用于访问视网膜下腔的另类和验证注射法通过一经巩膜后路

Summary

视网膜下注射是将蛋白质和病毒载体等大型治疗剂递送到光感受器和视网膜色素上皮的最常用技术。这里描述了一种在小鼠中成功靶向视网膜下间隙的替代方法，具有最小的附带损伤和快速的恢复时间。

Abstract

视网膜下注射已在人类和啮齿类动物被成功地用于递送蛋白质的治疗性干预，抗病毒剂，以及细胞到具有直接暴露于光感受器和视网膜色素上皮细胞（RPE）的interphotoreceptor /视网膜下舱。纤维蛋白溶酶原的视网膜下注射，以及最近的临床前和临床试验已经证明递送病毒载体和干细胞的个体具有先进视网膜疾病的安全性和/或功效。视网膜疾病，特别是遗传性视网膜营养不良的小鼠模型，用于测试这些治疗是必不可少的。在啮齿类动物中最常见的注射程序是用小transcorneal或经巩膜切口用前路到视网膜。通过这种方法，注射针头穿透视网膜神经上皮层破坏底层RPE和插入可以轻松尼克镜头，引起晶状体混浊及无创意马减值准备NG。通过经巩膜访问视网膜下的空间，后路避免了这些问题:针穿过巩膜从视神经约为0.5毫米，没有视网膜渗透并避免破坏玻璃体。附带损害仅限于与焦点巩膜和一过性，浆液性视网膜脱离的影响有关。该方法的简单性最大限度地减少眼外伤，确保快速视网膜复位和恢复，并具有低故障率。视网膜和RPE的损害最小允许的疗效明确评估和治疗剂本身的直接影响。该原稿描述了一种新颖的视网膜下注射技术，可用于靶向病毒载体，药剂，干细胞或诱导的多能干细胞（iPS细胞），以在具有高效力，最小的损伤，快恢复小鼠的视网膜下间隙。

Introduction

视网膜下注射是递送细胞和病毒剂的小鼠的视网膜研究其对感光体和下面的视网膜色素上皮^1,2-效果的主要手段。在小鼠中大多数视网膜下注射协议使用transcorneal或经巩膜注射部位前到赤道（ 图1）。这种方法可能会导致在包括切口和透镜的所得混浊时，神经视网膜和虹膜，视网膜出血，大量视网膜脱离和持久的视网膜下水肿^3-9的玻璃体，渗透的完整性的破坏固有的附带损害。实验操作必须以评价治疗性干预^3,7,10,11的作用克服这些影响。本研究提供了一种避免这些并发症的后经巩膜注射方法的详细描述和验证，减少创伤和具有定位子的高成功率视网膜空间。

注射小鼠靶向视网膜下空间往往非常难以执行并且多数研究者遇到失败的尝试，其中该载体被递送到不正确的位置或有显著视网膜损伤，例如，在一个完整的视网膜脱离⁶的高频。眼睛从分析中排除，因为注射的并发症的数量一般不报道在小鼠研究中，但在我们自己的经验，并与其他研究者的讨论中，失败的注射次数可以是高达50％，并且变化依赖于经验和谁正在执行注射研究者的能力。注射的成功通常通过直接眼底成像和/或光学相干断层扫描^（OCT）7,9评估。在小鼠高成功率视网膜下注射容易掌握的方法可以加速实验，减少特雷的临床前研究的成本atments视网膜疾病是在美国失明的主要原因。

后部，这里描述经巩膜视网膜下注射技术是从临床和临床前协议^9,12的适应。在注射的小鼠进行的非侵入性诊断评估论证温和，高度本地化的破坏和缺乏额外的抵押镜头，视网膜和视网膜色素上皮的损伤。此外，以相对较少的实践中，实验者可以实现这些结果以高成功率（80 - 90％或更好），从而降低了与这类研究相关的成本。此过程可用于递送细胞，病毒，或药理学治疗干预到光感受器和/或视网膜色素上皮中的临床前研究，并轻松地评估实验介入。

Protocol

动物:野生型C57BL / 6J小鼠在加州大学洛杉矶分校（UCLA）育成。所有动物为11之间 - 周17岁，并包括雄性和雌性小鼠。所有小鼠群养，保持与食品和水随意 12:12光照/黑暗周期。所有实验均按照加州大学洛杉矶分校和视觉的研究协会和眼科声明在眼科和视觉研究使用动物的机构准则进行的。

注:所有的药物和注射剂是美国药典（USP）级。

1.手术准备

1. 麻醉小鼠以100毫克/千克氯胺酮和8毫克/公斤赛拉嗪的盐水混合物腹膜内注射。辖麻醉的深度，使得鼠标有没有脚趾捏或角膜反射触摸。
2. 维持体温在37.0℃用循环水垫。
3. 扩张2.5％福林眼ð学生ROPS和修剪胡须，以方便可视化。晶须鼠标提供显著感觉输入，因此，晶须修整应该只删除部阻止明确前往眼睛，而不是与晶须的基极。根据我们的经验，小鼠显示该过程后正常恢复。应用甲基纤维素滴眼液，以防止干燥和减少麻醉药引起的瞬态白内障^13。
4. 消毒手术前（ 即，聚维酮碘和乙醇或烫珠）仪器。
5. 制备稀释的荧光素（使用0.9％盐水0.01％）在无菌环境中（ 即 ，生物安全柜）如果可视化将被执行（见下文第3节）。

2.注射整地

1. 准备的注射器（ 例如 ，5微升注射器）与适当的喷射量（ 例如 ，0.3〜1.0微升）。
2. 所以眼睛朝上，并在二清晰可见鼠标位置ssecting显微镜。
3. 轻轻一捏用细尖镊子时间结膜。使用弯曲Vannas剪刀大约90度的周向切口。
4. 重复步骤2.3与底层的眼球筋膜囊。
5. 而鼻旋转地球切除用细尖镊子周围的结缔组织。向注射部位大约0.5mm颞视神经工作。使用非常谨慎，以避免破坏眶窦。

3.巩膜与视网膜下注射

注:建议在0.9％盐水0.01％荧光素的注射可以用来协助可视化，同时学习此过程。荧光素的地形分布眼底成像（见下文第4节）进行有效记录。

1. 通过用22.5度的眼用刀片轻轻搔抓眼罩使在注射部位的小巩膜切口。这个切口寿LD仅足够大以允许针的尖端穿过巩膜。
2. 插入斜面33克针（倾斜5 - 10°与该斜面面对并成角度平行于视网膜的巩膜注入所需量（ 例如，0.3〜1.0微升0.01％荧光素的用于学习的目的）。
   注:通过每次注射前适当的溶剂和去离子水连续清洗彻底清洗维护注射器的无菌。
3. 压低柱塞缓慢（超过3〜秒）无需移动针，并用均匀的压力。
   注意:当针在视网膜下腔，轻微的阻力将在按下柱塞可以感觉到。将没有对最小的阻力，如果针头穿刺视网膜，和高电阻，如果针不会刺入巩膜或视网膜色素上皮。
4. 抽出针头，以尽量减少回流前等待几秒钟。
5. 冲洗眼睛用无菌缓冲盐水和保证眼睛ħ作为旋转回其正常位置。

4. OCT和眼底成像评估视网膜脱离

1. 注射来评价喷射的质量后立即和在适当的时间执行OCT成像点注射后根据需要来评估视网膜结构。
   注:在类似的研究中使用OCT的实例先前已描述^7,14。
   1. 调整并对准OCT图像定位到注射部位。注射部位应是中线为0.5mm颞视神经头。或根据需要，如果脱离超出框架不能很好地集中重复。
2. 可视化视网膜脱离和染料有连接面眼底成像^7,14注射区域。
   注意:如果一个OCT成像系统不可用时，为实践的载体少量荧光素的注射将允许与执行荧光素血管任何眼底照相机的可视化造影使用相同的激发波长和阻塞过滤器。超荧光的局部区域将会出现在脉管系统下方，如果视网膜下空间被正确地定位在脉管将具有尖锐和明显边界。从注射水泡的边缘将由hyper-到低渗荧光过渡划定。几台仪器提供此功能的鼠标;这里使用的仪器是其他地方^14条所描述。

5.术后护理

1. 应用三联抗生素眼药霜厚厚的棉衣，以注入眼睛的角膜表面。
2. 将小鼠恢复干净孤笼。请勿将已经接受了手术，直到他们完全康复小鼠。
3. 监控麻醉恢复过程中呼吸和温度。监测动物，直到他们能保持胸骨斜卧。
4. 执行其他适当的术后监测和治疗，包括卡布洛芬为手术后疼痛管理一个皮下注射（5毫克/千克）。

6.评估视网膜功能的电描记所（ERG）

1. 进行ERG分析预喷射和在适当的时间后喷射作为需要评估视网膜的功能。如果注射制成视网膜下腔，视网膜脱离应72小时内解决。
   1. 使用标准的ERG技术如前所述^14,15前和注射后评估视网膜的功能。

7.三维重建和水泡量化卷

注:OCT具有高对比度包围的视图帧内的整个脱离扫描是最佳的使用。 ImageJ的/斐济^17,18和了Imaris被使用，但也可以使用其它的软件。

1. 导出感兴趣的B超扫描，进口的ImageJ /斐济和作物（图像>裁剪）华侨城SC的部分一个使用矩形选择工具来建模。
   1. 调整对比度（图像>调整>亮度/对比度），并用一条线连接两个部分划定任何丢失的边界。
   2. 绘制与线工具（保持移）跨越RPE到感光层的直线。测量（分析>测量）的行的长度，以获得最大分离尺寸为步骤7.8。
2. 进口裁剪帧的三维重建软件（见材料表）使用"RGB到灰色"插件和MATLAB编译器运行时。
3. 设置使用校准参数从OCT的扫描（X，Y，Z）的体素尺寸（下图片属性）。
4. 执行"RGB格雷"插件（在图像属性），具有相同的权重给每个通道，创建第四个通道。删除原始红 - 绿 - 蓝通道。
5. 使用反转对比变化的灰色通道。店铺形象。
6. 点击"添加EW面"中的3D视图选项卡按钮，开始创建面的引导下4个步骤。
   1. 设置表面水平细节（步骤4 1）。
      注意:根据我们的经验8.0至12.0是最有效的范围。
   2. 设置最大球体大小（背景下的选择）比7.1.2测得的最大尺寸支队略少。创建面和撤消灰色通道反转（步骤4 2）。
   3. 阈值设定为最大值，使视网膜外的负空间和脱离的表面不接触（4步骤3）来。
   4. 设置过滤器类型的体素的数目和按大小分离在分离部位的负空间。完成表面（步骤4 4）。
      注:该支队面的体积位于下的统计标签的体积。

Results

后路经巩膜视网膜下注射了31健康的眼睛用0.3微升（N = 18），0.5微升（N = 8）和0.01％荧光素的1.0微升（N = 5）注射执行16个野生型小鼠。一只眼睛由于该防止结构和功能分析一个预先存在的角膜混浊排除注射。每次注射的眼睛是包括本报告。没有意外的视网膜脱离，检测也没有透镜切口，炎症反应，葡萄膜炎，或外科手术后的感染中观察到的任何眼睛的任何证据的神经视网膜或泄漏进入玻璃体的穿刺。

视网膜结构被评定预喷射，10分钟注射后，用OCT成像4周注射后（ 图2和3）。 9点网格，中心点最大覆支队的中心，被放置在10分钟注射后的连接面扫描（ 图2B）。使用血管标，预喷射和4周后注入扫描，旋转，以在与10分钟注射后扫描登记。这允许准确地在前后的注射视网膜扫描（ 图2A，C）的相同的位置的标识。

Discussion

视网膜下注射是选择的方法为病毒载体的递送和干细胞衍生的疗法用于操纵光感受器和在基础研究和临床治疗视网膜色素上皮。在患者中，视网膜下注射是通常用前巩膜通过用直接可视化的针进行在玻璃体，视网膜的后部芯玻璃体切割术及渗透。如同大多数玻璃体切割程序，是很常见的，除非眼睛已经晶状体过早发生白内障形成。在小鼠中，视网膜下注射传统上与巩膜前到视网膜，经常与透镜，占据多数眼后腔的两个切口相关联的方法，以及transretinal渗透可能导致玻璃体包封和充分完成视网膜脱离。用小鼠后的方法技术减少这些不必要的后果，并提高了解释EF的能力预期的操纵fects。

此报告视网膜下注射技术的优点包括最小的结构或功能的效果，并减少附带损害（ 例如，从镜头切口，玻璃体泄漏或炎症混浊），允许实验结果和更快的恢复时间更容易评估。这种技术需要在眼睛的更大的操纵到达后极，但可以在大约10完成 - 每眼15分钟的高成功率，因为​​没有眼睛被从分析拒绝。在大多数注射，正常的视网膜的结构和功能是在4周内观察到。相比之下，以前的研究报告5 -八个星期的结构和功能的恢复或不报告恢复时间^6,7。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
汉密尔顿 62 型 RN SYR	汉密尔顿	87942	注射器 x 1
汉密尔顿针头 33 克，1.0 英寸，20 度，点 3（304 不锈钢）	汉密尔顿	7803-05	针头 x 6
Vannas 弯曲剪刀	Ted Pella， INC.	1347	5 毫米刀片
22.5 度显微外科刀	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
凯塔普尔	凤凰城	NDC 57319-609-02	氯胺酮
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	甲苯噻嗪
荧光素 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0.9% 盐水 USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0.9% NaCl
抗生素软膏	Akorn	NDC 17478-235-35	眼
水循环泵	Gaymar	TP-500 T/Pump	部件编号 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R 系列	商用
眼底相机	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
镊子 3 型	Ted Pella， INC.	5385-3SU
2.5% 去氧肾上腺素	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	眼科
IMARIS8	位平面		版本 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
丙甲纤维素 2.5%	Goniovisc	AX0401	甲基纤维素
滴眼液 （冲洗）	Bausch &Lomb		盐水溶液
显微镜	Zeiss	Stemi 2000	显微镜
光源	Fostec	P/N 20520	光源