一种可替代且经过验证的进入视网膜下腔的注射方法 通过 经巩膜后部入路

摘要

视网膜下注射是将大分子治疗剂（如蛋白质和病毒载体）递送至光感受器和视网膜色素上皮层的最常用技术。本文介绍了一种在小鼠中可有效靶向视网膜下腔、造成最小附带损伤且恢复时间较快的替代方法。

摘要

视网膜下注射已成功应用于人类和啮齿类动物，用于将蛋白质、病毒载体及细胞等治疗性干预物质递送至与光感受器和视网膜色素上皮（RPE）直接接触的视网膜感光细胞间隙/视网膜下腔室。近期的临床前及临床试验中，对浆原酶原以及病毒载体和干细胞的视网膜下注射已证明了向晚期视网膜疾病患者递送治疗剂的安全性和/或有效性。视网膜疾病的小鼠模型，尤其是遗传性视网膜营养不良模型，对于这些疗法的测试至关重要。在啮齿类动物中最常见的注射方法是采用小的角膜或巩膜切口，从前段途径接近视网膜。该方法中，注射针需穿透神经感觉性视网膜，从而破坏下方的RPE，并且在插入过程中容易划伤晶状体，导致晶状体混浊并影响无创成像。通过巩膜后部途径进入视网膜下腔可避免上述问题：针头在距视神经约0.5 mm处穿过巩膜，无需穿透视网膜，且不干扰玻璃体。由此产生的附带损伤仅限于局灶性巩膜切开术相关损伤以及短暂性浆液性视网膜脱离的影响。该方法操作简便，可最大限度减少眼部损伤，确保视网膜快速复位和恢复，失败率低。对视网膜和RPE造成的微小损伤使得能够清晰评估治疗剂本身的疗效及其直接作用。本文描述了一种新型的视网膜下注射技术，可用于高效、低损伤、快速恢复地将病毒载体、药理学制剂、干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞）靶向递送至小鼠的视网膜下腔。

引言

视网膜下注射是将细胞和病毒制剂递送至小鼠视网膜的主要方法，用于研究其对光感受器及下方视网膜色素上皮（RPE）的影响^1,2。目前大多数小鼠视网膜下注射方案采用角膜或巩膜途径，注射位点位于赤道前部（图1）。该方法可能造成一系列固有的继发性损伤，包括角膜切口导致晶状体划伤和混浊、玻璃体完整性破坏、神经视网膜和虹膜穿通、视网膜出血、显著的视网膜脱离以及持续性视网膜下水肿^3-9。实验操作必须克服这些影响，才能准确评估治疗干预的效果^3,7,10,11。本研究详细描述并验证了一种后部经巩膜注射技术，该方法可避免上述并发症，最大限度减少创伤，并具有较高的成功靶向视网膜下腔的率。

在小鼠中进行靶向视网膜下腔的注射通常非常困难，大多数研究人员在操作过程中会频繁失败，例如将载体注射到错误的位置，或造成明显的视网膜损伤，甚至完全的视网膜脱离⁶。由于注射并发症而被排除在分析之外的眼球数量在小鼠研究中通常未被报道，但根据我们自身的经验以及与其他研究人员的交流，注射失败的比例可能高达50%，且具体比例取决于操作人员的经验和技术水平。注射是否成功通常通过直接眼底成像和/或光学相干断层扫描（OCT）^7,9进行评估。一种易于掌握且成功率高的小鼠视网膜下注射方法，可加快实验进程，并降低针对美国主要致盲性视网膜疾病治疗方案的临床前研究成本。

方案

动物：在加州大学洛杉矶分校（UCLA）繁育的野生型 C57Bl/6J 小鼠。所有动物年龄介于 11 至 17 周之间，包含雄性和雌性小鼠。所有小鼠均群养，维持在 12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下，并自由获取食物和水 随意摄取所有实验均遵循加州大学洛杉矶分校的机构指南以及视觉与眼科研究协会关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明。

注：所有药物和注射用制剂均为美国药典（USP）级。

1. 手术准备

1. 使用生理盐水配制的氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）混合液，通过腹腔注射麻醉小鼠。麻醉深度应达到小鼠无足趾夹捏反射和角膜触碰反射。
2. 使用循环水垫将小鼠体温维持在 37.0 °C。
3. 使用 2.5% 去氧肾上腺素滴眼液散瞳，并修剪胡须以方便观察。胡须为小鼠提供重要的感觉输入，因此修剪胡须时仅应去除遮挡眼睛视野的部分，不应剪至胡须根部。根据我们的经验，小鼠在此操作后可正常恢复。 使用甲基纤维素滴眼液以防止角膜干燥，并减少麻醉引起的暂时性白内障¹³。
4. 手术前对器械进行灭菌处理（例如，使用聚维酮碘和乙醇或高温珠灭菌器）。
5. 若需进行可视化操作（见下文第 3 节），应在无菌环境（例如，生物安全柜）中配制稀释荧光素（0.01%，使用 0.9% 生理盐水）。

结果

对16只野生型小鼠的31只健康眼进行了经巩膜后路的视网膜下注射，注射0.01%荧光素溶液，注射体积分别为0.3 µl（n = 18）、0.5 µl（n = 8）和1.0 µl（n = 5）。其中一只眼因存在预先存在的角膜混浊，无法进行结构和功能分析，故未进行注射。本报告包含所有接受注射的眼。未观察到任何意外的视网膜脱离、神经感觉层视网膜穿孔或液体渗漏入玻璃体的情况，也未发现晶状体损伤、炎症反应、葡萄膜炎或术后感染的迹象。

通过光学相干断层扫描（OCT）成像在注射前、注射后10分钟及注射后4周评估视网膜结构（图2和图3）。在注射后10分钟的en face扫描图像上放置一个9点网格，其中中心点对准最大脱离区域的中心（图2B）。利用血管解剖标志，将注射前和注射后4周的扫描图像旋转对齐至注射后10分钟的扫描图像，从而实现三者之间的精确匹配。这使得能够在注射前后视网膜扫描图像中.......

讨论

视网膜下注射是基础研究和临床治疗中用于递送病毒载体及干细胞来源疗法以操控光感受器和视网膜色素上皮（RPE）的首选方法。在患者中，视网膜下注射通常通过睫状体平坦部的前部巩膜切口、后部核心玻璃体切除，并在直视下用针头穿透视网膜完成。与大多数玻璃体切除手术一样，除非眼球已为人工晶状体眼，否则常会过早发生白内障。在小鼠中，传统的视网膜下注射采用位于视网膜前方的巩膜切口，该方法常导致晶状体被划伤（晶状体占据眼球后腔的大部分空间），以及可能引起玻璃体嵌顿和完全性视网膜脱离的经视网膜穿刺。在小鼠中采用后部入路技术可减少这些不良后果，并提高对预期干预效应进行准确解读的能力。

本文所述视网膜下注射技术的优点包括对结构和功能的影响最小，并减少附带损伤（例如， 因晶状体损伤、玻璃体渗漏或炎症导致的混浊，从而更便于评估实验结果并缩短恢复时间。该技术需要对眼球进行较多操作以到达后极部，但每只眼的操作可在约10至15分钟内完成，成功率较高，且无任何眼球被排除在分析之外。在大多数注射案例中，4周内即可观察到视网膜结构和功能恢复正常。相比之下，既往研究报道的结构与功能恢复时间为5至8周，或未报告.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hamilton 型号 62 RN 注射器	Hamilton	87942	注射器 × 1
Hamilton 针头 33 G，1.0"，20 度，尖端 3（304 不锈钢）	Hamilton	7803-05	针头 × 6
Vannas 弯头剪刀	Ted Pella, INC.	1347	5 mm 刀片
22.5 度显微外科刀	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	氯胺酮
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	赛拉嗪
荧光素钠 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0.9% 生理盐水 USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0.9% NaCl
抗生素眼膏	Akorn	NDC 17478-235-35	眼科用
水循环泵	Gaymar	TP-500 T/Pump	货号 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R系列	商用
眼底相机	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
3 型镊子	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2.5% 去氧肾上腺素	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	眼科用
IMARIS8	Bitplane		版本 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
羟丙甲纤维素 2.5%	Goniovisc	AX0401	甲基纤维素
滴眼液（冲洗用）	Bausch & Lomb		生理盐水溶液
显微镜	Zeiss	Stemi 2000	显微镜
光源	Fostec	货号 20520	光源