适用于天然化合物库筛选的抗生物膜检测平台

摘要

生物膜感染对化学治疗表现出高度耐受性。单一检测方法无法全面反映生物膜的复杂性，因此需要采用多种互补的检测手段。我们介绍一种针对金黄色葡萄球菌（S. aureus）开发的筛选平台，该平台整合了用于检测活性、生物量及生物膜基质的多种检测方法，可用于抗生物膜药物的发现，并可评估化学治疗的长期效果。

摘要

生物膜被认为是现代生物医学最具挑战性的课题之一，可能与超过80%的抗生素耐受性感染相关。生物膜表现出异常高的化学治疗耐受性，这种耐受性被认为是多因素共同作用的结果。例如，生物膜基质形成一种物理屏障，降低了抗生素向生物膜内部的渗透。此外，生物膜内的细胞在表型上具有高度异质性。生物膜的抗性很可能是由上述因素以及其他尚未明确的机制共同导致的。目前所有已有的抗生素均是针对单细胞（浮游）细菌开发的，因此迄今为止，能够选择性作用于成熟生物膜的分子极为有限。这一现状推动了药物发现领域逐步发生范式转变，迫切要求将抗生物膜研究置于更加突出的地位。另一个挑战在于，目前可用于生物膜研究的标准化方法非常有限，尤其是可用于化学文库高通量筛选的方法。本文介绍了一种用于化学筛选的抗生物膜实验平台。该平台包含三种检测方法：通过刃天青（resazurin）染色检测生物膜活性，通过结晶紫（crystal violet）染色检测总生物量，以及利用麦芽凝集素（WGA-荧光）染色检测生物膜基质中的多聚-N-乙酰氨基葡萄糖（poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG）组分。所有实验均以Staphylococcus aureus作为模式菌株建立。文中展示了该平台在初筛以及对抗生物膜阳性化合物进行功能表征方面的应用实例。该实验流程还可根据所测定的终点指标对阳性化合物进行分类，并提供有关其作用机制的信息，特别是长期与短期化学治疗效应的差异。因此，该平台非常有利于快速识别高质量的阳性化合物，为多种生物医学应用提供理想的起始分子。

引言

细菌可以在浮游和固着这两种截然不同的生活方式之间转换，其中生物膜是最常见的固着生活方式实例。在生物膜中，细菌形成被包裹于自身分泌的基质中的结构化群落¹。这种自分泌的基质构成了细菌与其外部环境之间的屏障，保护微生物细胞并使其保持紧密相邻的状态。生物膜基质的组成在不同物种之间甚至同一物种内部均存在差异，但主要由脂多糖、胞外DNA和蛋白质构成的致密网络组成。该基质作为物理屏障，可阻止有害物质进入，同时还能防止生物膜脱水，并阻止营养物质从细胞周围流失²。

生物膜被认为是现代生物医学最具挑战性的课题之一，据称超过80%的耐抗生素感染与生物膜有关³。生物膜对各种外界威胁具有天然的高度耐受性：包括湿度、渗透压、机械应力⁴、热、紫外线辐射⁵、消毒剂、抗菌剂以及宿主免疫系统¹。例如，杀灭生物膜所需的抗菌剂浓度可比杀灭浮游细菌所需浓度高出多达1000倍。这种更高耐受性的原因似乎是多因素的。胞外基质形成了一道物理屏障，降低了抗生素向生物膜内部的渗透。此外，生物膜内的细胞在表型上具有多样性；由于生物膜内外存在氧气、营养物质和代谢产物的梯度，细胞在不同的代谢状态之间转换⁶。因此，在某些生物膜区域（如核心部位），细菌缺乏氧气和营养，处于代谢活性较低甚至完全休眠的状态⁷。这些完全休眠的细胞被称为持留细胞（persister cell....

方案

1. 培养细菌

1. 在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，于 37 °C、220 rpm 振荡条件下过夜培养细菌（16–18 小时）。
2. 将预培养物用新鲜 TSB 稀释 100–1,000 倍（根据细菌的生长速率而定；此处金黄色葡萄球菌（S. aureus）采用 1,000 倍稀释），于 37 °C、200 rpm 条件下培养至对数生长期（595 nm 处的光密度（OD₅₉₅）介于 0.2 至 0.6 之间）。
   注意：此步骤需根据菌株进行特异性优化。

2. 生物膜形成：暴露前与暴露后

1. 将对数生长期的菌液稀释100倍（相当于每毫升约含10⁶个菌落形成单位（CFU/ml））。
2. 暴露前处理方案
   1. 对于未处理的对照样品，向无菌96孔板的每个孔中加入200 µl稀释后的细菌培养液。
   2. 向每个孔中加入4 µl待测化合物或对照抗生素（50倍浓缩液）以及196 µl稀释后的细菌培养液。
   3. 在37 °C、200 rpm条件下，将96孔板置于摇床上孵育18小时。
      注意：此处使用的摇床振荡直径为2 mm。
3. 暴露后处理方案

结果

在所提出的平台中，对细菌的活性、生物量以及生物膜基质的影响进行了定量分析。在操作流程（图1）中，一个样品板先后用刃天青（resazurin）和结晶紫（crystal violet）染色，以同时评估对细菌生物膜活性和总生物膜生物量的影响。这两种检测可在同一块板上连续进行，因为先前已证实，首次使用刃天青染色对后续结晶紫染色结果无统计学上的显著影响（单独结晶紫染色与刃天青染色后结晶紫染色的最大信号吸光度单位比较，p = 0.4149，n = 20）²⁶。此外，还可同时评估对浮游细菌的影响。

当通过存活率或基于生物量的检测方法鉴定出阳性结果后，使用WGA探针对第二块微孔板进行染色，以定量分析化合物对生物膜基质中多糖组分（PNAG）的影响。该工作流程可用于化合物库的筛选，也可用于后续功能研究中对阳性化合物活性的测定，如下文所示。

讨论

目前尚无单一方法能够同时测定化合物对细胞活力、生物量及生物膜基质的影响。因此，有必要结合多种检测方法，以在初步筛选阶段同时检测化合物对这三个终点指标的影响。

刃天青染色法是一种非常简单的染色方案，仅需加入氧化还原探针即可。然而，确定生物膜与刃天青孵育的最佳时间对该实验的成功至关重要。在某些细菌菌株中，刃天青探针被还原为粉红色且具荧光的试卤灵过程非常迅速，而在其他菌株中则可能持续数小时¹⁹。此外，即使是同一种细菌菌株，浮游细菌与生物膜之间也可能存在显著差异。浮游细菌通常更容易被探针接触，主要原因是浮游状态下的细菌密度低于生物膜状态，从而促进反应更快地进行。在一项已发表的关于生物膜活性染色探针的比较研究中，刃天青被认为是最准确、操作最简便且成本最低的检测方法之一¹⁹。此外，该方法已被证明适用于多种细菌和真菌生物体¹⁹。另一方面，结晶紫染色法是目前最广泛用于生物膜生物量定量的方法^19,32,33。该方案中最关键的步骤是结晶紫染色液的添加与去除，这些操作必须极为小心，以避免非特异性染色（例如

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
刃天青	Sigma Aldrich	R7017
结晶紫	Sigma Aldrich	HT90132
麦胚凝集素，Alexa Fluor 488 标记物	Thermo Fisher Scientific	W11261
LIVE/DEAD BacLight	Molecular Probes	L7012	SYTO 9 用于将活细胞染成绿色，碘化丙啶用于将死细胞染成红色
磷酸盐缓冲液
胰蛋白胨大豆琼脂	Lab M, Neogen	LAB011
胰蛋白胨大豆肉汤	Lab M, Neogen	LAB004
F96 孔板 聚苯乙烯 无菌 透明 平底	Thermo Fisher Scientific	161093
BRAND 盖帽，8联条	Sigma Aldrich	BR781413-300EA
Branson CPX 系列超声波清洗仪	Sigma Aldrich	Z769428-1EA
多道移液器	Thermo Fisher Scientific
多通道分液器	Thermo Fisher Scientific
Biomek 3000	Beckman Coulter
Varioskan Flash 多功能酶标仪	Thermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureus	ATCC	25923