利用腔室盖玻片模型可视化痰液对生物膜形成的影响

摘要

本方案描述了利用载玻片培养室模型，在暴露于宿主因子后对生物膜形成过程进行可视化观察的方法。该模型可实现对生物膜发育过程的直接观察，并可利用计算机软件对生物膜参数进行分析。

摘要

生物膜是由细菌群体及其自身分泌的基质包裹形成的结构。它们在工业污染以及多种与健康相关感染的发生和持续过程中发挥着重要作用。在人类疾病中，研究最为深入的生物膜之一是囊性纤维化患者慢性肺部感染中的生物膜。在宿主环境下研究生物膜时，多种宿主因素可能影响生物膜的形成与发展。为了明确宿主因素如何影响生物膜的形成与发育，我们采用静态腔室盖玻片法，在含有宿主来源物质（如痰液上清液）的条件下培养生物膜。将细菌接种至腔室内，并暴露于痰液滤过液中。经过48小时培养后，使用商用生物膜活性检测试剂盒对生物膜进行染色，随后进行共聚焦显微镜观察与分析。在获取图像后，可利用不同软件平台评估生物膜的特性。该方法使我们能够在包括抗生素在内的不同物质存在下，直观地观察生物膜生长的关键特性。

引言

细菌生物膜是由相互附着并包裹在自身分泌的基质中的一类微生物群体。^1,2 传统上，它们表现为在流动条件下附着于非生物或生物表面的细菌。研究也发现，生物膜可在静态条件（无流动）下生长，并远离表面形成，例如在热池的气液界面或试管中形成的菌膜。这类生物膜在自然环境中早已被认知，对工业过程造成严重危害，因其可在水库或管道中形成，导致生物污垢、腐蚀和堵塞。^3,4

生物膜在医疗环境中也至关重要，因其已被证实与导管相关感染、囊性纤维化患者的肺部感染以及其他多种感染有关。^5,6 生物膜感染的一个显著特征是细菌对抗生素的敏感性降低，并且难以被先天免疫系统清除。^7-9 最为深入研究且具有临床意义的生物膜感染情况出现在囊性纤维化（CF）患者中，这些患者长期感染铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜。P. aeruginosa 在建立慢性感染过程中可发生多种变化，使其极难治疗。^10,11 生物膜可差异性地激活先天免疫并引发炎症反应。^12-14 由于这些感染导致CF患者发病率和死亡率升高，因此深入了解在此背景下影响生物膜形成的各类因素至关重要。

最近一项研究表明，宿主因子在铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物膜聚集体的形成过程中....

方案

请注意，收集和储存人类受试者的痰液样本需经研究伦理委员会（REB）批准。本研究已获病童医院研究伦理委员会（REB#1000019444）批准。

1. 准备CF痰液样本

1. 在囊性纤维化门诊的常规就诊期间采集患者的痰液样本，并置于冰上保存。
2. 采集后一小时内将痰液样本冰上运输至研究实验室，进行后续处理。

2. 痰液处理

1. 记录所获取痰液样本的体积。加入磷酸盐缓冲液（PBS）至样本体积的2倍即， 2 份 PBS，1 份样品
2. 用移液管充分混匀样品。将样品在最高转速下涡旋振荡1分钟，以确保完全混匀。
3. 将上述混合物每1 ml分装至适量的1.5 ml微量离心管中，在4 °C、5,000 × g条件下离心20 min。
4. 离心后，移除上清液并弃去沉淀。
5. 通过0.22 µm滤器对上清液进行过滤除菌，并收集至洁净的微量离心管中。
   注意：滤液的无菌性通过涂布于LB琼脂平板并接种液体培养基进行检测。
6. 将痰液上清液于 -80 °C 保存，以备后续使用。
   注意：多名患者的痰液在过滤后也可进行混合。
7. 使用前，将痰液滤液用所需培养基按1/10（v/v）稀释（100 μl 痰液 + 900 μl 培养基）。
   ....

结果

实验的整体设计如图1所示。本方案提供了一种便捷的方法，用于观察不同培养时间（例如，24、48 或 72 小时）下生物膜的变化。重要的是，可添加外源性信号分子（如痰液滤液），以观察其对生物膜发育过程的影响。如图2所示，10% 痰液滤液的存在可改变生物膜的结构（图2A，下方图示）¹⁶。这些图像可使用 COMSTAT 软件进行分析，以获得关键的生物膜参数，包括生物膜的平均厚度、总生物量和表面覆盖率。这体现在生物膜整体厚度的增加上（图2B 和 图3）¹⁶。在痰液存在条件下抗生素对生物膜的影响如图3所示。通过直观观察生物膜发育过程中的变化，可以更深入地理解不同因素对生物膜生长的影响，其信息量远超过传统的生物膜检测方法（如结晶紫染色法）。

讨论

本文所述方法可用于可视化在存在外源性产物条件下生长的细菌生物膜。使用此类系统时，外源产物的生成具有重要意义，这一点并不意外。例如，二硫苏糖醇（DTT）常用于人痰液样本以促进样本液化。然而，单独使用 DTT 可能会降低生物膜的发育能力与活性（数据未显示）。因此，针对所有实验条件设置适当的对照组是必要的。此外，由于每位患者的痰液具有独特的微生物组，添加人痰液产物会为实验带来固有的变异性。为校正这一因素，我们采用混合痰液样本，以避免得到仅针对特定患者的实验结果。另外，在使用任何模型系统时，选择合适的培养基也至关重要。建议在系统初始建立时，使用目标生物体生物膜生长的标准培养基。如果实验目的是研究外源性产物如何影响生物膜形成，则推荐使用营养丰富的培养基，以支持充分的生物膜形成。这将确保生物体获得充足营养的同时，评估外源性因素对生物膜的影响。其他类型的培养基，如最低培养基或成分明确培养基，也可用于更好地模拟特定条件。在本系统中，其他培养基也已被成功使用（数据未显示）。生物膜在带腔室盖玻片上的附着较为牢固，但在更换或添加培养基以及对生物膜进行洗涤操作时，必须格外小心，以防止破坏生物膜结构。

按照.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lab-Tek II 培养皿盖玻片，#1.5 硼硅玻璃，8 孔	Thermo Fisher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead 生物膜活力检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	L10316
血琼脂平板	Thermo Fisher Scientific	R10215	通过菌落形成单位（CFU）计数确认活性，或挑选菌落用于接种
COMSTAT	可在线获取的软件		COMSTAT 是用于分析生物膜图像的软件，可从 www.comstat.dk 获取
Miller's LB 肉汤	Thermo Fisher Scientific	12780-052	用于过夜培养/生物膜生长的标准培养基
Millex-GV 注射器滤器	Millipore	SLGV013SL	用于过滤痰液上清
磷酸盐缓冲液（Dulbecco A）	Oxoid	BR0014G	更换培养基后清洗生物膜培养腔
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	QS Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		该软件使用说明可从以下网址获取：http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf