高通量，实时，细胞内的抗菌活性的双读出测试和真核细胞的细胞毒性

摘要

开发了一种高通量实时测定法，以同时识别 （1） 靶向细胞内细菌病原体的真核细胞渗透性抗菌剂，以及 （2） 评估真核细胞细胞毒性。此后，同一技术的变体与数字分配技术相结合，以实现简单、高分辨率、剂量反应以及二维和三维协同研究。

摘要

细胞内的抗菌活性和真核细胞的细胞毒作用的传统措施，依靠端点检测。这样的端点检测要求，如细胞裂解，菌落形成单位的确定，或试剂除了读出之前一些额外的实验步骤。时，例如，在高通量筛选执行数以千计测定的，对于这些类型的测定所需要的下游努力是相当大的。因此，为了便于高通量抗菌发现，我们开发了实时测定以同时识别的细胞内细菌生长抑制剂和评估的真核细胞的细胞毒性。具体地讲，实时的细胞内细菌生长的检测用标记与任一细菌勒克斯操纵子（ ^第一代测定法）或荧光蛋白记者（ ^第二代，正交测定）细菌筛选菌株已启用。无毒的，细胞膜非透性，核酸结合染料巨噬细胞的最初感染过程中也被加入。这些染料被排除在活细胞。然而，非存活的宿主细胞失去膜完整性允许进入和核DNA的荧光标记（脱氧核糖核酸）。值得注意的是，DNA结合与荧光量子产率，提供了宿主细胞死亡的基于溶液的读出一个大的增加有关。我们已经使用该组合测定法来执行在微孔板格式的高通量筛选，并通过显微镜来评估细胞内的生长和细胞毒性。值得注意的是，抗微生物剂可显示协同作用，其中当一起施用两种或更多种抗微生物剂的组合效果是，当分别施加大于。测试体外抗细胞内病原体的协同作用，通常是一个很大的任务，因为在不同浓度的抗生素的组合排列必须评估。然而，我们发现，我们的实时检测与自动化，数字化配送技术相结合permitted轻便协同测试。使用这些方法，我们能够系统地调查了大量抗菌药物单独的行动，并结合对细胞内病原体， 嗜肺军团菌。

引言

在车厢内临时增加或居住病原体很难根除治疗。预留或相对专性细胞内的病原体，如嗜肺军团菌 ， 立克次体 ， 布鲁氏菌。 ，土拉弗朗西斯菌 ， 结核分枝杆菌。往往需要长时间抗菌治疗疗程治愈，可能范围从个月甚至数年。此外，细胞外的病原体可能暂时占据利基内并以这种方式通过抗生素治疗一般疗程逃脱通关，后来冒出来启动毒感染的新一轮。 金黄色葡萄球菌和¹肠杆菌科细菌尿路感染^2,3两日益认识到的例子。因此，从根本上药物发现的目标是，以确定渗透到细胞内的区室新颖抗微生物剂。最佳治疗迅速消灭胞内生物体和防止通过亚抑制抗微生物暴露性的发展是特别理想的。

为此，我们开发了一种高通量筛选技术来识别细胞内渗透剂抗菌药物靶向模型病原体， 嗜肺军团菌的细胞内生长。 ⁴既往临床观察表明，标准的药敏试验并没有准确地对这种微生物体内的治疗功效预测。 ⁵具体地，这是因为主要类别抗微生物剂，如β内酰胺类和氨基糖苷类的，虽然针对无菌生长军团菌非常有效，没有充分渗透到其中， 军团驻留的胞内区室。 ^5,6后来的证据表明，在技术上更复杂的细胞生长测定有效预测临床疗效。 ⁷

方案

1.实时细胞内生长和真核细胞毒性测定

1. 准备宿主细胞（J774A.1细胞）
   1. 培养J774A.1 小家鼠巨噬细胞样细胞悬浮在RPMI 1640用9％铁补充的牛血清。最初通道在组织培养瓶中。细胞在15ml培养基中已经成为一个75cm ²的组织培养瓶中铺满后，通过刮擦和稀释分裂到65毫升的相同类型的介质中，其中15毫升返回到组织培养瓶和50毫升转移到250毫升细菌摇瓶中。
   2. 对于规模化，文化悬浮于250毫升和/或填充到五分之一体积组织培养基千毫升细菌的烧瓶。通过以大约每分钟120转设定转速通气。对于持续增长，孵化正好5％的CO ₂和37℃。
   3. 当他们在范围达到密度收获细胞2.5×10 ^6个细胞/ ml至5×10 ^6个细胞/ ml。确保死细胞百分比（通过台盼蓝染色最容易测定）不超过25％，如死细胞会在细胞毒性测定增加的背景噪声。
   4. 板在白色，组织培养处理过的，384孔微孔板在30微升组织培养基中5×10 ⁴ J774A.1细胞每孔。孵育微孔板过夜，以实现对实验的每天90％汇合。
2. 准备发光或荧光嗜肺军团菌
   1. 通过嗜肺军团菌 （LP02 :: flaA基因::勒克斯^8）适宜的培养基上的细菌， 也就是缓冲木炭酵母....

结果

微孔板细胞生长试验

图1图中的检测步骤。示出的自动化的步骤可以手动完成。然而，可以通过使用液体处理系统大大地促进。

图2示出了从384孔微孔板，双读出，实时的细胞内生长，并用军团菌菌株（LP02）标有任一个勒克斯操纵子（ 图2A，2B）或mNeptune2荧光蛋白（真核细胞的细胞毒性测定法的代表性结果图2C，2D）记者。阳性和阴性对照化合物（DMSO，抗生素，皂素）通过使用销搬运机器人的加入到板中的高通量筛选的设置，以模拟性能。显著军团 青霉>生长（ 图2A.......

讨论

我们描述了细胞内的细菌的生长和宿主细胞的细胞毒作用的同时检测的实时检测。有在协议中的几个关键步骤。首先，对于健壮测定性能，必须有细菌和细胞毒性读数之间有足够的光谱分离。这样的分离是本征为萤光素酶操纵子记者和荧光DNA结合染料的组合。然而，根据我们的经验（ 表1-3， 图2），使用双荧光读出要求的不重叠的荧光信号（ 例如 ，利用一个远红色荧光蛋白报告和绿色核酸染色的），以获得健壮，基于溶液的数据。此外，以往的经验，这可能涉及到读者提供光学或解决方案荧光性质，只能用绿色或橙色发射DNA污渍可用了数据的细胞毒性， 也就是说 ，Z'大于> 0.5，表示斯特龙措施摹检测性能。 ⁴因此，基于解决方案的，双读出试验是有点在什么可以用来记者条款的约束。

另一个关键步骤是感染细菌的巨噬细胞的比率。细菌感染诱导宿主细胞死亡。因此，过高的接种物可能导致早期宿主细胞死亡，相对低水平细菌复制的，并且在研究抗微生物剂直接细胞毒性效应的潜力模糊处理。适当的感染比率可以凭经验.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
J774A.1 细胞	美国型培养物保藏中心	TIB-67	宿主细胞
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	用于制备缓冲木炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
酵母提取物，超滤	Becton-Dickinson/Difco	210929	用于制备缓冲木炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基;较低等级可能导致军团菌生长受损和/或改变军团菌对生长抑制剂的敏感性
α-酮戊二酸、单钾盐	Sigma-Aldrich	K2000	用于制备缓冲木炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P5280	用于制备缓冲木炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
钾，氢	Thermo Fisher Scientific	P288-500	用于制备缓冲木炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C-7755	用于制备缓冲木炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
柠檬酸铵铁 （III）	Sigma-Aldrich	F5879	用于制备缓冲木炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基;可以使用焦磷酸铁代替，但更难准确称量
氢氧化钾溶液，浓缩	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	用于制备缓冲木炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
脱氨水	N/A	N/A	用于制备缓冲木炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基
胸苷（组织培养级）	Sigma-Aldrich	T1895	用于补充 RPMI 1640 和缓冲酵母提取物琼脂/培养基 — 较低级别的胸苷可用于后者，但可能导致 RPMI 1640
RPMI 1640 标准配方	康宁通过赛默飞世尔科技	10-040-CV	用于在铺板前培养 J774A.1 细胞;包括 2 mM L-谷氨酰胺
不含酚红的 RPMI 1640	康宁，通过赛默飞世尔科技	17-105-CV	用于在 384 孔培养皿中接种 J774A.1 细胞（不适合铺板前生长）;使用前也缺少 L-谷氨酰胺和 mdash; 补充 2 mM，200
mM 溶于 0.85% NaCl（组织培养级）HyClone	通过赛默飞世尔科技	SH30034.02	用于补充缺乏 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640， 终浓度至 2 mM
铁小牛血清	Gemini 生物制品	100-510	用于补充 RPMI 1640，终浓度高达 9.1%
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154	用于在细胞密度计数时对 J774A.1 细胞死亡测定进行染色
SYTOX Green，5 mM 溶于 DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	中用于通过荧光读数或落射荧光显微镜（与橙红色或远红荧光细菌结合）测定 J774A.1 细胞死亡的染色。在 125 nM 终浓度下使用。
细胞培养箱	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	用于 J774A.1 细胞的培养（感染前后）;也可用于细菌的培养，或可以使用标准气氛培养箱代替）
轨道摇床	BellCo Glass	7744-01010	用于感染前振荡孵育 J774A.1 细胞;适合放入细胞培养箱内;包括摇床底座 7744-01000 和托盘 7740-01010（也可单独购买）
床培养瓶 （250 ml）	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	用于感染前 J774A.1 细胞的振荡孵育
培养瓶摇床夹具 （250 ml）	BellCo 玻璃	7744-16250	用于感染前 J774A.1 细胞的振荡孵育
摇床培养瓶 （1,000 ml）	ChemGlass 生命科学	CLS-2038-07	用于感染前 J774A.1 细胞的振荡孵育
培养瓶摇床夹具 （1,000 ml）BellCo	Glass	7744-16100	用于感染前 J774A.1 细胞的振荡孵育
培养瓶的海绵泡沫盖 （250 ml-1,000 ml）	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	用于感染前振荡孵育 J774A.1 细胞;相对于标准金属盖，降低污染风险
MultiDrop Combi 可编程多通道蠕动泵	Thermo Fisher Scientific	5840300	用于将 J774A.1 细胞、培养基和含有荧光基团的细菌悬浮液分配到大量 384 孔培养皿
Combi 标准孔歧管	Thermo Fisher Scientific	24072670	默认预分配体积为 20 μl 不足以补偿 stailing —增加到 80 μl
白色 384 孔培养皿，用于组织培养	Corning	3570	用于读取发光和荧光;Greiner 目录 # 781080 也成功测试了
DMSO（组织培养级，在密封安瓿瓶中）	Sigma-Aldrich	D2650	用于溶解阳性对照和测试化合物
阿奇霉素	Sigma-Aldrich	PHR1088	抗生素阳性对照
皂苷（来自皂树皮）	Sigma-Aldrich	S-4521	细胞毒性 阳性对照
多通道移液器	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	用于转移固定量的阳性对照化合物;移液器必须具有带棘爪的数字分液装置，以实现重复的固定体积分液
Epson 针式移液机器人	Epson/ICCB-L	（定制设备）	用于从文库阵列中转移固定量的测试化合物
D300 数字分液系统	Hewlett-Packard 通过 Tecan	D300	用于转移从 11 皮升到 10 微升的可变量测试化合物;l
T8+ 卡式胶筒，用于 D300 数字加样系统	惠普，通过 Tecan	T8+	用于加样测试化合物
落射荧光显微镜，带计算机连接的数码相机	Nikon	Ti	用于活细胞成像;任何标准荧光显微镜都可以用相差或 DIC 光学元件替代，能够用 100X 油成像绿色（荧光素）、橙红色到红色（德克萨斯红）和远红 （Cy5） 荧光最高分辨率的物镜
玻璃底组织培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	用于活细胞成像。MatTek 等培养皿允许通过使用倒置落射荧光或共聚焦显微镜以 600 倍或 1,000 倍的放大倍率进行显微镜观察。这些特定的培养皿的标称直径为 3.5 厘米，内径为 3.3 厘米，底部插入直径为 20 毫米的 #1.5 厚度的盖玻片。
Photoshop CS6	Adobe		Adobe Photoshop 或类似程序可用于伪彩色和合并浅色、微观和荧光图像。
Mathematica 10	Wolfam		用于生成二维等值线和三维表面等值线。