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方法文章

利用腔室盖玻片模型可视化痰液对生物膜形成的影响

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DOI：

10.3791/54819

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2016年12月14日

 ,  ,  , 
1Physiology and Experimental Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Clinical Microbiology, Royal College of Surgeons in Ireland, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Pediatrics, University of Toronto

本文内容

摘要

本方案描述了利用载玻片培养室模型，在暴露于宿主因子后对生物膜形成过程进行可视化观察的方法。该模型可实现对生物膜发育过程的直接观察，并可利用计算机软件对生物膜参数进行分析。

摘要

生物膜是由细菌群体及其自身分泌的基质包裹形成的结构。它们在工业污染以及多种与健康相关感染的发生和持续过程中发挥着重要作用。在人类疾病中，研究最为深入的生物膜之一是囊性纤维化患者慢性肺部感染中的生物膜。在宿主环境下研究生物膜时，多种宿主因素可能影响生物膜的形成与发展。为了明确宿主因素如何影响生物膜的形成与发育，我们采用静态腔室盖玻片法，在含有宿主来源物质（如痰液上清液）的条件下培养生物膜。将细菌接种至腔室内，并暴露于痰液滤过液中。经过48小时培养后，使用商用生物膜活性检测试剂盒对生物膜进行染色，随后进行共聚焦显微镜观察与分析。在获取图像后，可利用不同软件平台评估生物膜的特性。该方法使我们能够在包括抗生素在内的不同物质存在下，直观地观察生物膜生长的关键特性。

引言

细菌生物膜是由相互附着并包裹在自身分泌的基质中的一类微生物群体。1,2 传统上，它们表现为在流动条件下附着于非生物或生物表面的细菌。研究也发现，生物膜可在静态条件（无流动）下生长，并远离表面形成，例如在热池的气液界面或试管中形成的菌膜。这类生物膜在自然环境中早已被认知，对工业过程造成严重危害，因其可在水库或管道中形成，导致生物污垢、腐蚀和堵塞。3,4

生物膜在医疗环境中也至关重要，因其已被证实与导管相关感染、囊性纤维化患者的肺部感染以及其他多种感染有关。5,6 生物膜感染的一个显著特征是细菌对抗生素的敏感性降低，并且难以被先天免疫系统清除。7-9 最为深入研究且具有临床意义的生物膜感染情况出现在囊性纤维化（CF）患者中，这些患者长期感染铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜。P. aeruginosa 在建立慢性感染过程中可发生多种变化，使其极难治疗。10,11 生物膜可差异性地激活先天免疫并引发炎症反应。12-14 由于这些感染导致CF患者发病率和死亡率升高，因此深入了解在此背景下影响生物膜形成的各类因素至关重要。

最近一项研究表明，宿主因子在铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物膜聚集体的形成过程中起着关键作用15。这些生物膜会降低对抗生素和宿主防御机制的敏感性。来源于宿主的因子（如中性粒细胞弹性蛋白酶）以及囊性纤维化（CF）患者肺部共存微生物分泌的产物，均可能显著调控生物膜的形成与发展16。此外，生物膜还会与宿主相互作用，调节多种信号通路的表达并引发炎症反应。尽管高通量方法（如标准结晶紫染色法）可提供有关生物膜过程的部分信息，但对这些因子作用下生物膜的可视化观察则能提供更为深入的信息。

在本文中，我们描述了一种利用囊性纤维化（CF）患者痰液中的因子来研究生物膜形成的方法 体外 该方法利用商用生物膜活性检测试剂盒，可快速可视化含有宿主因子的痰液处理后的生物膜。该技术可用于直观识别外源性物质存在条件下生物膜生长过程中发生的变化，代表了一种改进的分析不同条件下生物膜发育变化的方法。

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方案

请注意，收集和储存人类受试者的痰液样本需经研究伦理委员会（REB）批准。本研究已获病童医院研究伦理委员会（REB#1000019444）批准。

1. 准备CF痰液样本

  1. 在囊性纤维化门诊的常规就诊期间采集患者的痰液样本，并置于冰上保存。
  2. 采集后一小时内将痰液样本冰上运输至研究实验室，进行后续处理。

2. 痰液处理

  1. 记录所获取痰液样本的体积。加入磷酸盐缓冲液（PBS）至样本体积的2倍即， 2 份 PBS，1 份样品
  2. 用移液管充分混匀样品。将样品在最高转速下涡旋振荡1分钟，以确保完全混匀。
  3. 将上述混合物每1 ml分装至适量的1.5 ml微量离心管中，在4 °C、5,000 × g条件下离心20 min。
  4. 离心后，移除上清液并弃去沉淀。
  5. 通过0.22 µm滤器对上清液进行过滤除菌，并收集至洁净的微量离心管中。
    注意：滤液的无菌性通过涂布于LB琼脂平板并接种液体培养基进行检测。
  6. 将痰液上清液于 -80 °C 保存，以备后续使用。
    注意：多名患者的痰液在过滤后也可进行混合。
  7. 使用前，将痰液滤液用所需培养基按1/10（v/v）稀释（100 μl 痰液 + 900 μl 培养基）。
    注意：此处使用了标准的溶菌肉汤（LB）培养基。

3. 生物膜形成的多室盖玻片法

  1. 在所需培养基中，于37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养目标细菌分离株。
    注意：使用了多种不同的细菌，包括临床分离株 铜绿假单胞菌, 金黄色葡萄球菌, 洋葱伯克霍尔德菌 复杂且 Achromobacter xylosoxidans 培养基的选择取决于所研究的菌株和条件，但初始实验可使用LB培养基。
  2. 从过夜培养物中，取40 μl培养液加入4 ml新鲜培养基中，于37 °C振荡培养3–4小时（200 RPM），以获得在600 nm处光密度（OD600约为 0.5–0.6。
  3. 将步骤3.2中的培养物用含10%痰滤液或不含痰滤液（作为对照）的目标培养基稀释至1/5。可测试其他浓度的痰滤液（即， 50% 或 100%
  4. 使用200 μl稀释液接种至载玻片培养室的孔中。
  5. 在37 °C下静置培养4小时，使细菌贴壁。
  6. 4小时后，吸除培养基，用200 μl新鲜培养基轻轻冲洗生物膜，然后更换为200 μl新鲜培养基。
    注意：为了研究痰液对生物膜的影响，新鲜培养基中应含有痰液上清液。
  7. 在37 °C条件下静置培养生物膜，根据需要培养相应时间，每12小时更换一次培养基，直至显微镜观察前均不进行洗涤。
    注意：为了研究痰液上清液对生物膜抗生素敏感性的影响，需在生物膜培养24小时后将抗生素加入培养基中，并在生物膜染色与成像前持续保留在培养基中。

4. 生物膜染色与共聚焦显微镜观察

  1. 在合适的培养时间后（24–48 小时效果最佳），移除腔室孔中的培养基，并用 300 μl 无菌 PBS 轻柔地清洗每个腔室两次。
  2. 通过将每毫升所需溶液中加入 1 µl 的每种染料（来自活性检测试剂盒）来配制用于生物膜染色的混合液。将染料溶于水或培养基溶液中。
    注意：制造商建议使用水。
  3. 向每个载玻片腔室孔中加入 200 µl 染色混合液，在室温下避光孵育 45 分钟。
  4. 从腔室中移除染色液，并用 300 μl 无菌 PBS 清洗每个孔。移除 PBS 后，加入新鲜的水或培养基。
  5. 通过共聚焦显微镜观察生物膜。

5. 使用共聚焦显微镜观察生物膜

  1. 染色后立即（1小时内）读取载玻片上的生物膜。每次仅对1至2个8孔板进行染色，以尽量减少观察切片时的延迟。
  2. 使用共聚焦显微镜，配备激发激光器和采集用滤光片组进行成像。
    注：此处使用配备光谱Borealis激光器的转盘共聚焦系统（绿色：491 nm，红色：561 nm）进行激发，采用515/40和624/40发射滤光片组来观察生物膜活性检测试剂盒的染色结果。
  3. 使用共聚焦显微镜配备相机及25倍水镜采集图像。
  4. 使用Z轴堆栈（Z-Stacks）对生物膜进行建模。从生物膜首个清晰对焦平面开始，至最后一个清晰对焦平面结束，每隔0.5–1 μm采集一次图像（对于培养48小时的生物膜，通常覆盖30–80 μm范围）。
  5. 从每个孔中采集3–5张图像。
    注：因此，对于一个8孔腔室盖玻片，将生成24–40张图像。
  6. 保存图像以供分析。
    注：图像应保存为OME-TIFF格式，以便使用COMSTAT18,19进行分析。生物膜图像分析的操作说明可访问 http://www.comstat.dk/。导入图像后，可分析各通道（红色和绿色）的平均厚度、生物量和表面覆盖率等参数。

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结果

实验的整体设计如图1所示。本方案提供了一种便捷的方法，用于观察不同培养时间（例如，24、48 或 72 小时）下生物膜的变化。重要的是，可添加外源性信号分子（如痰液滤液），以观察其对生物膜发育过程的影响。如图2所示，10% 痰液滤液的存在可改变生物膜的结构（图2A，下方图示）16。这些图像可使用 COMSTAT 软件进行分析，以获得关键的生物膜参数，包括生物膜的平均厚度、总生物量和表面覆盖率。这体现在生物膜厚度的整体增加（图2B 和 图3）16。在痰液存在条件下抗生素对生物膜的影响如图3所示。通过直观观察生物膜发育过程中的变化，可以更深入地理解各种因素对生物膜生长的影响，其效果远优于传统的生物膜检测方法（如结晶紫染色法）。

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讨论

本文所述方法可用于可视化在存在外源性产物条件下生长的细菌生物膜。使用此类系统时，外源产物的生成具有重要意义，这一点并不意外。例如，二硫苏糖醇（DTT）常用于人痰液样本以促进样本液化。然而，单独使用 DTT 可能会降低生物膜的发育能力与活性（数据未显示）。因此，针对所有实验条件设置适当的对照组是必要的。此外，由于每位患者的痰液具有独特的微生物组，添加人痰液产物会为实验带来固有的变异性。为校正这一因素，我们采用混合痰液样本，以避免得到仅针对特定患者的实验结果。另外，在使用任何模型系统时，选择合适的培养基也至关重要。建议在系统初始建立时，使用目标生物体生物膜生长的标准培养基。如果实验目的是研究外源性产物如何影响生物膜形成，则推荐使用营养丰富的培养基，以支持充分的生物膜形成。这将确保生物体获得充足营养的同时，评估外源性因素对生物膜的影响。其他类型的培养基，如最低培养基或成分明确培养基，也可用于更好地模拟特定条件。在本系统中，其他培养基也已被成功使用（数据未显示）。生物膜在带腔室盖玻片上的附着较为牢固，但在更换或添加培养基以及对生物膜进行洗涤操作时，必须格外小心，以防止破坏生物膜结构。

按照...

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致谢

TB 感谢加拿大囊性纤维化基金会提供的研究奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Lab-Tek II 培养皿盖玻片，#1.5 硼硅玻璃，8 孔Thermo Fisher Scientific155409
Filmtracer Live/Dead 生物膜活力检测试剂盒Thermo Fisher ScientificL10316
血琼脂平板Thermo Fisher ScientificR10215通过菌落形成单位（CFU）计数确认活性，或挑选菌落用于接种
COMSTAT可在线获取的软件COMSTAT 是用于分析生物膜图像的软件，可从 www.comstat.dk 获取 
Miller's LB 肉汤Thermo Fisher Scientific12780-052用于过夜培养/生物膜生长的标准培养基
Millex-GV 注射器滤器MilliporeSLGV013SL用于过滤痰液上清
磷酸盐缓冲液（Dulbecco A）OxoidBR0014G更换培养基后清洗生物膜培养腔
Zeiss AxioVert 200MCarl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCDQS Technologies Inc.
Spectral BorealisQS Technologies Inc.
Perkin Elmer VolocityQS Technologies Inc.该软件使用说明可从以下网址获取：http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf

参考文献

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