方法文章

松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 交配行为的观察与量化

9.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54842

⸱

2016年12月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Forest Protection, Zhejiang Agricultural & Forestry University, 2Institute of Forest Zoology and Forest Conservation, Georg-August University Göttingen, 3College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, 4Institute of Forest Protection, Chinese Academy of Forestry, 5Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种研究松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）交配行为的实验方案。描述了B. xylophilus在交配过程中的行为特征。

摘要

在体视显微镜下建立了一种观察和量化松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）交配行为的方法。为了提高B. xylophilus的交配效率并增加观察到交配行为的概率，实验中培养并使用了未交配的成虫。通过将线虫置于水中，让雌虫产卵10分钟，从而获得卵。将卵在25 °C黑暗条件下培养24小时，以获得同步化的二龄幼虫（J2）；再将J2与灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）共同培养52小时，获得早期四龄幼虫（J4）。在此阶段，大多数J4线虫可根据其生殖结构的形态清晰区分性别。将雄性和雌性J4分别收集，并在两个不同的培养皿中单独培养24小时，以获得未交配的成虫。将一只未交配雄虫与一只未交配雌虫配对置于凹玻片小室中的水滴内，在体视显微镜下用摄像机记录其交配行为。整个交配过程持续时间为82.8 ± 3.91分钟（均值±标准误），可分为四个不同阶段：寻找、接触、交配和逗留，各阶段平均持续时间分别为21.8 ± 2.0分钟、28.0 ± 1.9分钟、25.8 ± 0.7分钟和7.2 ± 0.5分钟。实验中描述了11种亚行为：巡航、接近、相遇、触碰、环抱、定位、附着、射精、分离、静止和游走。有趣的是，当一只雌虫与三只雄虫或一只雄虫与三只雌虫组合时，观察到了明显的同性竞争现象。该实验方案不仅对研究B. xylophilus的交配行为具有重要价值，也可为其他线虫的行为学研究提供参考。

引言

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus (Steiner 和 Buhrer) Nickle）是最具破坏性的入侵物种之一，可导致松树萎蔫并最终死亡。这种致病性线虫原产于美国，但已被传播至包括中国、日本、韩国和葡萄牙在内的多个国家。最近，在西班牙也发现了该线虫，已导致数百万棵松树死亡，造成巨大的经济损失，并威胁到森林生产和生态系统的稳定性1-5。

一旦松树寄主被松材线虫感染，其树干内会迅速繁殖出数以十亿计的子代。这会导致木质部功能障碍，进而引起寄主树木萎蔫，最终导致其死亡6。然而，目前尚无有效控制该病害的方法。交配行为可能在该线虫高繁殖力中起重要作用7。因此，我们在实验室中研究了B. xylophilus的交配行为，试图寻找干扰其交配并降低其繁殖力的有效方法。

本方案旨在介绍获取松材线虫（B. xylophilus）未交配成虫以及利用录像机和体视显微镜观察与分析其交配行为的详细方法。该方案也可作为其他线虫行为学研究的参考。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 获取未交配的成年线虫

  1. 松材线虫分离与培养条件
    注意： B. xylophilus 分离 Nxy61 最初从病变组织中提取 马尾松 中国浙江省宁波市地区
    1. 制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，参见 材料表用于培养的平板 灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）
    2. 接种时，用直径为10 mm的打孔器从真菌菌膜上取一块菌片 灰葡萄孢菌（B. cinerea） 将 mat 放置在新的 PDA 平板中央进行培养 B. cinerea 在25 °C避光条件下培养5天。
    3. 在已准备好的培养皿中培养松材线虫 灰葡萄孢菌（B. cinerea） 在25 °C避光条件下。
  2. 获取 B. xylophilus 卵
    1. 将夹住的橡胶管置于漏斗下方，并将准备好的漏斗固定在支架上，组装成贝尔曼漏斗装置。在漏斗口处放置两层滤纸以替代纱布。
    2. 将真菌培养物转移至漏斗装置中，加水直至真菌菌膜完全浸没。静置2小时，线虫将从真菌培养物中逸出，穿过滤纸，最终沉降至贝尔曼漏斗的最底部。
    3. 从管底收集最初几滴水至15 mL 离心管中，并通过缓慢松开管夹收集线虫。
    4. 将上述收集物在室温下以 3,000 x g 离心 2 分钟。
    5. 用移液器去除上层水相，并用1 mL无菌双蒸水（dd）重新悬浮 H2O.
    6. 使用移液器将上述重悬液转移至新的玻璃培养皿（6 厘米直径）。加入3 mL无菌dd H2加入适量的 O 型溶液至培养皿，以确保线虫能够自由游动。
    7. 将线虫置于玻璃培养皿中，在25 °C避光条件下孵育10分钟。怀孕雌虫将产卵。由于卵具有糖蛋白表面，会黏附在玻璃培养皿底部。
    8. 小心移除水和成虫，避免扰动虫卵。加入 3 mL 无菌 dd H₂O。2立即将 O 转移至玻璃培养皿中，以防止卵干燥。
    9. 重复步骤 1.2.8 三次，以去除所有幼虫和成虫，获得纯化的卵。额外加入 2 mL（总共 5 mL）无菌 dd H2O 至培养皿。
  3. 第四阶段幼虫（J4期幼虫）的获取
    1. 将收集的卵在25 °C避光条件下孵化24小时，以获得J2幼虫。
    2. 用移液器将J2幼虫转移至15 毫升离心管，离心机 在3,000 × g离心2分钟，去除上层水相。
    3. 用 200 µL 无菌 dd H₂O 重悬 J2 期幼虫2O，然后将它们转移到含有PDA的培养皿中 灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）.
    4. 在25 °C避光条件下培养J2幼虫52小时。此时，大多数J2幼虫将已发育至J4幼虫的早期阶段。
  4. 获取无交配成年线虫
    1. 使用酒精灯加热玻璃毛细管后拉制针尖，制备用于挑取线虫的毛细针。
      注意：该毛细玻璃针的尖端直径通常需要为50 µm，约等于成年线虫的体宽，以便用作挑取单个线虫的工具。
    2. 组装贝尔曼漏斗，按照步骤1.2.1–1.2.3所述，从真菌培养物中提取线虫2小时。
    3. 将J4加水转移至干净的培养皿中。
    4. 在体视显微镜下观察线虫，并根据Mamiya和Kiyohara所述的生殖器形态区分雄性和雌性8 (图1用制备好的毛细玻璃针挑取所需性别的线虫，转移至适用于雄性或雌性的真菌培养平板中。
      注意：雌性数量多于雄性，雌性所占比例为60%–70%。雌性阴门与雄性交合刺在形态上明显不同。与成虫相比，早期J4阶段的交合刺或阴门较小，但仍可清晰观察并加以区分。线虫在水中始终处于运动状态，有时会增加雌雄鉴别的难度。
    5. 将J4期幼虫在25 °C避光条件下继续培养24小时。
      注意：所有线虫都应发育为成虫，但由于未交配，被视为处女成虫。
    6. 组装两个贝尔曼漏斗，按照步骤1.2.1–1.2.3所述方法从真菌培养物中提取未交配成虫2小时，然后将未交配的成虫雄性和雌性分别转移至两个独立的洁净培养皿中。

2. 交配行为的观察与视频记录

  1. 准备多个凹面载玻片，并向每个凹面载玻片的孔中加入 200 µL 无菌 dd H2O。
  2. 用毛细玻璃针挑取已准备好的未交配成年雄虫或雌虫，将仅一条线虫放入每个凹面载玻片的水中。
  3. 将未交配成虫保留在孔内 1 小时，使其适应新的水生环境。
  4. 使用移液器将其中一条虫从一个孔转移至另一孔，使一条未交配雄虫与一条未交配雌虫配对。
  5. 在体视显微镜下观察凹面载玻片中 1♀ + 1♂ 组合的交配行为。
  6. 为分析未交配成虫的交配效率，计算其交配成功率（R），并与随机选择的成虫配对的交配成功率进行比较。R 的计算方法为：观察到交配行为的重复实验次数占总研究重复实验次数的百分比。
  7. 为研究交配选择与同性竞争，将未交配线虫分为两种不同组合进行分组观察：1♀ + 3♂ 和 3♀ + 1♂。
  8. 为获取定性与定量分析数据，使用视频显微技术记录交配行为。通常情况下，整个交配过程从线虫被放入凹面载玻片孔中开始，至交配结束后离开为止，在 2 小时内完成。因此，每组至少连续记录 2 小时作为一个重复实验。每种组合总共至少完成 30 个重复实验。
    注意：为补偿记录过程中水分蒸发，每隔 0.5 小时向孔中补充更多无菌 dd H2O（通常为 50 µL）。

3. 数据采集

  1. 在电脑屏幕上仔细观看所有视频，并对子行为进行定性表征。
  2. 使用录像机的逐帧功能测量交配持续时间。手动将结束时间减去起始时间。
  3. 对于1♀ + 1♂组合，分析每段视频记录并测量以下事件的持续时间：
    1. 测量搜寻持续时间（即， 从将雌雄个体引入凹面载玻片的孔中到它们彼此相遇并接触的时间。
    2. 测量接触持续时间（即从首次接触到雄性首次精确位于雌性阴门处准备交配的时间。
    3. 测量交配持续时间（即，即雄性个体精确地位于雌性阴门处开始，至射精后从雌体滑下为止的时间）。注意：某些线虫在2小时内可交配多次。在此类情况下，交配持续时间应从第一次交配开始计算，直至最后一次交配结束，包括中间间隔时间。
    4. 测量滞留持续时间（即交配后时期，即从交配结束到雄虫与雌虫游开并相隔距离超过线虫体长（通常为1毫米）的阶段。
  4. 统计每种不同组合在2小时内交配的频率、每次交配的持续时间以及所有交配的平均持续时间即， 1♀ + 1♂、3♀ + 1♂ 和 1♀ + 3♂
  5. 计算不同组合在首次接触时的交配成功率（P），即在首次接触后立即且无间断进行交配的成功率。在接触阶段，实际交配前可能观察到多次接触。
    1. 当两个个体之间的距离超过其体长时，视为一次接触结束。对于一次重复实验，若在首次接触后立即观察到交配行为且中间无间断，则记录P为100%；若未观察到交配行为，或交配发生在两次及以上接触之后，则记录P为0.00%。
      注意：此处所述的每种组合均有30个重复。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

未交配成虫的交配成功率（R）平均为86.67%，显著高于随机选取成虫的交配成功率：13.33 ± 4.65%（F = 1301.71，df = 1，P = 0.0001）（图 2）。该结果表明，使用未交配成虫比使用随机选取成虫更易于观察到松材线虫（B. xylophilus）的交配行为。

当一只雄性与一只雌性配对时，整个交配过程平均持续82.8分钟。该过程可分为四个不同阶段：寻找、接触、交配和停留，各阶段持续时间分别为21.8 ± 2.0分钟、28.0 ± 1.9分钟、25.8 ± 0.7分钟和7.2 ± 0.5分钟（图 3）。在最近的一项发表中，我们描述了11种亚行为，分别为巡游、接近、相遇、触碰、环抱、定位、附着、射精、分离、静息和漫游9。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

行为学实验是化学生态学、神经生物学、分子生物学和遗传学的基本组成部分。线虫，尤其是 秀丽隐杆线虫，广泛用于这些领域的研究。交配行为的 秀丽隐杆线虫 此前已对此进行过研究10-11。然而， B. xylophilus 为雌雄异体，不同于雌雄同体 秀丽隐杆线虫，其交配过程具有不同的行为特征9。最近，交配行为的研究 Bursaphelenchus okinawaensis，一种雌雄同体的姊妹物种 B. xylophilus, 被报道12尽管采用了不同的实验方法，这种雌雄同体物种对性别的吸引表现出相似性 B. xylophilus, 并观察到它们之间的种间相互吸引。这种雌雄同体的姊妹物种可作为研究其生物学特性的模型，用于进一步探索 松材线虫属

本方案提供了观察和研究松材线虫（B. xylophilus）交配过程中行为特征的指导。我们的研究结果表明，...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Najie Zhu 和 Liqun Bai 对本工作贡献相同。本工作受到公益性行业（林业）科研专项经费（201204501）和国家自然科学基金（31170604、31270688 和 31570638）的资助。感谢 Holighaus Gerrit 博士和 Danielle Hickford 博士在英文写作方面提供的有益建议。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B. xylophilus 分离株 Nxy61从中国宁波地区的Pinus massoniana中提取
灰霉菌株购自中国林业科学研究院
贝尔曼漏斗Sengong
离心管（falcon tube）Sengong
离心机Sengong
移液器Sengong
无菌 dd H2O经121 °C 高压蒸汽灭菌30分钟
培养皿Sengong
PDA培养基Huankai Bio.021050
培养箱Sengong
超净工作台Sengong
玻璃毛细管Sengong
体视显微镜LeicaLED5000 RL
倒置体视显微镜ZeissA1
凹面载玻片Sengong

参考文献

  1. Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
  2. Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47(1982).
  3. Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
  4. Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
  5. Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
  6. Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
  7. Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
  8. Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
  9. Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
  10. Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
  11. Barr, M. M., Garcia, L. R. Male mating behaviour. The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).
  12. Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章