通过腹主动脉缩窄建立大鼠心脏重塑模型

摘要

介绍了一种诱导心肌肥厚和心室重构的腹主动脉缩窄大鼠模型。该方法高效、高度可重复且具有微创性，为心肌肥厚及心功能障碍的研究提供了一个简便而有效的研究平台。

摘要

心力衰竭是全球主要的死亡原因之一。它是一种复杂的临床综合征，症状包括疲劳、呼吸困难、运动耐力下降和液体潴留。随着心力衰竭的发展，心肌结构、电传导和能量代谢均发生改变，导致收缩功能障碍、心律失常风险增加以及猝死。高血压性心脏病是与心力衰竭相关的心脏重构的关键促成因素之一。目前最常用的模拟高血压性心脏病的动物模型是通过外科手术干预建立的，例如通过缩窄主动脉。腹主动脉缩窄是一种有效的实验技术，可诱导压力超负荷，从而导致心力衰竭。该手术操作简便，无需开胸或机械通气。由腹主动脉缩窄诱导的心脏病理变化进展较为缓慢，因此该模型与临床高血压性心力衰竭具有较高的相关性。术后约10周可观察到心脏损伤和重构现象。本文所述方法提供了一种简单而有效的手段，用于构建适用于研究疾病机制及评估新型治疗策略的高血压性心脏病动物模型。

引言

心力衰竭是一种复杂的临床综合征，其症状包括疲劳、呼吸困难、运动耐受性下降以及外周组织中的液体潴留。它是发达国家死亡的首要原因¹。除由肌节蛋白或离子通道突变引起的遗传性心肌病外²，心肌功能障碍还可由多种疾病引起，包括高血压、瓣膜性心脏病、肥胖和糖尿病³。心肌结构、电传导及能量代谢的改变导致心脏泵血能力不足以满足循环需求，最终引发心力衰竭^3,4。因此，探究心力衰竭的潜在机制在心血管研究领域至关重要。明确导致心力衰竭进展的分子机制，将有助于发现新的治疗靶点或有用的生物标志物¹。因此，建立与人类心力衰竭具有关键临床特征相似的动物模型具有重要意义⁵。

心肌肥厚与重构在心力衰竭的发生发展中起着关键作用。高血压性心脏病是导致人类患者出现心肌肥厚及病理性重构的主要因素¹。为了模拟这些人类疾病状态，通常通过外科手术建立动物模型。具体而言，可通过缩窄横行或腹主动脉来增加左心室的阻力，从而最终导致心脏压力超负荷。这一现象通常会引起心肌肥厚，即心肌细胞为满足心血管系统功能需求而产生的生理代偿反应。然而，当功能需求超过正常的生理代偿机制时，便会引发心肌纤维化和收缩功能障碍。横行主动脉缩窄（TAC）手术通常涉及复杂的操作步骤，包括开胸术、机械通气以及分离胸腺和脂肪组织与主动脉弓。相比之下，腹主动脉缩窄所需的实验技术更为简便^6-8。在手术过程中，对左右肾动脉之间的腹主动脉进行缩窄。腹主动脉缩窄术后数周即可观察到心肌肥厚与重构^6-8，其产生的高血压性心脏病表现与横行主动脉缩窄手术所诱导的模型相似且稳定^9,10。本文介绍一种在大鼠中实施腹主动脉缩窄的实验方案，该方法高效、高度可重复且创伤小。通过使用4-0丝线形成直径为0.72 mm的结扎环，对邻近肾动脉的腹主动脉进行缩窄。术后十周可观察到明显的心肌肥厚与重构。由腹主动脉缩窄诱导的大鼠心肌肥厚模型为研究疾病机制、病理生理过程以及潜在治疗手段的开发提供了有效平台。

方案

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）进行。本方案已获得台湾大学动物实验管理与使用委员会批准，并符合其制定的指导原则。

1. 动物手术

1. 使用磨刀石将22 G注射器针头的尖端钝化，制备钝头针头。用镊子将针头弯折成直角。
2. 手术前准备好所需的手术器械和材料，以及恢复笼。使用前对所有器械和手术用品进行高压灭菌。
3. 选用体重约200 g的大鼠，饲养于控制温度（21 ± 2 °C）的环境中，维持12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律，并可自由摄食和饮水。每组至少包含6只大鼠。使用戊巴比妥钠（75 mg/kg，0.5 ml，腹腔注射）或其他合适的麻醉剂对大鼠进行麻醉。通过检测尾部反射确认麻醉深度。
   注：尾部反射消失是麻醉充分的指标。
4. 将大鼠仰卧位固定于带有加热垫的手术平台上，以维持体温。使用动物毛发剪和脱毛乳液剃除大鼠腹部毛发，避免手术污染。术前用聚维酮碘（碘伏）或其他清洁试剂擦洗剃净的腹部。
   注：整个操作过程中必须维持无菌区域。
5. 使用手术刀沿腹部正中线做2 cm切口。术中用生理盐水保持腹腔器官湿润。用棉球小心将消化器官向一侧推移，暴露位于腹膜后区域的下腔静脉。辨认腹主动脉，其紧邻下腔静脉，通常位于下腔静脉左侧。
   注：腹主动脉的搏动与心率同步。
6. 用镊子刺破腹膜，暴露下方血管。轻柔分离肾动脉附近的腹主动脉，并将一段8 cm长的4-0丝线缝合线从左右肾动脉起始部之间的腹主动脉下方穿过。
7. 将缝线打一个松散的双结，留出直径约3 mm的环，将钝化并弯折的22 G针头置于环内。收紧结扎线，使线结紧贴主动脉和针头，随后立即抽出针头，从而实现直径为0.7 mm的狭窄。
8. 使用6-0可吸收缝线关闭腹腔。采用间断缝合法缝合肌肉或皮肤切口。为预防感染，用碘酊擦洗手术部位。
9. 密切观察动物，直至其恢复足够意识，表现为可自由活动并开始进食。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看护。为预防术后疼痛，给予对乙酰氨基酚（300 mg/kg，0.5 ml，腹腔注射）。
   注：使用者应根据机构批准的政策给予镇痛药物。

2. 组织和血液样本采集

1. 术后10周，称量大鼠体重，并通过腹腔注射戊巴比妥钠（75 mg/kg，0.5 ml）进行麻醉。手术前，通过检测其尾部反射确认麻醉深度。将大鼠置于金属托盘上。
2. 使用手术刀沿颈部正中线做一条2 cm的切口。用镊子小心分离肌肉，暴露气管。仔细观察，辨认与气管平行且随心率搏动的颈动脉。
3. 将颈动脉血液采集至含EDTA的抗凝采血管中。立即以2,000 × g离心15分钟，收集血浆。将血浆于-80 °C保存，待用。
4. 在胸骨下角中线周围区域做一条5 cm的切口。用尖头镊子刺穿膈肌。使用剪刀沿两侧锁骨中线剪开并移除肋骨，暴露心脏。沿心脏及血管边界小心切除心脏。轻柔取出心脏，避免抓捏组织。
5. 通过将主动脉干结扎固定于灌流针头，将心脏安装至改良的Langendorff灌流装置。用Krebs缓冲液（含110 mM NaCl、2.6 mM KCl、1.2 mM KH₂PO₄、1.2 mM MgSO₄、25 mM NaHCO₃和11 mM葡萄糖，pH 7.4）对心脏进行灌流，以清除残留血液。称量心脏重量，并计算心重/体重比值。将心脏置于冰上，用4%多聚甲醛固定。请注意佩戴口罩，因多聚甲醛蒸气具有毒性。

3. 组织纤维化定量

1. 将多聚甲醛固定的心脏组织置于组织切片装置上，切成2 mm厚的切片。将组织切片放入包埋盒中。通过一系列梯度酒精浴（50%、75%、95%和100%，每种浓度各1小时）对组织进行脱水。
2. 用二甲苯浸润组织1小时，最后用石蜡浸润1小时。将浸透的组织放入包埋盒中，并用石蜡包埋。将包埋好的组织蜡块在室温下保存，直至进行切片。
3. 将包埋的组织切成4 µm厚的切片。将切片放入45 ºC的水浴中。以一定角度将载玻片浸入水浴，逐渐靠近石蜡切片边缘，使切片部分附着于载玻片上。
4. 将载玻片在水浴中反复移动，以去除组织切片下方可能存在的气泡，并促进更牢固的附着。在37 ºC下干燥载玻片1小时，并在室温下保存，用于组织学染色。
5. 将载玻片放入染色缸中。用二甲苯脱蜡30分钟，然后依次用稀释的酒精（95%、75%和50%，每种各3分钟）复水，最后置于蒸馏水中。加入足量的天狼星红染液，完全覆盖组织切片，染色1小时。用0.5%醋酸溶液漂洗两次（每次更换溶液），然后用无水酒精漂洗两次。
6. 将载玻片自然晾干，用合成树脂封片并加盖盖玻片。在可见光下拍摄载玻片图像。
   注：照片中的红色区域显示在200倍放大倍数下显微镜观察到的天狼星红阳性区域。计算天狼星红阳性区域占总面积的百分比，该数值反映纤维化的程度¹¹。

4. 血液肌钙蛋白定量检测

1. 使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量血浆肌钙蛋白水平。每个样本设两个复孔。向相应的孔中加入50 µl血浆和50 µl抗体混合液。密封酶标板，在室温下以400 rpm转速振荡孵育1小时。
   注意：血浆中的心肌肌钙蛋白是心肌损伤的标志物。
2. 吸去液体，每孔加入250 µl洗涤缓冲液，洗涤3次。最后一次洗涤后，将酶标板倒置，轻压于干净的纸巾上以吸除多余液体。
3. 每孔加入100 µl四甲基联苯胺底物溶液，在避光条件下以400 rpm转速振荡孵育10分钟。每孔加入100 µl终止液，于振荡器上振荡1分钟以充分混匀。在450 nm波长下测定各孔的光密度（OD）值。
   注意：肌钙蛋白浓度与OD值成正比。

结果

腹主动脉缩窄手术后10周，分析了由此产生的心脏病理变化。通过计算心脏重量与体重的比值以及检测心脏中胶原蛋白的含量来评估心脏组织学改变。通过测定血浆心肌肌钙蛋白浓度，确认心脏损伤情况。

如图1A所示，经腹主动脉缩窄术后，心脏体积增大，表现为心重/体重比值升高（图1B），这是心肌肥厚的指标。通过天狼星红染色，可将富含胶原（红色）的纤维化心肌与正常区域（黄色，图2）区分开来。与对照组（图2A）相比，腹主动脉缩窄术后心脏纤维化程度增加（图2B）。该结果与血浆肌钙蛋白浓度变化一致（图3）。肌钙蛋白浓度升高表明在压力超负荷过程中已发生心肌重塑和损伤。综上所述，腹主动脉缩窄可导致明显的心脏损伤、显著的心肌肥厚及组织重塑。

讨论

高血压性心脏病是一种主要的健康问题，对发病率和死亡率有显著影响，可导致心肌肥厚和心力衰竭⁵。人类高血压性心脏病的发病机制和进展过程复杂，因此建立合适的动物模型对于研究其潜在机制以及评估旨在改善心脏结构和功能的新型治疗方法至关重要⁵。腹主动脉缩窄模型可模拟慢性心脏疾病，是心血管研究中一种有效的手段。通过缩窄邻近肾动脉的腹主动脉，诱导心脏重构，最终导致心肌损伤。心脏重构的程度可通过计算心脏重量与体重的比值、进行天狼星红染色以检测胶原蛋白表达水平，以及采用基于ELISA的方法检测血浆中心肌肌钙蛋白水平来评估。腹主动脉缩窄法在大鼠模型中可获得更为可重复的心脏重构模拟结果。

心脏疾病的手术模型在密切模拟高血压和主动脉瓣狭窄的病理生理过程方面具有优势¹。目前大多数用于诱导心肌肥厚的手术技术均通过横主动脉缩窄^12,13实现，这是一种用于建立压力超负荷的常用实验方法。该方法诱导的高血压突然发生，可在2周内使左心室质量增加约50%⁵，因此该模型非常适合研究导致心肌肥厚的分子机制。然而，横主动...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
22 G 注射器针头	BD Biosciences	309572
EDTA 血液采集管	BD Biosciences	REF365974
4-0 丝线缝合线	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 丝线缝合线	Sharpoint™ Products	DC-2150N
戊巴比妥钠	Sigma Aldrich	1507002
多聚甲醛	Sigma Aldrich	441244
对乙酰氨基酚	Sigma Aldrich	A7085
苦味酸-天狼星红染色液	Abcam	ab150681
心肌肌钙蛋白检测试剂盒	Abcam	ab200016
Imagequant	Molecular Dynamics
朗根多夫灌流装置	ADInstruments	ML870B2