高通量、实时、双读数检测细胞内抗菌活性与真核细胞毒性

摘要

开发了一种高通量、实时的检测方法，可同时实现：（1）筛选靶向胞内细菌病原体的真核细胞穿透性抗菌剂；（2）评估抗菌剂对真核细胞的细胞毒性。随后，该技术经过改进，并结合数字分配技术，从而能够便捷地开展高分辨率的剂量-反应以及二维和三维协同作用研究。

摘要

传统的细胞内抗菌活性和真核细胞毒性的检测方法依赖于终点检测。这类终点检测在读数前需要多个额外的实验步骤，例如细胞裂解、菌落形成单位测定或试剂添加。在进行数千次检测时（例如高通量筛选过程中），此类检测所需的后续工作量相当可观。因此，为了促进高通量抗菌药物的发现，我们开发了一种实时检测方法，可同时识别抑制细胞内细菌生长的化合物并评估真核细胞的细胞毒性。具体而言，通过使用携带细菌lux操纵子（1^st 生成实验）或荧光蛋白报告基因（2^nd 生成，正交检测）。在巨噬细胞初始感染期间，还加入了一种无毒且不能穿透细胞膜的核酸结合染料。该染料无法进入活细胞，但死亡宿主细胞因细胞膜完整性丧失，染料得以进入并荧光标记细胞核DNA（脱氧核糖核酸）。值得注意的是，该染料与DNA结合后荧光量子产率显著增强，从而提供一种基于溶液的宿主细胞死亡读出方法。我们已利用该联合检测方法在微孔板中进行高通量筛选，并通过显微镜评估胞内增殖和细胞毒性。值得注意的是，抗菌药物可能表现出协同作用，即两种或多种抗菌药物联合使用时的效果大于各自单独使用时的效果之和。联合用药检测 体外 针对细胞内病原体的协同作用研究通常是一项艰巨的任务，因为必须评估不同浓度抗生素组合的各种可能性。然而，我们发现，将实时检测方法与自动化数字分配技术相结合，可实现便捷的协同作用测试。利用这些方法，我们能够系统地研究大量抗菌药物单独使用及联合使用时对细胞内病原体的作用效果。 嗜肺军团菌

引言

在细胞内区室中生长或暂时寄居的病原体难以通过治疗手段彻底清除。嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）、布鲁菌属（Brucella spp.）、土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）以及分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）等专性或相对专性的胞内病原体，通常需要长期使用抗菌药物治疗，疗程可能从数月到数年不等。此外，某些胞外病原体也可能短暂占据细胞内生态位，借此逃逸常规抗菌治疗的清除作用，并在后期重新出现，引发新一轮的致病性感染。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus¹）和尿路致病性肠杆菌科细菌（uropathogenic Enterobacteriaceae）^2,3 感染便是近年来日益受到关注的两个实例。因此，药物研发的一个基本目标是发现能够穿透进入细胞内区室的新型抗菌药物。尤其理想的是，开发出能够快速彻底清除胞内病原体、并防止因亚抑制浓度抗菌药物暴露而导致耐药性产生的优化治疗方案。

为此，我们开发了一种高通量筛选技术，用于鉴定可穿透细胞并靶向模式病原体胞内生长的抗菌剂 嗜肺军团菌.⁴ 既往临床观察表明，常规抗菌药物敏感性试验未能准确预测

方案

1. 实时细胞内生长及真核细胞毒性检测

1. 准备宿主细胞（J774A.1 细胞）
   1. 培养 J774A.1 Mus musculus 悬浮于含9%补铁小牛血清的RPMI 1640中的巨噬细胞样细胞。最初在组织培养瓶中传代。当细胞在75 cm²培养瓶中达到汇合后² 组织培养瓶中加入15 ml培养基，通过刮取并稀释至65 ml同种培养基进行传代，其中15 ml重新加入组织培养瓶，50 ml转移至250 ml细菌摇瓶。
   2. 扩大培养时，将细胞悬浮培养于250 ml和/或1,000 ml的细菌培养瓶中，培养瓶中组织培养基的体积填充至其总容量的五分之一。通过将转速设定为约120转/分钟进行通气。为保证稳定的生长状态，于精确5% CO₂条件下培养₂ 和 37 °C.
   3. 当细胞密度达到 2.5 x 10 的范围时收获细胞⁶ 细胞/ml 至 5 × 10⁶ 细胞/ml。确保死细胞比例（最简便的方法是通过台盼蓝染色检测）不超过25%，因为死细胞会增加细胞毒性检测中的背景噪音。
   4. 白色，组织培养处理的384孔微孔板，5 × 10⁴ J774A.1 细胞在 30 µl 每孔加入组织培养基。将微孔板孵育过夜，使实验当天细胞融合度达到90%。
2. 制备发光或荧光标记物 Legion....

结果

微孔板细胞内生长检测

图1 示意图显示了检测步骤。所示的自动化步骤也可手动完成，但使用液体处理系统可显著提高通量。

图2 显示使用384孔微孔板、双读数、实时检测细胞内生长及真核细胞毒性的代表性结果 军团菌 菌株（Lp02）标记有lux操纵子（图2A, 2B）或 mNeptune2 荧光蛋白（图 2C, 二维报告基因。通过使用针式转移机器人将阳性与阴性对照化合物（DMSO、抗生素、皂苷）加入孔板，以模拟在高通量筛选条件下的实验表现。显著 军团菌 生长（图2A, <.......

讨论

我们描述了用于同时检测细胞内细菌生长和宿主细胞毒性的实时检测方法。该实验方案包含若干关键步骤。首先，为了确保检测的稳健性，细菌信号与细胞毒性读数之间必须具有足够的光谱分离度。对于荧光素酶操纵子报告系统与荧光DNA结合染料的组合而言，这种分离度是其固有特性。然而，根据我们的经验（表1-3，图2），若采用双荧光读数方式，则需要荧光信号互不重叠（例如，使用远红光荧光蛋白报告系统与绿色核酸染料），才能获得稳健的基于溶液的检测数据。此外，基于以往经验，可能与检测仪器的光学配置或溶液中荧光特性有关，只有发射绿光或橙光的DNA染料才能提供可用的细胞毒性数据，即 Z'值大于>0.5，该数值是检测性能良好的指标。⁴ 因此，基于溶液的双读数检测方法在可用的报告系统选择上存在一定限制。

另一个关键步骤是感染细菌与巨噬细胞的比例。细菌感染会诱导宿主细胞死亡。因此，过高的接种量可能导致宿主细胞过早死亡、细菌复制水平相对较低，并可能掩盖所研究抗菌药物的直接细胞毒性效应。合适的感.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
J774A.1 细胞	American Type Culture Collection	TIB-67	宿主细胞
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
超滤酵母提取物	Becton-Dickinson/Difco	210929	用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基；较低等级可能导致军团菌生长受抑和/或对生长抑制剂的敏感性改变
α-酮戊二酸单钾盐	Sigma-Aldrich	K2000	用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P5280	用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
磷酸氢二钾	Thermo Fisher Scientific	P288-500	用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C-7755	用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
柠檬酸铁铵	Sigma-Aldrich	F5879	用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基；可使用焦磷酸铁替代，但称量更难准确
浓氢氧化钾溶液	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
去离子水	N/A	N/A	用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
胸苷（组织培养级）	Sigma-Aldrich	T1895	用于补充 RPMI 1640 培养基及缓冲酵母提取物琼脂/培养基 — 后者可使用较低等级胸苷，但在 RPMI 1640 中可能导致细胞生长受抑和/或细胞死亡
RPMI 1640，标准配方	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	用于铺板前培养 J774A.1 细胞；含 2 mM L-谷氨酰胺
不含酚红的 RPMI 1640	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	用于在 384 孔板中铺种 J774A.1 细胞（不适用于铺板前的细胞生长）；也不含 L-谷氨酰胺 — 使用前需补充至 2 mM
L-谷氨酰胺，200 mM 溶于 0.85% NaCl（组织培养级）	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	用于将不含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 补充至终浓度 2 mM
铁补充小牛血清	Gemini Bioproducts	100-510	用于将 RPMI 1640 补充至终浓度 9.1%
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154	用于在计数细胞密度时染色以确定 J774A.1 细胞死亡情况
SYTOX Green，5 mM DMSO 溶液	Thermo Fisher Scientific	S7020	用于通过荧光读数或落射荧光显微镜检测 J774A.1 细胞死亡（需与橙红色或远红荧光细菌联用）。终浓度使用 125 nM。
细胞培养孵箱	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	用于 J774A.1 细胞的孵育（感染前后均可）；也可用于细菌孵育，或改用普通大气孵箱
轨道摇床	BellCo Glass	7744-01010	用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养；可放入细胞培养孵箱内；包含摇床底座 7744-01000 和托盘 7740-01010（也可单独购买）
摇瓶（250 ml）	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养
摇瓶夹具（250 ml）	BellCo Glass	7744-16250	用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养
摇瓶（1,000 ml）	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养
摇瓶夹具（1,000 ml）	BellCo Glass	7744-16100	用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养
摇瓶海绵泡沫盖（250 ml–1,000 ml）	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养；相比标准金属盖可降低污染风险
MultiDrop Combi 可编程多通道蠕动泵	Thermo Fisher Scientific	5840300	用于向大量 384 孔板中分配 J774A.1 细胞、培养基及含荧光染料的细菌悬液
Combi 标准孔径分配头	Thermo Fisher Scientific	24072670	默认预分配体积 20 μl 不足以补偿液体沉降 — 应增加至 80 μl
白色 384 孔组织培养处理板	Corning	3570	用于检测发光和荧光；Greiner 目录号 #781080 也已验证可用
DMSO（组织培养级，密封安瓿装）	Sigma-Aldrich	D2650	用于溶解阳性对照和待测化合物
阿奇霉素	Sigma-Aldrich	PHR1088	抗生素阳性对照
皂苷（来自皂荚树皮）	Sigma-Aldrich	S-4521	细胞毒性阳性对照
多通道移液器	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	用于转移固定量的阳性对照化合物；移液器必须具备带定位档的数字分配功能，以实现重复固定体积分配
Epson 点转移机器人	Epson/ICCB-L	(定制设备)	用于从文库阵列中转移固定量的待测化合物
D300 数字分配系统	Hewlett-Packard via Tecan	D300	用于转移可变量的待测化合物，范围从 11 皮升至 10 µl
D300 数字分配系统的 T8+ 耗材	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	用于分配待测化合物
配备计算机连接数码相机的落射荧光显微镜	Nikon	Ti	用于活细胞成像；任何标准荧光显微镜均可替代，需具备相差或微分干涉（DIC）光学系统，能够检测绿色（荧光素）、橙红色至红色（Texas Red）以及远红（Cy5）荧光，并配备 100X 油镜以实现最高分辨率
玻璃底组织培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	用于活细胞成像。MatTek 等品牌的培养皿可通过倒置落射荧光或共聚焦显微镜实现 600X 或 1,000X 放大倍数下的显微观察。  此类培养皿标称直径为 3.5 cm，内径 3.3 cm，底部嵌入直径 20 mm、厚度为 #1.5 的盖玻片。
Photoshop CS6	Adobe		可使用 Adobe Photoshop 或类似软件对明场显微图像和荧光图像进行伪彩着色与合并。
Mathematica 10	Wolfram		用于生成二维等高线等效图和三维曲面等效图。