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方法文章

适用于天然化合物库筛选的抗生物膜检测平台

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DOI：

10.3791/54829

⸱

2016年12月27日

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

本文内容

摘要

生物膜感染对化学治疗表现出高度耐受性。单一检测方法无法全面反映生物膜的复杂性，因此需要采用多种互补的检测手段。我们介绍一种针对金黄色葡萄球菌（S. aureus）开发的筛选平台，该平台整合了用于检测活性、生物量及生物膜基质的多种检测方法，可用于抗生物膜药物的发现，并可评估化学治疗的长期效果。

摘要

生物膜被认为是现代生物医学最具挑战性的课题之一，可能与超过80%的抗生素耐受性感染相关。生物膜表现出异常高的化学治疗耐受性，这种耐受性被认为是多因素共同作用的结果。例如，生物膜基质形成一种物理屏障，降低了抗生素向生物膜内部的渗透。此外，生物膜内的细胞在表型上具有高度异质性。生物膜的抗性很可能是由上述因素以及其他尚未明确的机制共同导致的。目前所有已有的抗生素均是针对单细胞（浮游）细菌开发的，因此迄今为止，能够选择性作用于成熟生物膜的分子极为有限。这一现状推动了药物发现领域逐步发生范式转变，迫切要求将抗生物膜研究置于更加突出的地位。另一个挑战在于，目前可用于生物膜研究的标准化方法非常有限，尤其是可用于化学文库高通量筛选的方法。本文介绍了一种用于化学筛选的抗生物膜实验平台。该平台包含三种检测方法：通过刃天青（resazurin）染色检测生物膜活性，通过结晶紫（crystal violet）染色检测总生物量，以及利用麦芽凝集素（WGA-荧光）染色检测生物膜基质中的多聚-N-乙酰氨基葡萄糖（poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG）组分。所有实验均以Staphylococcus aureus作为模式菌株建立。文中展示了该平台在初筛以及对抗生物膜阳性化合物进行功能表征方面的应用实例。该实验流程还可根据所测定的终点指标对阳性化合物进行分类，并提供有关其作用机制的信息，特别是长期与短期化学治疗效应的差异。因此，该平台非常有利于快速识别高质量的阳性化合物，为多种生物医学应用提供理想的起始分子。

引言

细菌可以在浮游和固着这两种截然不同的生活方式之间转换，其中生物膜是最常见的固着生活方式实例。在生物膜中，细菌形成被包裹于自身分泌的基质中的结构化群落1。这种自分泌的基质构成了细菌与其外部环境之间的屏障，保护微生物细胞并使其保持紧密相邻的状态。生物膜基质的组成在不同物种之间甚至同一物种内部均存在差异，但主要由脂多糖、胞外DNA和蛋白质构成的致密网络组成。该基质作为物理屏障，可阻止有害物质进入，同时还能防止生物膜脱水，并阻止营养物质从细胞周围流失2。

生物膜被认为是现代生物医学最具挑战性的课题之一，据称超过80%的耐抗生素感染与生物膜有关3。生物膜对各种外界威胁具有天然的高度耐受性：包括湿度、渗透压、机械应力4、热、紫外线辐射5、消毒剂、抗菌剂以及宿主免疫系统1。例如，杀灭生物膜所需的抗菌剂浓度可比杀灭浮游细菌所需浓度高出多达1000倍。这种更高耐受性的原因似乎是多因素的。胞外基质形成了一道物理屏障，降低了抗生素向生物膜内部的渗透。此外，生物膜内的细胞在表型上具有多样性；由于生物膜内外存在氧气、营养物质和代谢产物的梯度，细胞在不同的代谢状态之间转换6。因此，在某些生物膜区域（如核心部位），细菌缺乏氧气和营养，处于代谢活性较低甚至完全休眠的状态7。这些完全休眠的细胞被称为持留细胞（persister cells），对常规抗菌治疗不敏感8。因此，生物膜的强韧性可能源于目前已提出机制与其他尚未明确机制的共同作用。Staphylococcus spp. 仍是引起严重感染（常与生物膜相关）的最具问题性的革兰氏阳性菌之一4。有研究指出，高达99%的细菌都以生物膜形式存在，使生物膜成为细菌的主要生存方式3。然而，目前所有已有的抗生素都是针对单细胞（浮游）细菌开发的。迄今为止，能够特异性作用于成熟生物膜的分子种类极为有限。这一现状推动了药物研发领域逐步发生范式转变，迫切要求将抗生物膜药物的探索置于更加突出的地位。

从方法学角度来看，还存在其他挑战，因为标准制定机构开发的生物膜研究方法数量有限，尤其是适用于化学文库高通量筛选的方法。所有标准化检测方法（仅有一个例外）均基于生物膜反应器，这些方法需要较大的工作体积和大量待测化合物，而这些在早期研究阶段通常难以获得9-12。目前唯一可用于标准化筛选的检测方法是所谓的卡尔加里生物膜装置（Calgary Biofilm Device），商业化的最小生物膜清除浓度（MBEC）系统即由此发展而来13-15。然而，该检测方法的局限性在于生物膜是在小柱上生长的，并非所有细菌种类，甚至同一种内的不同菌株，都能在此装置上形成生物膜。此外，亟需可用于天然化合物探索的特异性方法。在过去一个世纪中，天然产物一直是抗菌药物发现创新的主要来源16。它们能够提供具有独特作用机制的新型抗生物膜化合物，且对持留细胞也具有活性。因此，对天然及仿天然化合物文库的探索极有可能发现具有前景且独特的抗生物膜候选分子。

本文介绍了用于抗生物膜化合物化学筛选的实验平台，该平台包含三种检测方法，分别用于评估化合物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物膜的活性、总生物量以及基质的影响。第一种检测方法基于刃天青（resazurin）染色法测定生物膜的活性。刃天青是一种氧化还原指示剂，在氧化状态下呈蓝色且无荧光，当被细菌代谢活性还原后，会转变为粉红色且具有强荧光的试卤灵（resorufin）。该方法操作简便、快速，适用于初筛17-20。第二种检测方法基于结晶紫（crystal violet）染色法，用于测定生物膜的总质量。结晶紫是研究细菌及其生物膜中广泛使用的染料19,21-23。该方法使用廉价试剂，且通过吸光度读数即可完成终点检测。第三种检测方法针对生物膜的胞外聚合物基质（EPS），利用麦胚凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）特异性结合葡萄球菌生物膜基质中存在的多聚-N-乙酰氨基葡萄糖（poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG）残基24。WGA 与荧光染料偶联，可通过荧光强度读数仪进行检测25。本文详细阐述了该检测平台的设计原理与操作细节，并提供了应用实例。

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方案

1. 培养细菌

  1. 在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，于 37 °C、220 rpm 振荡条件下过夜培养细菌（16–18 小时）。
  2. 将预培养物用新鲜 TSB 稀释 100–1,000 倍（根据细菌的生长速率而定；此处金黄色葡萄球菌（S. aureus）采用 1,000 倍稀释），于 37 °C、200 rpm 条件下培养至对数生长期（595 nm 处的光密度（OD595）介于 0.2 至 0.6 之间）。
    注意：此步骤需根据菌株进行特异性优化。

2. 生物膜形成：暴露前与暴露后

  1. 将对数生长期的菌液稀释100倍（相当于每毫升约含106个菌落形成单位（CFU/ml））。
  2. 暴露前处理方案
    1. 对于未处理的对照样品，向无菌96孔板的每个孔中加入200 µl稀释后的细菌培养液。
    2. 向每个孔中加入4 µl待测化合物或对照抗生素（50倍浓缩液）以及196 µl稀释后的细菌培养液。
    3. 在37 °C、200 rpm条件下，将96孔板置于摇床上孵育18小时。
      注意：此处使用的摇床振荡直径为2 mm。
  3. 暴露后处理方案
    1. 对于所有样品，向无菌96孔板的每个孔中加入200 µl稀释后的细菌培养液。
    2. 在37 °C、200 rpm条件下，将96孔板置于摇床上孵育18小时。
      注意：此处使用的摇床振荡直径为2 mm。
    3. 使用多通道移液器小心移除全部浮游液体，注意不要触碰生物膜。
    4. 向每个孔中加入4 µl待测化合物或对照抗生素（50倍浓缩液）以及196 µl TSB培养基。
    5. 在37 °C、200 rpm条件下，将96孔板置于摇床上继续孵育额外24小时。
      注意：此处使用的摇床振荡直径为2 mm。

3. 生物膜活性评估的刃天青染色方案

  1. 在无菌 PBS 中配制 0.1 mg/ml（0.4 mM）刃天青储备液。保持储备液无菌，避光保存，并置于 4 °C 环境中。
  2. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将刃天青储备液按 1:50 比例稀释，以获得终浓度为 20 µM 的工作液。
  3. 使用多通道移液器小心转移全部浮游液（保留微孔中的生物膜），避免接触生物膜或产生气泡，转移至另一个干净的 96 孔板中。
  4. 用无菌 PBS 洗涤生物膜一次，每孔加入 200 µl，然后使用多通道移液器小心吸除。
  5. 使用多通道移液器向生物膜板的每孔中加入 200 µl 稀释后的刃天青溶液。
  6. 在避光条件下，于室温（RT）以 200 rpm 振荡孵育约 20 分钟，直至未处理的生物膜对照孔呈现均匀的粉红色。
  7. 使用酶标仪在激发波长 λexc = 560 nm 和发射波长 λem = 590 nm 处检测荧光信号（顶部读数）。

4. 使用与步骤3相同培养板进行生物膜生物量定量的结晶紫染色方案

  1. 使用多通道移液器小心地从孔中移除刃天青染色液。
  2. 用 200 µl 甲醇固定生物膜，孵育 15 分钟。
  3. 将板子在空气中干燥 10 分钟。
  4. 使用多通道移液器小心加入 190 µl 0.02 %（体积比，用去离子水稀释）结晶紫溶液。移液时避免染色液接触孔壁，并避免按压移液器到底以防止产生气泡。
  5. 在室温下孵育 5 分钟。
  6. 使用多通道移液器小心移除染色液。
  7. 用去离子水洗涤两次（每次 200 µl）。
  8. 让孔在室温下干燥 5 分钟，然后用 96% 乙醇或 33% 乙酸溶解残留的染色。
  9. 在室温下孵育 1 小时，并在 595 nm 处测定吸光度。

5. 使用与生物膜实验相同的样本板评估浮游细菌的杀菌效果

  1. 使用3.3步骤中获得的浮游液，测定平板在595 nm处的浊度。
  2. 通过向每孔加入10 µl resazurin储备液对浮游细菌进行染色，用移液器充分混匀。
  3. 在室温下避光孵育约5分钟，直至未处理对照孔呈现均匀的粉红色。
  4. 在激发波长λexc = 560 nm和发射波长λem = 590 nm条件下测定荧光强度。

6. 凝集素染色法用于生物膜基质的定量及荧光显微镜成像

  1. 基质定量
    1. 在无菌 PBS 中配制浓度为 5 µg/ml 的 WGA 探针溶液。
    2. 使用平行样品板进行此染色。从孔中移除浮游液，并用无菌 PBS（每孔 200 µl）洗涤一次，使用多通道移液器时小心操作，避免触碰生物膜。
    3. 向每孔中加入 200 µl WGA 溶液以进行染色。
    4. 在 4 °C 黑暗条件下孵育 2 小时。
    5. 用 200 µl PBS 洗涤孔内三次，以去除未结合的染料。
    6. 在室温下让板子干燥 15 分钟。
    7. 用 33% 乙酸溶解结合的染料，每孔加入 200 µl。
    8. 用封板条密封各孔，并在室温下使用水浴超声仪以 40 kHz 超声处理 30 秒。
    9. 在室温下孵育 1 小时。
    10. 重复超声步骤一次。两次超声之间可保持孔板密封状态。
    11. 使用酶标仪在 λex = 495 nm 和 λem = 520 nm 条件下检测荧光（顶部读数）。
  2. 使用荧光显微镜观察基质
    1. 采用上述相同方案操作，直至步骤 6.1.6。
    2. 干燥后，使用配备 FITC 滤光片（或其他合适的绿色激发滤光片）的荧光显微镜观察样品。

7. 使用荧光显微镜对生物膜中的活细胞和死细胞进行染色成像，并对绿色与红色信号比值（G/R）进行定量分析

  1. 荧光显微镜成像
    1. 根据制造商的说明，配制每种探针溶液（一种用于染色活细胞，另一种用于染色死细胞）。
    2. 使用多通道移液器移除各孔中的浮游液体，并用无菌 PBS 洗涤一次（每孔 200 µl）。
    3. 每孔加入 6 µl 染色溶液。
    4. 将培养板置于避光条件下孵育 15 分钟。
    5. 显微观察前，使用多通道移液器手动移除多余液体。
    6. 使用荧光显微镜拍摄图像，例如采用 FITC 滤光片（检测绿色荧光，对应活细胞）或 TRITC 滤光片（检测红色荧光，对应死细胞）。
  2. 以绿红荧光比值（G/R）进行信号定量
    1. 按照步骤 7.1.1 和 7.1.2 的相同方案操作。
    2. 每孔加入 200 µl 染色溶液，在避光条件下孵育 15 分钟。
    3. 使用酶标仪分别在激发/发射波长 485/535 nm 和 485/635 nm 下测定绿色和红色荧光强度（顶部读数模式）。

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结果

在所提出的平台中，对细菌的活性、生物量以及生物膜基质的影响进行了定量分析。在操作流程（图1）中，一个样品板先后用刃天青（resazurin）和结晶紫（crystal violet）染色，以同时评估对细菌生物膜活性和总生物膜生物量的影响。这两种检测可在同一块板上连续进行，因为先前已证实，首次使用刃天青染色对后续结晶紫染色结果无统计学上的显著影响（单独结晶紫染色与刃天青染色后结晶紫染色的最大信号吸光度单位比较，p = 0.4149，n = 20）26。此外，还可同时评估对浮游细菌的影响。

当通过存活率或基于生物量的检测方法鉴定出阳性结果后，使用WGA探针对第二块微孔板进行染色，以定量分析化合物对生物膜基质中多糖组分（PNAG）的影响。该工作流程可用于化合物库的筛选，也可用于后续功能研究中对阳性化合物活性的测定，如下文所示。

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讨论

目前尚无单一方法能够同时测定化合物对细胞活力、生物量及生物膜基质的影响。因此，有必要结合多种检测方法，以在初步筛选阶段同时检测化合物对这三个终点指标的影响。

刃天青染色法是一种非常简单的染色方案，仅需加入氧化还原探针即可。然而，确定生物膜与刃天青孵育的最佳时间对该实验的成功至关重要。在某些细菌菌株中，刃天青探针被还原为粉红色且具荧光的试卤灵过程非常迅速，而在其他菌株中则可能持续数小时19。此外，即使是同一种细菌菌株，浮游细菌与生物膜之间也可能存在显著差异。浮游细菌通常更容易被探针接触，主要原因是浮游状态下的细菌密度低于生物膜状态，从而促进反应更快地进行。在一项已发表的关于生物膜活性染色探针的比较研究中，刃天青被认为是最准确、操作最简便且成本最低的检测方法之一19。此外，该方法已被证明适用于多种细菌和真菌生物体19。另一方面，结晶紫染色法是目前最广泛用于生物膜生物量定量的方法19,32,33。该方案中最关键的步骤是结晶紫染色液的添加与去除，这些操作必须极为小心，以避免非特异性染色（例如

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢比利时安特卫普大学LMPH的Paul Cos教授在其实验室拍摄过程中提供的支持。本工作由芬兰科学院项目（项目编号272266和282981）以及芬兰瑞典科学技术学会资助。谨此感谢硕士Janni Kujala的技术贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
刃天青Sigma AldrichR7017
结晶紫Sigma AldrichHT90132 
麦胚凝集素，Alexa Fluor 488 标记物Thermo Fisher ScientificW11261
LIVE/DEAD BacLight Molecular ProbesL7012SYTO 9 用于将活细胞染成绿色，碘化丙啶用于将死细胞染成红色
磷酸盐缓冲液
胰蛋白胨大豆琼脂Lab M, NeogenLAB011
胰蛋白胨大豆肉汤Lab M, NeogenLAB004
F96 孔板 聚苯乙烯 无菌 透明 平底Thermo Fisher Scientific161093
BRAND 盖帽，8联条Sigma AldrichBR781413-300EA
Branson CPX 系列超声波清洗仪Sigma AldrichZ769428-1EA
多道移液器Thermo Fisher Scientific
多通道分液器Thermo Fisher Scientific
Biomek 3000Beckman Coulter
Varioskan Flash 多功能酶标仪Thermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureusATCC 25923

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