胰岛β细胞死亡发生在1型糖尿病发病之前，检测这一过程可能有助于早期进行治疗干预。本文详细描述了如何测定人血清中胰岛素基因（INS）不同甲基化DNA序列，作为β细胞死亡的生物标志物。
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摘要
摘要
胰岛β细胞的死亡被认为是几乎所有类型糖尿病发病机制的基础，并且发生在明显高血糖出现之前，尤其是在1型糖尿病中。开发敏感且可靠的β细胞死亡生物标志物，可能有助于早期进行治疗干预，以预防或延缓糖尿病的发生。最近，包括我们研究组在内的多个团队报道，循环中游离的、差异甲基化的编码前胰岛素原（INS）的DNA与1型糖尿病前期及新发1型糖尿病中的β细胞死亡相关。本文中，我们提供了一种使用数字PCR逐步检测游离INS DNA的实验方案，该DNA在转录起始位点上游-69 bp处的胞嘧啶具有差异甲基化状态。我们证明，该检测方法能够区分-69 bp位点处甲基化与非甲基化的胞嘧啶，具有多个数量级的线性范围，可对DNA拷贝数进行绝对定量，并可用于新发1型糖尿病患者和无疾病对照个体的人血清样本分析。此处描述的方案可适用于任何需要检测差异甲基化胞嘧啶的DNA分子，无论其来源于循环系统还是分离的细胞与组织，并可实现对DNA片段的绝对定量。
引言
1型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性疾病，其特征是胰岛素生成性胰岛β细胞被自身反应性T细胞破坏1。T1D的诊断通常基于对体型偏瘦的年轻个体进行高血糖（血糖浓度> 200 mg/dl）的检测，患者可能表现出酮症酸中毒，提示胰岛素缺乏。在T1D确诊时，已有证据表明β细胞功能和质量显著丧失（达50–90%）2。在临床研究中，多种在诊断时即开始使用的免疫调节药物可使β细胞功能（以及可能的质量）趋于稳定，但尚无任何药物可实现疾病的临床缓解。这一结果促使人们呼吁开发用于早期发现疾病以及纵向追踪联合治疗效果的生物标志物3,4。国际协作组织（如美国国立卫生研究院下属的人类胰岛研究网络联盟5）已强调，亟需开发聚焦于T1D中β细胞应激与死亡的生物标志物。
与这些努力一致，我们研究团队及其他团队近期开发了生物标志物检测方法，用于检测主要来源于死亡β细胞的循环中表观遗传修饰的DNA片段6-9。迄今为止已发表的所有检测方法均聚焦于定量编码前胰岛素原的人类基因（INS），该基因在编码区和启动子区域的CpG位点未甲基化程度高于其他细胞类型。未甲基化的INS DNA片段的释放被认为主要来源于死亡（坏死性或凋亡性）的β细胞。我们近期的研究表明，在青少年中，新发1型糖尿病（T1D）患者在转录起始位点上游-69 bp位置处的未甲基化和甲基化INS DNA水平均升高，二者联合可作为该人群特异性的生物标志物6。这些生物标志物检测方法包括：使用商用离心柱试剂盒从血清或血浆中分离游离DNA，随后对分离得到的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理（将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变）。
在本报告中，我们描述了血清样本采集、从血清中分离游离细胞DNA、亚硫酸氢盐转化以及针对差异甲基化的INS DNA进行微滴数字PCR（以下简称数字PCR）的技术细节。
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方案
伦理声明：研究方案经印第安纳大学机构审查委员会批准。受试者家长提供了书面知情同意，年龄超过7岁的儿童则提供了参与研究的同意书。
1. 血清处理
注意：所述检测方法已使用以下方式分离的人血清进行了严格测试。
- 使用一支红色盖子的（无添加剂；未涂层）采血管采集血液。
- 在室温下静置30分钟，使血液凝固形成凝块。
- 在室温下以2,000 × g离心10分钟。将上清液（血清）转移至一个新的用于储存血清的试管中（聚丙烯螺口管，规格根据样本而定）。
- 将样本储存于-80 ºC，直至进行DNA提取。
2. 血清DNA提取
注意：使用 DNA 提取试剂盒提取 DNA，建议采用 50 µl 血清，按照制造商提供的方案进行部分修改后操作。
- 在微量离心管中为每个样品配制 200 µl 裂解缓冲液 + 1 µl 多聚腺苷酸（poly(A)）（5 µg）。涡旋振荡 15 秒。放置一旁，待步骤 2.3 使用。
- 从 -80 ºC 冰箱中取出血清样品，在室温下解冻。使用磷酸盐缓冲液（PBS，含氯化钙和氯化镁）将血清样品体积补足至 200 µl。
- 向样品中加入 20 µl 蛋白酶（1.4 Anson 单位/ml）以裂解样品，随后加入 200 µl 裂解缓冲液/多聚A混合液（来自步骤 2.2），涡旋振荡 8 秒。将样品在 56 °C 孵育 10 分钟，然后在微量离心机中以最高速度短暂离心 7 秒（>10,000 x g）。
- 向样品中加入 230 µl 100% 乙醇以沉淀 DNA，涡旋振荡 8 秒。在微量离心机中以最高速度短暂离心 7 秒（>10,000 x g）。
- 将 600 µl 样品混合物加入微型离心柱中，使 DNA 结合至柱上。在 6,000 x g 条件下离心 1 分钟。弃去穿流液，将离心柱放入新的干净离心管中。
- 向柱中加入 500 µl 洗涤缓冲液 1，洗涤 DNA。在 6,000 x g 条件下离心 1 分钟。弃去穿流液，将柱放入新的干净离心管中。向柱中加入 500 µl 洗涤缓冲液 2，在最高速度（>10,000 x g）下离心 3 分钟。将柱转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，再次以最高速度离心 1 分钟。
- 将离心柱放入新的 1.5 ml 微量离心管中，直接在滤膜上加入 60 µl 洗脱缓冲液，以洗脱 DNA。为防止交叉污染，不同样品间必须更换吸头。室温孵育 5 分钟，然后在 6,000 x g 条件下离心 1 分钟。再加入 60 µl 洗脱缓冲液，在 6,000 x g 条件下离心 1 分钟。
- 将 DNA 储存于 -20 ºC 以备后续使用，或立即进行亚硫酸氢盐转化。
3. 亚硫酸氢盐转化
注意：使用亚硫酸氢盐转化试剂盒进行亚硫酸氢盐转化，遵循生产商的方案并稍作修改。
- 为将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，向一个PCR管（单个0.2 ml PCR管或8联排PCR管）中步骤2.7所得的20 µl DNA中加入130 µl亚硫酸氢盐转化试剂。将剩余的40 µl DNA保存以备后续使用，或用于重复反应。通过上下吹打20次混匀，并短暂离心以确保管壁或管盖上无液滴残留。将反应体系置于水浴或PCR仪中孵育，程序如下：98 °C孵育8分钟，54 °C孵育60分钟，4 °C孵育5分钟。
- 继续进行步骤3.2，或将样品在4 °C保存最多20小时。
- 向离心柱中加入600 µl结合缓冲液，并将该柱放入所提供的收集管中。将经亚硫酸氢盐处理的DNA样品加入柱中，通过上下吹打10次混匀。在最大转速（>10,000 x g）下离心30秒，弃去穿流液。
- 向柱中加入100 µl洗涤缓冲液以洗涤DNA，在最大转速（>10,000 x g）下离心30秒。
- 为完成未甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的最终转化，向柱中加入200 µl脱磺酸化缓冲液以去除磺酸基团。室温静置20分钟，然后在最大转速（>10,000 x g）下离心30秒。
- 向柱中加入200 µl洗涤缓冲液，全速离心30秒。弃去穿流液，并重复此洗涤步骤一次。
- 将柱转移至一个1.5 ml微量离心管中。通过直接向柱膜加入10 µl洗脱缓冲液来洗脱DNA。孵育1分钟。在全速下离心30秒以洗脱DNA。使用分光光度法在A260处定量回收的DNA。
注意：分光光度法检测到的DNA主要为步骤2.3中添加的载体多聚A（polyA）DNA。通常，polyA的回收率≥输入量的85%（>4.25 µg）。 - 将DNA在-20 °C保存，直至准备进行数字PCR分析。
4. 多重数字PCR
- 配制主混合液，确保每份样本和对照组均有足够的溶液。至少应包含一个加水的样本（阴性对照）、一个含有未甲基化INS质粒的样本（1 pg，阳性对照）、一个含有甲基化INS质粒的样本（1 pg，阳性对照），以及一个等量混合两种质粒的样本。
- 配制PCR主混合液时，每反应加入12.5 µl PCR缓冲液（例如，10个样本共需125 µl），每反应加入1.25 µl引物/探针混合液（例如，10个样本共需12.5 µl），每反应加入8.25 µl水（例如，10个样本共需82.5 µl），每反应加入0.5 µl EcoR1酶（例如，10个样本共需5 µl）。
注：此处使用的引物和探针序列如下：上游引物：5'-GGAAATTGTAGTTTTAGTTTTTAGTTATTTGT-3'；下游引物：5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'；FAM探针：FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB；VIC探针：VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB。
- 配制PCR主混合液时，每反应加入12.5 µl PCR缓冲液（例如，10个样本共需125 µl），每反应加入1.25 µl引物/探针混合液（例如，10个样本共需12.5 µl），每反应加入8.25 µl水（例如，10个样本共需82.5 µl），每反应加入0.5 µl EcoR1酶（例如，10个样本共需5 µl）。
- 在96孔板中设置多重PCR反应。向每个孔中加入19.5 µl主混合液，再向相应孔中加入2.5 µl亚硫酸氢盐转化后的DNA样本（剩余7.5 µl亚硫酸氢盐转化DNA可保存或用于重复反应）。通过反复吹打数次混匀。
注：每行的8个孔必须全部加入样本或缓冲液对照。 - 使用封板机以铝箔密封，并在板式离心机中离心，直至孔壁无液体残留。
- 在触摸屏上设置自动液滴生成仪。
注：芯片上的所有8个孔必须包含样本或缓冲液对照。- 通过点击第4.2步中96孔板上已加载样本的行来设定所用行数，并将该行高亮为蓝色，表示为激活行。
- 为避免污染，按从后到前的顺序装载耗材。首先将芯片装入仪器的后部行，再将吸头装入仪器的中间行。
注：芯片只能以正确方向插入支架中。 - 将96孔板放入仪器中。从-20 °C冰箱中取出冷块，并将新的带裙边96孔板放入其中，然后将其放置在仪器内，紧邻已加载样本的96孔板。
- 向仪器前端的分配器中加入油，并在触摸屏上选择油的类型。
- 点击蓝色启动按钮开始运行。确认板设置后，点击“开始运行”按钮以启动程序。
- 运行完成后，取出含有新生成液滴的96孔板，并使用封板机以铝箔密封。
- 在热循环仪上进行PCR10扩增，程序如下：95 °C预变性10:00 min；40个循环：94 °C变性00:30 min，57.5 °C退火01:00 min；98 °C延伸10:00 min；12 °C保存10 min或最长24小时。
- 将板放入液滴读取仪中，并设置读取参数。
- 点击“设置”选项卡。通过点击模板 > 新建，创建一个新模板，并输入文件名。
- 使用孔板编辑器为每个样本设置参数。为每个样本命名，实验类型设为稀有事件检测（R-RED），主混合液选择第4.1步中使用的混合液。
- 为目标1命名（例如，未甲基化），并将目标1设为未知（U）；为目标2命名（例如，甲基化），并将目标2设为参考（R）。
- 点击“运行”选项卡以开始运行。在运行选项窗口中，选择检测化学类型（FAM/VIC）。
5. 数据分析
- 在分析标签页中打开结果，并基于阳性对照使用二维图进行分析（见图1）。
- 将液滴读取仪生成的CSV文件导出至电子表格程序以进行数据分析。
- 为计算血清中每微升的拷贝数"copies per µl"，使用公式：(浓度 × 250) / (用于DNA提取的血清体积，单位为 µl)。6
注意：从人血清获得的数据通常转换为log10值，以确保数据呈正态分布。或者，数据也可在log10刻度上作图，并采用非参数统计方法进行分析。
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结果
为了正确解读数据，我们在每次数字PCR实验中均使用质粒对照，分别对应未甲基化的和甲基化的靶标INS DNA。这些对照可确保甲基化和未甲基化DNA对应的信号能够被清晰区分。图1展示了含有经亚硫酸氢盐转化的未甲基化INS DNA质粒对照（图1A）、甲基化INS DNA质粒对照（图1B）以及两种质粒1:1混合物（图1C）的液滴二维散点图。含有未甲基化INS的质粒由对6-羧基荧光素（FAM）信号呈阳性的液滴指示，而含有甲基化INS的质粒则由对VIC信号呈阳性的液滴指示。在1:1质粒混合物中，可观察到一群双阳性液滴，对应于同时含有两种DNA分子的液滴。为了区分阳性液滴与阴性液滴，需利用这些二维图进行数据设门。请注意，在图1A中，FAM阳性液滴在VIC通道中出现轻微偏移，表明针对甲基化INS DNA的探针对未甲...
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讨论
DNA甲基转移酶介导的胞嘧啶甲基化可在多个基因中实现转录的表观遗传调控。人类INS基因几乎仅在胰岛β细胞中表达，且INS基因中胞嘧啶的甲基化频率与其转录沉默之间存在相关性11。因此，大多数细胞类型的INS基因在多个胞嘧啶位点的甲基化频率均显著高于β细胞11-13。已有研究提出，可通过检测血清中游离的未甲基化INS DNA水平来监测β细胞死亡的发生情况，因为这些未甲基化DNA主要来源于死亡β细胞所释放的DNA12。
亚硫酸氢盐反应将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变14。因此，对经亚硫酸氢盐转化的DNA进行测序或PCR分析，可确定原始胞嘧啶是否被甲基化。基于染料的甲基化特异性PCR技术利用引物与模板之间因3'端碱基错配导致的PCR扩增效率差异，从而在DNA经亚硫酸氢盐转化后区分未甲基化与甲基化的胞嘧啶15。因此，在早期针对1型糖尿病（T1D...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助项目 UC4 DK104166（资助对象：RGM）支持。我们谨此致谢印第安纳糖尿病研究中心转化核心的协助，该中心由美国国立卫生研究院资助项目 P30 DK097512 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 红色头盖真空采血管 | Beckon Dickinson | 366441 | 无添加剂，内壁未涂层，10 ml |
| 冻存管 | Simport | T310-3A | 聚丙烯材质，螺旋盖，任意规格 |
| QIAamp DNA Blood Mini 试剂盒 | Qiagen | 51106 | |
| 多聚腺苷酸 [Poly(A)] | Sigma | P9403 | 溶于 TE 缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA）至 5 µg/µl |
| 无水乙醇（200 证明度） | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| 含 CaCl2 和 MgCl2 的 DPBS | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8联管 | MidSci | AVST | |
| 8联管凸顶盖 | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA 甲基化-快速试剂盒 | Zymo | D5031 | |
| 探针用 ddPCR 超混合液（不含 dUTP） | Biorad | 1863024 | |
| 探针用缓冲对照 | Biorad | 1863052 | |
| 人非甲基化/甲基化引物/探针混合物 | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| 半裙边 96 孔 PCR 板，twin.tec 品牌 | Eppendorf | 951020346 | |
| 可穿刺铝箔热封膜 | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR 板封膜仪 | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG 微滴数字 PCR 系统 | Biorad | 1864101 | |
| 探针用自动微滴生成油 | Biorad | 186-4110 | |
| 自动微滴生成仪用 DG32 芯片 | Biorad | 186-4108 | |
| 自动微滴生成仪用移液器吸头 | Biorad | 186-4120 | |
| 自动微滴生成仪用移液器吸头盒 | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch 梯度 PCR 仪 | Biorad | 1851197 | |
| QX200 微滴读取仪 | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR 微滴读取仪用油 | Biorad | 186-3004 |
参考文献
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