本文介绍了一种敲除参与质粒接合的靶基因并利用接合实验分析其缺失影响的实验方案。通过缺失突变或点突变，进一步将该基因的功能定位至其序列的特定区域。
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本文内容
摘要
摘要
通过细菌接合转移遗传物质是一种通过特定转移蛋白形成的复合物介导的过程。在大肠杆菌（Escherichia coli）中，这些转移蛋白构成了一种被称为接合对形成或DNA转移复合物的DNA转移装置，可促进接合性质粒的转移。本文的目的是提供一种方法，通过一系列缺失突变和/或点突变结合接合实验，来确定特定接合转移蛋白的功能。目标基因首先在接合性质粒上被敲除，然后通过携带该目标基因的小型恢复性质粒以反式方式提供。恢复性质粒上目标基因的突变可揭示目标蛋白功能特性方面的信息，这些突变会导致携带突变基因的供体细胞接合效率发生改变。接合效率的变化有助于理解特定转移蛋白或其某个区域在促进接合性DNA转移过程中的作用和重要性。将该接合实验与详细的三维结构研究相结合，将全面揭示接合转移蛋白的功能，并为鉴定和表征蛋白质-蛋白质相互作用区域提供有效手段。
引言
在微生物层面，基因和蛋白质的转移在细菌的生存与进化以及感染过程中起着核心作用。细菌之间或细菌与细胞之间的DNA交换可以通过转化、接合或载体转导来实现1,2。与转化和转导相比，接合具有独特性，因为在大肠杆菌（Escherichia coli）等革兰氏阴性菌的接合过程中，DNA的转移是以供体细胞为主导的方式进行的，通过一个复杂的多分子系统将供体细胞与受体细胞连接起来。接合也是细菌细胞与宿主细胞相互作用并将基因、蛋白质或化学物质注入宿主系统的最直接途径3。此类物质的转移往往对宿主产生显著影响，从致病性和致癌性到宿主的进化与适应均可能受到影响。已有研究表明，在环境胁迫条件下，对于高突变率的细菌而言，接合重组可使其适应速率提高3倍4。此外，接合是目前细菌菌株中抗生素抗性基因传播最主要的途径5,6。
微生物进化出了特化的分泌系统，以支持大分子物质穿过细胞膜的转运；目前在革兰氏阴性细菌中已描述了9种类型的分泌系统（TSSs）：T1SS、T2SS、T3SS、T4SS、T5SS、T6SS、T7SS，以及Sec（分泌）途径和Tat（双精氨酸转运）途径。7,8 每种类型的分泌系统进一步分为不同的亚型，这是由于不同菌株中相关蛋白的多样性和通路的独特性所决定的。例如，在IV型分泌系统（T4SS）中，Ti系统和Cag系统介导效应分子的转运，而F质粒、R27和pKM101的T4S....
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方案
1. DNA 重组质粒的构建
- 设计用于目标基因同源重组的寡核苷酸
- 设计一条长度为55-72 bp的单链正向寡核苷酸，具体如下：（a）选择一段19-32 bp长的核苷酸序列，该序列与商用pBAD33质粒中氯霉素乙酰转移酶基因5'起始位点上游10-100 bp区域内的DNA序列同源，32 并且（b）选择一段长度为36-54 bp、与目标基因5'起始位点下游10-150 bp区域同源的核苷酸序列 感兴趣.
- 将步骤 (b) 中选定的核苷酸序列的 3' 端与步骤 (a) 中选定的核苷酸序列的 5' 端连接，从而得到一条长度为 55-72 的单链正向寡核苷酸。
- 设计一条长度为55-72 bp的单条反向寡核苷酸引物，具体如下：（a）选择一段19-32 bp长的核苷酸序列，该序列与商用pBAD33质粒中氯霉素抗性基因3'端下游10-100 bp区域内的DNA序列同源；（b）选择一段36-54 bp长的核苷酸序列，该序列与目标基因3'端位点上游10-150 bp区域内的序列同源。
- 将步骤 (b) 中选定的核苷酸序列的 3' 端与步骤 (a) 中选定的核苷酸序列的 5' 端连接，形成一条单一的寡核苷酸。
- 将该寡核苷酸序列复制到任意可用的生物信息学软件中，并将其序列转换为反向互补序列....
- 设计一条长度为55-72 bp的单链正向寡核苷酸，具体如下：（a）选择一段19-32 bp长的核苷酸序列，该序列与商用pBAD33质粒中氯霉素乙酰转移酶基因5'起始位点上游10-100 bp区域内的DNA序列同源，32 并且（b）选择一段长度为36-54 bp、与目标基因5'起始位点下游10-150 bp区域同源的核苷酸序列 感兴趣.
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结果
F质粒驱动的细菌接合过程是一个协调过程，涉及接合转移蛋白 tra F质粒中负责组装IV型分泌系统（T4SS）以促进菌毛合成和接合DNA转移的区域。接合F菌毛的形成需要TraF蛋白（GenBank登录号# BAA97961；UniProt ID P14497）。10,14,35-37 该蛋白含有一个C端硫氧还蛋白样结构域，但缺乏催化活性的CXXC基序。35,38 尽管已预测其通过N端结构域与TraH蛋白相互作用，39 一个被证明比其C末端结构域更动态的区域，37 关于该蛋白的结构特征，目前所知甚少。为了在结构研究的基础上评估 TraF 蛋白的功能特性，我们首先敲除了 traF 通过同源重组将基因插入pOX38-Tc，生成pOX38-Tc ΔtraF::Cm 质粒 (表1) 在 E. coli DY330R 细胞33,34
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讨论
细菌接合过程为细菌传播基因提供了途径，使其在恶劣环境中生长时获得进化优势，例如抗生素抗性标记的传播。由于许多接合质粒体积庞大12，通过突变接合质粒本身上的靶基因来研究参与转移装置组装的蛋白质功能，操作上十分不便。本文详述的实验方案提供了一种更便捷的方法，可通过使用更小、更易操作的表达质粒来评估目标基因（图1）。我们采用F质粒衍生物pOX38-Tc（表1）来研究F质粒介导的接合；其他接合质粒也可利用本文所述方案及相应的衍生质粒进行研究。所概述的接合实验方法源自Frost及其同事42，并进行了部分修改。在以往的研究中8,33,42，pOX38-Tc Δ基因::Cm构建体的制备是通过使用适当的限制性内切酶切割目标基因，并将扩增的CAT盒插入pOX38-Tc中实现的42。在当前方法中，我们利用重组工程菌株E. coli DY330R33,34中的同源重组技术，敲除目标基因并用CAT盒替代。该方法的优势在于，所获得的携带pOX38-Tc Δ基因::Cm构.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
本研究得到了自然科学与工程研究理事会发现基金的资助 & 加拿大工程委员会（NSERC）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GeneJet 质粒小提试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | K0503 | |
| GeneJet 凝胶回收试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | K0692 | |
| GeneJet PCR 纯化试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | K0702 | |
| Q5 定点突变试剂盒 | 新英格兰生物实验室 | E0554S | |
| 宽范围 DNA Marker | 新英格兰生物实验室 | N0303A | |
| 培养皿 | 赛默飞世尔科技 | FB0875713 | |
| 电穿孔仪 | Eppendorf | 4309000027 | |
| 电穿孔比色皿 | 赛默飞世尔科技 | FB101 | 比色皿间隙为 1 mm。 |
| 酶 | |||
| AvaI | 新英格兰生物实验室 | R0152S | |
| EcoRI | 新英格兰生物实验室 | R0101S | |
| HindIII | 新英格兰生物实验室 | R0104L | |
| NdeI | 新英格兰生物实验室 | R0111S | |
| Phusion DNA 聚合酶 | 新英格兰生物实验室 | M0530L | |
| T4 DNA 连接酶 | 新英格兰生物实验室 | M0202S | |
| DpnI | 新英格兰生物实验室 | R0176S | |
| 抗生素 | 终浓度 | ||
| 氯霉素（Cm） | 赛默飞世尔科技 | BP904-100 | 20 µg/mL |
| 卡那霉素（Km） | BioBasic 公司 | DB0286 | 50 µg/mL |
| 萘啶酸（Nal） | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| 利福平（Rif） | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| 四环素（Tc） | 赛默飞世尔科技 | BP912-100 | 10 µg/mL |
| 链霉素（Sm） | 赛默飞世尔科技 | BP910-50 | 50 µg/mL |
参考文献
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4
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重印与许可
