用于细菌接合转移蛋白序列特异性分析的接合交配实验

摘要

本文介绍了一种敲除参与质粒接合的靶基因并利用接合实验分析其缺失影响的实验方案。通过缺失突变或点突变，进一步将该基因的功能定位至其序列的特定区域。

摘要

通过细菌接合转移遗传物质是一种通过特定转移蛋白形成的复合物介导的过程。在大肠杆菌（Escherichia coli）中，这些转移蛋白构成了一种被称为接合对形成或DNA转移复合物的DNA转移装置，可促进接合性质粒的转移。本文的目的是提供一种方法，通过一系列缺失突变和/或点突变结合接合实验，来确定特定接合转移蛋白的功能。目标基因首先在接合性质粒上被敲除，然后通过携带该目标基因的小型恢复性质粒以反式方式提供。恢复性质粒上目标基因的突变可揭示目标蛋白功能特性方面的信息，这些突变会导致携带突变基因的供体细胞接合效率发生改变。接合效率的变化有助于理解特定转移蛋白或其某个区域在促进接合性DNA转移过程中的作用和重要性。将该接合实验与详细的三维结构研究相结合，将全面揭示接合转移蛋白的功能，并为鉴定和表征蛋白质-蛋白质相互作用区域提供有效手段。

引言

在微生物层面，基因和蛋白质的转移在细菌的生存与进化以及感染过程中起着核心作用。细菌之间或细菌与细胞之间的DNA交换可以通过转化、接合或载体转导来实现^1,2。与转化和转导相比，接合具有独特性，因为在大肠杆菌（Escherichia coli）等革兰氏阴性菌的接合过程中，DNA的转移是以供体细胞为主导的方式进行的，通过一个复杂的多分子系统将供体细胞与受体细胞连接起来。接合也是细菌细胞与宿主细胞相互作用并将基因、蛋白质或化学物质注入宿主系统的最直接途径³。此类物质的转移往往对宿主产生显著影响，从致病性和致癌性到宿主的进化与适应均可能受到影响。已有研究表明，在环境胁迫条件下，对于高突变率的细菌而言，接合重组可使其适应速率提高3倍⁴。此外，接合是目前细菌菌株中抗生素抗性基因传播最主要的途径^5,6。

微生物进化出了特化的分泌系统，以支持大分子物质穿过细胞膜的转运；目前在革兰氏阴性细菌中已描述了9种类型的分泌系统（TSSs）：T1SS、T2SS、T3SS、T4SS、T5SS、T6SS、T7SS，以及Sec（分泌）途径和Tat（双精氨酸转运）途径。^7,8 每种类型的分泌系统进一步分为不同的亚型，这是由于不同菌株中相关蛋白的多样性和通路的独特性所决定的。例如，在IV型分泌系统（T4SS）中，Ti系统和Cag系统介导效应分子的转运，而F质粒、R27和pKM101的T4SS则介导接合质粒的转移。^7,9,10 深入理解生物体如何将其分泌系统的组分蛋白组装成功能结构，并将细胞内容物传递给受体或周围环境的机制，是开发靶向策略以对抗致病性微生物及细胞感染过程的重要因素。

在首次鉴定出细菌接合现象后 E. coli 由 Lederberg & 塔图姆，¹¹ 已鉴定并表征了大量可移动和接合型质粒。¹² 这类可移动质粒的大小范围较大（从1到超过200千碱基对（kb）），但所有可移动质粒均含有松弛酶（relaxase），该酶可识别转移起始位点（oriT），从而介导质粒的转移。接合型质粒还编码合成功能性IV型分泌系统（T4SS）所需的基因以及一种IV型偶联蛋白。¹² 例如，100 kb 的 F 质粒 E. coli 在一个33.3 kB的转移（tra）区段内编码了所有的接合基因。¹³ 基因在 tra F质粒的该区域编码所有促进菌毛形成、接合对形成（Mpf）、DNA转移以及在接合质粒转移过程中发挥排斥功能的蛋白质。^10,14,15 目前对结合型T4SS已有大量研究积累，但针对结合蛋白及其复合物的详细结构研究直到近期才逐渐取得进展。^16-28

为了全面理解接合过程，需要将接合转移蛋白的详细结构研究与其突变分析相结合。这可通过接合交配实验实现。对于F质粒，其内部编码的每种蛋白 tra 该区域在F介导的接合中发挥作用；因此，转移基因的敲除或缺失将消除细胞的接合能力（图1尽管较小的移动性质粒更适用于标准的缺失操作，但对于F质粒等较大的接合性质粒而言，通过同源重组将目标基因替换为具有特定抗生素抗性的基因，能更高效地实现基因敲除。在本实验方案中，我们采用同源重组方法，将55 kb的F质粒衍生物pOX38-Tc中的一个目标转移基因替换为氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因。^29,30 所得的敲除质粒 pOX38-Tc Δgene::Cm 可使细菌在含有氯霉素（Cm）的培养基中具有抗性。携带 pOX38-Tc Δgene::Cm 的供体细胞无法进行接合 DNA 转移/接合交配，这一点通过接合实验已得到证实；pOX38-Tc Δgene::Cm 供体细胞与正常受体细胞之间的接合效率会降低，更常见的是完全丧失。pOX38-Tc Δgene::Cm 质粒的接合转移能力可通过携带目标转移基因的小型恢复质粒得以恢复。该恢复质粒可为提供组成型表达的质粒，例如质粒 pK184（pK184-gene）³¹ 或提供可诱导表达的质粒，只要该质粒能将基因正确靶向细胞内的特定位置（细胞质或周质空间）。因此，在这种新型供体菌（含有 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gene 质粒）的接合实验中 以及受体细胞的交配效率应恢复至接近正常的供体-受体交配实验水平。该系统可通过构建一系列pK184-gene载体（包括缺失突变或点突变），并逐一检测各载体恢复携带pOX38-Tc Δgene::Cm的供体细胞交配能力的效果，从而探究被敲除基因的功能。

方案

1. DNA 重组质粒的构建

1. 设计用于目标基因同源重组的寡核苷酸
   1. 设计一条长度为55-72 bp的单链正向寡核苷酸，具体如下：（a）选择一段19-32 bp长的核苷酸序列，该序列与商用pBAD33质粒中氯霉素乙酰转移酶基因5'起始位点上游10-100 bp区域内的DNA序列同源，³² 并且（b）选择一段长度为36-54 bp、与目标基因5'起始位点下游10-150 bp区域同源的核苷酸序列 感兴趣.
      1. 将步骤 (b) 中选定的核苷酸序列的 3' 端与步骤 (a) 中选定的核苷酸序列的 5' 端连接，从而得到一条长度为 55-72 的单链正向寡核苷酸。
   2. 设计一条长度为55-72 bp的单条反向寡核苷酸引物，具体如下：（a）选择一段19-32 bp长的核苷酸序列，该序列与商用pBAD33质粒中氯霉素抗性基因3'端下游10-100 bp区域内的DNA序列同源；（b）选择一段36-54 bp长的核苷酸序列，该序列与目标基因3'端位点上游10-150 bp区域内的序列同源。
      1. 将步骤 (b) 中选定的核苷酸序列的 3' 端与步骤 (a) 中选定的核苷酸序列的 5' 端连接，形成一条单一的寡核苷酸。
      2. 将该寡核苷酸序列复制到任意可用的生物信息学软件中，并将其序列转换为反向互补序列。这将得到一条长度为55-72 bp的反向寡核苷酸。
   3. 使用任意可用的寡核苷酸分析程序，检查重组寡核苷酸的GC含量是否在40%-60%之间，发夹结构的熔解温度（Tm）较低，_m），低自体及异源二聚化 T_m向任何首选的生物技术公司订购引物合成与运输。
2. 从 pBAD33（Cm）中扩增 CAT 盒式结构^R使用为同源配对设计的寡核苷酸进行质粒构建
   1. 在含有20 μg/mL氯霉素（Cm）的无菌LB培养基中，于37 °C、200 rpm振荡条件下培养携带pBAD33质粒的DH5α细胞过夜（O/N，16–18 h）。
   2. 在室温下，以 5,000 × g 离心 6–8 mL 过夜培养物 3 分钟。弃去上清液，使用质粒小提试剂盒从沉淀中提取 pBAD33 质粒材料表）及制造商提供的说明书。
   3. 用以下顺序向无菌离心管中加入相应体积的双蒸水（ddH₂O）、限制性内切酶缓冲液、pBAD33质粒DNA和适当的限制性内切酶，对pBAD33质粒DNA进行酶切消化。₂将反应体系补至终体积50 μL，包含1 μL pBAD33质粒（1 μg）、5 μL 10×酶反应缓冲液和0.5 μL AvaI限制性内切酶（RE）。用移液器轻轻混匀，37 °C孵育1 h。80 °C加热20 min以终止反应。样品置于-20 °C保存，保存时间不超过24 h，以尽量减少黏性末端降解。
   4. 在250 mL锥形瓶中，将1.2 g琼脂糖与100 mL 1×TAE缓冲液（40 mM Tris，pH 8.5；20 mM乙酸；1 mM EDTA）混合，配制1.2%琼脂糖分离胶。在微波炉中加热并旋转锥形瓶，使琼脂糖完全溶解。当液体开始沸腾时立即停止加热，并旋转锥形瓶。
      1. 将液态琼脂糖在室温下轻轻旋转冷却 3 分钟，加入 2 μL 的 10 mg/mL 溴化乙锭溶液，再轻轻旋转混匀。将琼脂糖倒入带有加样孔梳子的胶板中，在室温下静置 1 小时使其凝固。将凝胶置于 1x TAE 缓冲液中，于 4 °C 保存，最多可保存 2 天。
   5. 将1.2.3步骤中获得的每种限制性内切酶（RE）消化产物与0.2倍体积的DNA上样染料混合（每50 μL反应体系加入10 μL染料），用移液器混匀。在琼脂糖凝胶的第一个加样孔中加入5 μL浓度为500 µg/mL的DNA分子量标记，在另一孔中加入全部RE消化-染料混合物。使用2–3个加样孔将整个反应体积加样至凝胶中。
      1. 将凝胶置于凝胶电泳装置中，用1x TAE缓冲液刚好浸没凝胶，以45–50 V（4.5–5 V/cm）电压电泳65分钟。
   6. 使用紫外灯箱和无菌剃刀，迅速从凝胶中切下对应于 CAT 序列的 2.8 kb 条带，以尽量减少 DNA 的紫外暴露。使用凝胶回收试剂盒从切下的凝胶片段中提取 DNA（材料表按照制造商的说明书进行操作。
      注意：避免皮肤直接暴露于紫外线下，并小心操作剃刀。
   7. 使用1.1中设计的含有与基因序列同源的突出端的引物，对从1.2.6中提取的CAT表达盒通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，以实现同源重组。PCR反应按照试剂生产商的说明书在冰上配制。材料表）按以下顺序：
      1. 向一支无菌的PCR管中加入适量的ddH₂O₂加水至终体积为 50 μL，随后加入 10 μL PCR 缓冲液、1 μL 10 mM dNTPs、2.5 μL 10 μM 正向引物、2.5 μL 10 μM 反向引物、1.2.6 步骤中获得的 1–25 ng 模板 DNA 以及 0.5 μL 100 单位/μL DNA 聚合酶。
      2. 设置一个阴性对照，其组分与1.2.7.1相同，但不加模板DNA，使用适量的ddH₂O替代。₂使用不含模板DNA的O作为阴性对照。设置阳性对照时，使用已知在PCR反应中有效的模板DNA和引物，例如制造商提供的阳性对照引物。
      3. 用移液器轻轻混合所有反应组分。
      4. 使用以下程序进行PCR扩增：98 °C预变性30秒，随后进行30个循环，每个循环包括98 °C变性10秒，引物退火20秒，72 °C延伸（每千碱基产物延伸20秒），最后72 °C终延伸10分钟。扩增完成后，将样品置于-20 °C保存。
   8. 通过琼脂糖凝胶电泳（参见1.2.4-1.2.5）使用各反应体系中的5 μL进行扩增产物大小验证。使用PCR纯化试剂盒并按照生产商说明书纯化PCR扩增子。将纯化的DNA于-20 ºC保存。
3. pK184-基因回收质粒
   1. 设计一条从5'端到3'端的正向引物，顺序如下：（a）在前端添加4个随机核苷酸（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶的任意组合），以提高切割效率；（b）连接EcoRI限制性内切酶（RE）的识别切割位点序列（GAATTC）；（c）随后是一段21–25 bp长、与目的基因5'端同源的核苷酸序列，包含起始密码子。若目标基因内部含有EcoRI酶切位点，则应从pK184载体的多克隆位点中选择其他合适的限制性内切酶。
   2. 设计反向引物的顺序如下：（a）选择4个随机核苷酸以提高切割效率，随后（b）添加HindIII酶切位点序列（AAGCTT），接着（c）添加目的基因3'端包含终止密码子的21-25 bp长的反向互补序列。若目标基因中含有HindIII位点，则选择pK184多克隆位点中的其他限制性内切酶。
   3. 对于编码周质蛋白的基因，在正向引物的限制性酶切位点和起始密码子之间添加一段额外的信号肽序列。
   4. 使用任意可用的寡核苷酸分析工具，检查引物的GC含量是否在40%-60%之间，发夹结构Tm值较低_m，低自体及异源二聚化 T_m订购引物进行合成。
   5. 在含有10 μg/mL四环素（Tc）的无菌LB培养基中，于32 ºC、200 rpm条件下振荡培养DY330R pOX38-Tc细胞过夜（O/N）。取6–8 mL过夜培养物，在室温下以5,000 × g离心3分钟。弃去上清液，使用质粒小提试剂盒从沉淀中提取质粒DNA材料表）及制造商提供的说明书。
   6. 使用pOX38-Tc作为模板，通过1.3.1-1.3.5中的引物扩增目标基因的全长序列（参见1.2.7.1-1.2.7.3）。
   7. 通过琼脂糖凝胶电泳（参见1.2.4-1.2.5）使用各反应体系中的5 μL产物确认扩增片段大小。使用PCR纯化试剂盒并按照生产商说明书纯化扩增的DNA。将纯化后的DNA于-20 °C保存。
   8. 对市售的 pK184 质粒 DNA 和扩增基因（来自 1.3.7 节）进行双酶切消化，在无菌离心管中按以下顺序依次加入：适量体积的 ddH₂O₂补至终体积50 μL，加入1 µg pK184质粒，5 μL 10×酶反应缓冲液，以及EcoRI和HindIII各1 μL。
      1. 用移液器轻轻混匀，37 ºC 反应 1 小时。80 ºC 加热 20 分钟以终止反应。样品于 -20 °C 保存，时间不超过 24 小时，以尽量减少黏性末端降解。
         注意：此处所用限制性内切酶的种类取决于在步骤 1.3.1 和 1.3.2 中设计到引物中的限制性内切酶位点。
      2. 作为阳性对照，除向反应管中仅加入一种限制性内切酶（RE）外，其余按照1.3.8步骤中的相同反应体系分别对pK184质粒进行单酶切。两种限制性内切酶需分别单独进行该反应。
   9. 使用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物分析，参照步骤1.2.4–1.2.5，回收pK184和目的基因的双酶切DNA片段 根据步骤1.2.6中所述的方法获取目标产物。
   10. 将基因片段连接至pK184载体中，按以下顺序将组分加入无菌离心管：2 μL 10x T4 DNA连接酶缓冲液，总共100 ng DNA，其中载体与插入片段比例为1:3（pK184:基因） 比率，ddH₂O₂O 值达到总体积 20 μL，并加入 1 μL T4 DNA 连接酶。作为阴性对照，使用不含插入基因的载体 100 ng 进行类似的反应。
       1. 使用微量移液器轻轻混匀所有反应组分，在 25 °C 下孵育 30 分钟。于 65 °C 加热 10 分钟以终止连接反应，随后置于冰上。
   11. 冰上孵育时，加入15 μL pK184-gene 将1.3.10步骤中的连接反应产物加入到含有100 μL化学感受态DH5α细胞的无菌1.5 mL离心管中。用移液器轻轻混匀，冰上孵育10分钟。阴性对照样品同样处理。对于阳性对照，使用20–100 ng的质粒（如pBAD33），转入50 μL DH5α细胞中。
   12. 将样品直接从冰上转移至42 °C水浴中，孵育90秒。此步骤对细胞施加热激，使其能够摄取质粒DNA。
   13. 将细胞放回冰上静置5分钟，然后加入900 μL无菌LB培养基。在37 °C、125 rpm振荡条件下孵育1小时。
   14. 从1.3.13中的每个连接反应中取100 μL样品，分装至含有50 μg/mL卡那霉素（Km）的琼脂平板上，使用无菌涂布棒涂布细胞。阳性对照平板应含有适当的抗生素。保持操作环境无菌，并在火焰附近操作。将平板倒置于37 °C过夜培养。
   15. 使用无菌移液管或接种环，挑取单个独立的菌落，接种于含有50 μg/mL Km的20 mL无菌LB培养基中。保持操作环境无菌，并在火焰附近操作。于37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养细胞。
   16. 将转化后的DH5α细胞过夜培养物500 μL与500 μL无菌100%甘油（终浓度为50% v/v）在无菌冻存管中混合，制备3-5管甘油菌种。于-80 °C保存。
   17. 同时在室温下以5,000 × g离心6–8 mL过夜培养物3分钟。弃去上清液，利用质粒小提试剂盒从沉淀中提取pK184-基因回收质粒材料表）及制造商提供的说明书。
4. pK184-基因 突变体
   注意：用于缺失、插入和/或点突变的引物可利用生产商提供的在线工具轻松设计。
   1. 设计每个正向引物时，选择一段18-32 bp长且与目的基因5'端同源的核苷酸序列，包含起始密码子。设计引物时应使每个正向引物与前一个引物下游30-180 bp处退火，从而获得缺失适当长度N端肽段的缺失突变体。
   2. 设计一条反向引物，选择一段长度为18-32 bp且与目的基因3'端（包含终止密码子）同源的核苷酸序列。将该引物序列输入任意可用的生物信息学软件，将其转换为反向互补序列，此即为反向引物。
      1. 对于编码周质蛋白的基因，设计反向引物时应使其与位于基因5'端、负责蛋白质产物在周质中正确定位的信号序列3'端互为反向互补。
   3. 使用任意可用的寡核苷酸分析程序，检查缺失引物的GC含量是否在40%–60%之间，发夹结构的熔解温度（Tm）较低（T_m），低自体及异源二聚化 T_m订购引物，并从任意可选的生物技术公司获取合成与运输服务。
   4. 使用在方案1.3中获得的pK184-gene质粒作为模板，并依据步骤1.2.7–1.2.8中的指导，用步骤1.4.1–1.4.3中设计的引物进行PCR扩增，以生成pK184-gene缺失构建体_ΔX 扩增子。将扩增后的DNA在-20 °C保存。
   5. 使用任何可用的定点突变试剂盒连接扩增后的构建体（材料表).
   6. 将pK184-基因分别转化_ΔX 使用标准热激法将连接产物分别转化至化学感受态DH5α细胞中（参见1.3.11-1.3.13）。
   7. 将1.4.12中每个连接反应的100 μL样品分别移取到含有50 μg/mL Km的琼脂平板上，用无菌涂布棒涂布均匀。保持操作环境无菌，并在火焰附近操作。将平板倒置于37 °C过夜培养。
   8. 使用无菌移液管或接种环，挑取单个独立的菌落，接种于含有 50 μg/mL Km 的 20 mL 无菌 LB 培养基中。保持操作环境无菌，并在火焰附近操作。将菌液于 37 °C、200 rpm 振荡培养过夜（O/N）。
   9. 将转化后的DH5α细胞的500 μL过夜培养物与500 μL无菌100%甘油（终浓度为50% v/v）混合，分装至无菌冻存管中，制备3–5份甘油菌保存液。于-80 °C保存。
   10. 在室温下，以 5,000 × g 离心 6–8 mL 过夜培养物 3 分钟。弃去上清液，提取 pK184 基因_ΔX 使用质粒小提试剂盒从沉淀中提取质粒构建物（材料表）并遵循制造商的说明书。将DNA在-20 °C保存。

2. pOX38-Tc Δgene::Cm 菌株的构建

1. DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm 基因敲除
   1. 在含有10 µg/mL Tc的10 mL无菌LB培养基中制备DY330R pOX38-Tc细胞的过夜培养物。于32 °C、200 rpm条件下过夜培养。
   2. 将过夜培养物按1:70比例稀释至20 mL新鲜无菌LB培养基中。在32 °C下培养细胞至对数中期（OD_{600 nm} 0.4–0.6）生长。
   3. 将10 mL培养物转移至无菌烧瓶中，在摇动水浴中于42 °C、150 rpm条件下孵育15分钟。此步骤将诱导DY330R中重组特异性蛋白的表达。
   4. 将菌液置于冰水浴中冷却10分钟。按如下步骤制备电转感受态细胞。
      1. 将预冷的细胞转移至预冷的锥形管中，在4 ºC条件下以4,000 x g离心7分钟。后续步骤中使用的所有试管和移液器均应置于4 °C或冰上预冷。
      2. 去除上清液，将细胞在1 mL预冷的ddH₂O中轻轻重悬₂O. 加入另外30 mL冰冻ddH₂O₂O.
      3. 离心细胞（4,000 × g，7 分钟，4 °C），弃上清液，并将细胞轻轻重悬于 1 mL 冰冷的 ddH₂O 中₂O.
      4. 将重悬的细胞转移至预冷的1.5 mL离心管中，在4 ºC、15,000 x g条件下离心1分钟。
      5. 轻轻将沉淀重悬于200 µL预冷的ddH₂O中₂O，并分装为50 µL体积。电转感受态细胞可保存于-80 °C
   5. 将1.2中扩增的300 ng CAT片段加入50 μL冰上混合的电转感受态DY330R pOX38-Tc细胞中，轻轻吹打混匀。使用未修饰的pBAD33质粒作为阳性对照重复此步骤。
   6. 将细胞转移至预冷的（-20 °C）1 mm 电穿孔杯中。使用电穿孔仪在 1.8 kV 条件下进行电穿孔，时间常数为 5.5 ms。脉冲结束后立即加入 1 mL SOC 培养基稀释细胞，并转移至新的微量离心管中。在 32 °C 下孵育细胞 2 小时。
   7. 将每份样品各取 100 μL 加入含有 10 μg/mL Tc 和 20 μg/mL Cm 的琼脂平板上，使用无菌涂布棒涂布均匀。保持操作环境无菌，并在火焰附近操作。将平板倒置于 32 °C 过夜培养，以筛选成功重组的克隆。导入细胞的 CAT 盒将与目标基因发生同源重组，从而构建 DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm (Rif^R,^TcR，Cm^R) 克隆。
      注意：除在制备电转感受态细胞前的第2.1.3步中于42 °C诱导15分钟外，DY330R细胞的培养必须在32 °C进行，因为长时间在较高温度下培养可能导致细胞死亡，原因是会表达产生有毒产物 p_L 负责DY330R中重组功能的操纵子^33,34
   8. 用无菌移液管或接种环挑取单个独立的 DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm 菌落，接种于 20 mL 含 10 μg/mL Tc 和 20 μg/mL Cm 的无菌 LB 培养基中，制备过夜培养物。操作过程保持无菌，靠近火焰进行。将菌液于 32 °C、200 rpm 振荡培养过夜。
   9. 从过夜培养物中制备3-5管甘油菌种，方法是将500 μL过夜培养物与500 μL无菌100%甘油（终浓度为50% v/v）在无菌冻存管中混合。于-80 °C保存。
   10. 在室温下，以 5,000 × g 离心 6–8 mL 过夜培养物 3 分钟。弃去上清液，提取 pOX38-Tc Δgene::Cm 使用质粒小提试剂盒从沉淀中构建质粒材料表）并按照制造商说明书操作；将纯化的DNA于-20 °C保存。
   11. 使用XK1200细胞作为受体进行接合交配实验，按照方案3.1确认基因敲除对接合作用的阻断效果。
2. DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gene
   1. 通过电穿孔法将300 ng pK184-gene质粒转化至电感受态DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm细胞中，具体操作参照步骤2.1.4–2.1.7。所有选择性培养基均需添加20 μg/mL Cm和50 μg/mL Km。于32 °C培养。电转化后的细胞中，回复质粒将恢复DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm细胞中被敲除基因的功能。
   2. 用无菌移液管或接种环挑取 DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gene 重组菌的单个独立菌落，接种于 20 mL 含 20 μg/mL Cm 和 50 μg/mL Km 的无菌 LB 培养基中，制备过夜培养物。操作过程须保持无菌，建议在火焰附近进行。将菌液置于 32 °C、200 rpm 摇床中过夜培养。
   3. 从过夜培养物中制备3-5份甘油菌种：取500 μL过夜培养物与500 μL无菌100%甘油混合（终浓度为50% v/v），置于无菌冻存管中，于-80 °C保存。
   4. 同时执行方案 3.1，以生成 XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm 重组细胞.
3. XK1200 pOX38-Tc Δ基因::Cm + pK184-基因 及突变体
   1. 制备电转感受态XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm细胞（来自步骤2.2.4）。
   2. 分别将300 ng的pK184-gene或pK184-gene突变型质粒按照步骤2.1.4–2.1.7电转化至50 μL电感受态XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm细胞中。所有选择性培养基应含有10 μg/mL萘啶酸（Nal）、20 μg/mL Cm和50 μg/mL Km，并在37 °C培养。
   3. 用无菌移液管或接种环挑取 XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm+ pK184-gene 重组菌的单个独立菌落，接种于含 20 μg/mL 氯霉素（Cm）、50 μg/mL 卡那霉素（Km）和萘啶酮酸（Nal）的 20 mL 无菌 LB 培养基中，制备过夜培养物。操作过程保持无菌环境，并在火焰附近进行。将菌液于 37 °C、200 rpm 振荡培养过夜。
   4. 从过夜培养物中制备3-5份甘油菌种，取500 μL过夜培养物与500 μL无菌100%甘油（终浓度为50% v/v）混合于无菌冻存管中，混匀后于-80 °C保存。

3. 接合交配实验

1. 通过接合杂交生成 XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm 细胞
   1. 使用无菌移液管或接种环，将甘油菌种或琼脂平板上的单菌落接种于20 mL含20 μg/mL Cm和50 μg/mL Km的无菌LB培养基中，制备20 mL无菌LB过夜培养物DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gene。在32 °C、200 rpm振荡条件下培养。同时，将XK1200细胞接种于20 mL含10 μg/mL Nal的无菌LB培养基中，于37 °C振荡培养。
   2. 分别将每种培养物在含有相同抗生素的2 mL无菌LB培养基中按1:70稀释；向所有供体细胞中加入葡萄糖，使其终浓度为100 mM。将细胞培养至对数中期（OD₆₀₀ 37 °C、200 rpm 振荡培养至 OD 值为 0.5–0.7。
   3. 离心（4,000 × g，4 °C，5 min）收集细胞，弃上清，用冷的无菌LB培养基洗涤一次以去除抗生素，然后将细胞重悬于2 mL冷的无菌LB培养基中。
   4. 将每种培养物各100 μL加入800 μL无菌LB培养基中，于32 °C静置孵育1小时，使其接合。
   5. 涡旋振荡细胞30秒以破坏交配对，并置于冰上10分钟，以防止进一步交配。
   6. 将100 μL细胞混合物分装至含有10 μg/mL Nal和20 μg/mL Cm的琼脂平板上，用于筛选XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm细胞。使用无菌涂布棒均匀涂布细胞。保持操作环境无菌，并在火焰附近操作。将平板倒置于37 °C过夜培养。
   7. 挑取单个新菌落XK1200 pOX38-Tc Δ基因::Cm 使用无菌移液管或接种环挑取敲除菌株，在含有20 μg/mL 氯霉素的无菌LB培养基中过夜培养 37 °C、200 rpm 振荡培养。取过夜培养物（O/N）制备3-5管甘油冻存菌种：将500 μL过夜培养物与500 μL无菌100%甘油（终浓度50% v/v）混合，加入无菌冻存管中。于-80 °C保存。
      注意：所得细胞现在可用于与pK184-基因构建体（方案1.3和1.4）进行转化，以评估该基因及其突变体在方案3.2中恢复接合转移能力的作用。
2. XK1200供体与MC4100受体间的接合交配实验
   1. 制备含有 pOX38-Tc Δgene::Cm 和 pK184-gene 质粒的 XK1200 菌株的过夜培养物 在20 mL含20 μg/mL氯霉素（Cm）、50 μg/mL卡那霉素（Km）的无菌LB培养基中培养菌株，同时在5 mL含50 μg/mL链霉素（Sm）的LB培养基中培养MC4100菌株，接种物来自甘油保存菌种或琼脂平板上的单菌落，使用无菌移液管或接种环。将培养物置于 37 °C，200 rpm 振荡培养。
   2. 分别取每种过夜培养物，用含相同抗生素的2 mL无菌LB培养基制成1:70稀释液。向所有供体细胞中加入葡萄糖，使其终浓度为100 mM。将细胞培养至对数中期（OD₆₀₀ 37 °C、200 rpm 摇床培养至 OD600 为 0.5–0.7。
   3. 离心（4,000 × g，4 °C，5 min）收集细胞，弃上清，用冷的无菌LB培养基洗涤一次以去除抗生素，然后将细胞重悬于2 mL冷的无菌LB培养基中。
   4. 将每种培养物各100 μL分装至800 μL无菌LB培养基中，设两个重复，于37 °C静置孵育1 h，使其接合。
   5. 涡旋振荡细胞30秒以破坏交配对，并置于冰上10分钟，以防止进一步交配。
   6. 使用步骤 3.2.2 中的对数中期培养物和新鲜无菌 LB 培养基，将供体和受体细胞分别进行 6 次连续稀释，稀释比例从 10 开始^-2 至 10^-7.
   7. 在含有 10 μg/mL Nal、20 μg/mL Cm 和 50 μg/mL Km 的琼脂平板的两个半区上，分别点样 10 μL 各稀释度的 XK1200 供体细胞，如图所示 图2对含有 50 μg/mL Sm 的琼脂平板上受体 MC4100 细胞的各稀释液进行同样操作。37 °C 过夜培养。
   8. 使用步骤 3.2.5 中的涡旋混合液和新鲜无菌 LB，制备 6 个稀释度（10⁻¹ 至 10⁻⁶）^-2 至 10^-7) 接合子。通过将每个稀释液的 10 μL 等分试样点样于含有 50 μg/mL Sm 和 20 μg/mL Cm 的琼脂平板的每一半，筛选 MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm 接合子细胞，如 图2对两份重复混合物进行相同操作。保持无菌环境，并在火焰附近操作。将平板于37 °C过夜培养。
   9. 按照方案3.3中所述，测定每种构建体的交配效率。
   10. 对所有回收质粒重复此方案，以评估特定突变对接合效率的影响。
3. 交配效率的计算
   1. 统计各供体、受体及接合子细胞在相应平板上相同稀释度点样的菌落数量。
   2. 计数受体菌落，以检测在该稀释度下由于接合子数量多于受体菌而可能产生的偏差。
   3. 将接合子菌落数除以供体菌菌落数，计算交配效率。再乘以100，得到每100个供体细胞的效率值。

结果

F质粒驱动的细菌接合过程是一个协调过程，涉及接合转移蛋白在 tra F质粒中负责组装IV型分泌系统（T4SS）以促进菌毛合成和接合DNA转移的区域。接合F菌毛的形成需要TraF蛋白（GenBank登录号# BAA97961；UniProt ID P14497）。^10,14,35-37 该蛋白含有一个C端硫氧还蛋白样结构域，但缺乏催化作用的CXXC基序。^35,38 尽管已预测其可通过N端结构域与TraH蛋白相互作用，³⁹ 一个被证明比其C端结构域更具有动态性的区域，³⁷ 关于该蛋白质的结构特征，目前所知甚少。为了结合结构研究评估 TraF 蛋白的功能特性，我们首先敲除了 traF 通过同源重组将基因插入pOX38-Tc，生成pOX38-Tc ΔtraF::Cm 质粒 (表1) 在 E. coli DY330R 细胞^33,...

讨论

细菌接合过程为细菌传播基因提供了途径，使其在恶劣环境中生长时获得进化优势，例如抗生素抗性标记的传播。由于许多接合质粒体积庞大¹²，通过突变接合质粒本身上的靶基因来研究参与转移装置组装的蛋白质功能，操作上十分不便。本文详述的实验方案提供了一种更便捷的方法，可通过使用更小、更易操作的表达质粒来评估目标基因（图1）。我们采用F质粒衍生物pOX38-Tc（表1）来研究F质粒介导的接合；其他接合质粒也可利用本文所述方案及相应的衍生质粒进行研究。所概述的接合实验方法源自Frost及其同事⁴²，并进行了部分修改。在以往的研究中^8,33,42，pOX38-Tc Δ基因::Cm构建体的制备是通过使用适当的限制性内切酶切割目标基因，并将扩增的CAT盒插入pOX38-Tc中实现的⁴²。在当前方法中，我们利用重组工程菌株E. coli DY330R^33,34中的同源重组技术，敲除目标基因并用CAT盒替代。该方法的优势在于，所获得的携带pOX38-Tc Δ基因::Cm构...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GeneJet 质粒小提试剂盒	赛默飞世尔科技	K0503
GeneJet 凝胶回收试剂盒	赛默飞世尔科技	K0692
GeneJet PCR 纯化试剂盒	赛默飞世尔科技	K0702
Q5 定点突变试剂盒	新英格兰生物实验室	E0554S
宽范围 DNA Marker	新英格兰生物实验室	N0303A
培养皿	赛默飞世尔科技	FB0875713
电穿孔仪	Eppendorf	4309000027
电穿孔比色皿	赛默飞世尔科技	FB101	比色皿间隙为 1 mm。
酶
AvaI	新英格兰生物实验室	R0152S
EcoRI	新英格兰生物实验室	R0101S
HindIII	新英格兰生物实验室	R0104L
NdeI	新英格兰生物实验室	R0111S
Phusion DNA 聚合酶	新英格兰生物实验室	M0530L
T4 DNA 连接酶	新英格兰生物实验室	M0202S
DpnI	新英格兰生物实验室	R0176S
抗生素			终浓度
氯霉素（Cm）	赛默飞世尔科技	BP904-100	20 µg/mL
卡那霉素（Km）	BioBasic 公司	DB0286	50 µg/mL
萘啶酸（Nal）	Sigma-Aldrich	N8878-25G	10 µg/mL
利福平（Rif）	Calbiochem	557303	20 µg/mL
四环素（Tc）	赛默飞世尔科技	BP912-100	10 µg/mL
链霉素（Sm）	赛默飞世尔科技	BP910-50	50 µg/mL