL = 14 mL培养基。此体积可确保整块板（12孔）有足够的细胞悬液，并额外提供若干孔用于测定每孔平均细胞数及培养物中小胶质细胞的比例。若使用其他类型的培养容器，请按比例计算所需培养基的总体积。
  4. 将1 mL细胞悬液加入12孔板的每孔中。
  5. 将细胞在35.9 oC、5% CO2条件下孵育。
  6. 在第1天更换培养基（通过抽吸移除旧培养基），之后每3–4天更换一次（通常在第1、4、8和11天更换培养基，并在第12天使用细胞）。
    注意：第1天时，由于脊髓组织残留的髓鞘，培养物中可能含有较多碎片；因此建议在第1天更换培养基（详见“讨论”部分获取更多信息）。培养物在第12–14天可用于处理。细胞通常在第12天达到约80%汇合度，到第14天可接近100%汇合度。通常在第12天，12孔板每孔约有100,000个细胞。

12天内细胞培养的生长情况；显微镜图像显示从第1天到第12天的进展。
图2：混合胶质细胞在建立混合胶质细胞培养后不同时间点的代表性图像。 原代脊髓混合胶质细胞来源于成年C57Bl/6小鼠。代表性图像显示了接种后胶质细胞培养的进展情况。在第1天，部分细胞已贴附于培养皿上，但仍多呈圆形。同时存在大量悬浮细胞和明显碎片。在第4天，大多数细胞已贴壁，细胞呈现分支状并可见突起，分布较为稀疏，此时培养物的汇合度约为20-30%。在第8天，培养物的汇合度达到50-60%，部分区域出现较大片状细胞聚集，而其他区域细胞生长仍较稀疏，部分聚集区域的细胞呈现“类方形”形态。在第12天，培养物汇合度达到或超过80%（本图中所示约为90%）。此时细胞处于对数生长期，在第12至14天之间是用于实验的最佳时期。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用额外孔中的细胞（步骤 4.3）通过标准的荧光激活细胞分选（FACS）染色方案11，结合抗小鼠 CD45 和抗小鼠 CD11b 单克隆抗体检测小胶质细胞含量。CD45+CD11b+ 细胞被鉴定为小胶质细胞。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

该方法可用于从小鼠和大鼠中制备混合胶质细胞。在培养启动后第12天（D 12），12孔板中每孔的平均总细胞数应相对稳定，当细胞来源于小鼠脊髓时，每孔约有100,000个细胞。通过本方法获得的胶质细胞可用于研究成年脊髓胶质细胞在给予特定物质或试剂后的反应实验。图3展示了一项典型实验中细胞因子和趋化因子反应的示例：实验中，成年BALB/c小鼠的脊髓小胶质细胞在培养启动后第13天（D 13）接受LPS（Salmonella Minnesota Re595）处理。LPS处理24小时后收集上清液，使用市售试剂盒通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞因子和趋化因子水平。

当该成年胶质细胞培养体系首次建立时，细胞在37℃的标准培养环境中孵育 oC. 在此条件下，小胶质细胞的平均含量在5 - 10%之间。然而观察发现，尽管采用了统一的培养技术，某些培养样本中的小胶质细胞含量仍极低（<2...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

为了在不同实验之间获得可重复的结果，必须以一致的方式执行所有步骤，包括更换培养基的时间安排。以下步骤对于获得高质量的成年混合胶质细胞尤为关键。

酶消化是本方案中的一个重要环节。为了获得单细胞悬液，必须确保组织块被充分消化。然而，过度消化将导致细胞数量显著减少。每个实验室都需要进行预实验，根据所用孵育瓶的类型、每次使用的平均组织量以及摇床类型（旋转式或轨道式摇床），确定准确的消化时间。此外，无论选择何种木瓜蛋白酶解离系统，都必须始终使用相同来源的相同组分，因为偶尔更换组分可能导致总细胞收获量出现显著差异。

在本方案中，使用密度梯度介质去除髓鞘。配制和使用密度梯度溶液时必须在室温（RT）下进行，因为这些溶液的密度对温度敏感。密度梯度溶液通常储存在4 °C oC. 如有必要，密度梯度溶液可在室温下放置过夜，待次日用于建立培养。此外，在细胞于20%密度梯度中离心30分钟后，应立即将细胞从离心机中取出，以防止大块碎片发生位移。即， 远离溶液顶部；参见步骤 4.1。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

成年脊髓混合培养物最初在NIH/NIDA R01项目（项目负责人：De Leo）和NIH T32培训项目（项目负责人：Green）的资助下，利用大鼠建立。这些方法随后在以下项目的资助下进一步优化，用于小鼠脊髓：NIH/NIDA 5K01DA023503（项目负责人：Cao）、NIH/NINDS 5R21NS066130（项目负责人：Cao）以及NIH/NIGMS P20GM103643（项目负责人：Meng）。作者还要感谢芝加哥骨科医学院药理学系的Alejandro M. S. Mayer博士在获取富含小胶质细胞的混合胶质细胞过程中提供的技术支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科’s修饰的Eagle’含4.5 g/L葡萄糖的DMEM培养基Lonza12-709FcDMEM 培养基是一种标准且广泛使用的培养基。研究人员可自行决定 DMEM 及配制 cDMEM 培养基所用其他组分的购买来源。
L-谷氨酰胺（100倍）Lonza17-605EL-谷氨酰胺是各种培养基中常用的标准组分。研究人员可自行决定L-谷氨酰胺的采购来源。
抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）Corning-Mediatech30-004-CI这是一种青霉素、链霉素和两性霉素的组合制剂，配方包含10,000单位/毫升青霉素G、10毫克/毫升硫酸链霉素和25 µg/mL 两性霉素 B。研究人员可自行决定各组分的购买渠道。
2-巯基乙醇（2-ME）Sigma-AldrichM3148一种适用于细胞培养、分子生物学和电泳的生物试剂。
木瓜蛋白酶解离系统沃辛顿生化公司LK003150该试剂盒的各个组分可单独购买。 
PercollGE医疗集团17-0891-01Percoll 以无菌溶液形式出售。如有需要，未稀释的 Percoll 可重新高压灭菌。
实验室摇床培养箱 Barstead/实验室线路MaxQ4000 这是目前使用的培养摇床。也可使用其他类型的摇床。
脂多糖， 沙门氏菌 Minnesota Re595Sigma-AldrichL-9764其他血清型的脂多糖也可诱导胶质细胞反应，但反应强度可能有所不同。
小鼠IL-6 DuoSet ELISA R&D SystemsDY406每位研究人员均可选择自己偏好的ELISA试剂盒。
小鼠 TNF-α DuoSet ELISAR&D SystemsDY410每位研究人员均可选择自己偏好的ELISA试剂盒。
小鼠IP-10（CXCL10）DuoSet ELISAR&D SystemsDY466每位研究人员均可选择其偏好的ELISA试剂盒。
小鼠 MCP-1（CCL2）ELISA OptEIA 试剂盒BD 生物科学555260每位研究人员均可选择自己偏好的ELISA试剂盒。
小鼠趋化因子 Q-PlexQuansys Biosciences120251MS该产品当时无法在内部进行检测，因此我们送样至生产商进行分析。
APC-抗小鼠-CD45（克隆 30-F11）eBioscience17-0451可使用来自其他供应商的相同克隆的抗体。
FITC-抗小鼠-CD11b（克隆 M1/70）eBioscience11-0112可使用来自其他供应商的相同克隆的抗体。
Accuri C6 流式细胞仪BD 生物科学BD Accuri C6 每位研究人员均可使用其偏好的任意流式细胞仪。
FlowJo 软件Tree Star, Inc.FlowJo7.6.5每位研究人员均可使用自己偏好的任何分析软件。

参考文献

  1. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
  2. Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).
  3. Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. Maines, M. D., et al. , (2010).
  4. Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).
  5. Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).
  6. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).
  7. Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).
  8. Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).
  9. Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).
  10. Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
  11. Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).
  12. Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7(2001).
  13. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  14. Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).
  15. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

木瓜蛋白酶消化髓鞘去除密度梯度培养基单细胞悬液杜氏改良伊格尔培养基2-巯基乙醇补充流式细胞术分析小胶质细胞含量评估
成年小鼠脊髓组织原代混合胶质细胞培养物的制备
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。